燕麥黃酒發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化及對(duì)高級(jí)醇的影響

孫樂平， 張 偉， 徐嘉良, 劉敬科, 邢 旋, 任 清,*

(1.北京工商大學(xué) 輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 北京 100048； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院, 河北 保定 071001；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院 谷子研究所， 河北 石家莊 050035)

黃酒是世界三大古酒之一，源自中國(guó)，是中華民族的瑰寶。黃酒通常以稻米和黍米等谷物為主要原料，利用麥曲等作為糖化發(fā)酵劑，通過蒸煮、加曲、糖化、發(fā)酵、過濾、煎酒、貯存等工藝釀制而成[1-2]。黃酒不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且具有獨(dú)特的風(fēng)味[3]。高級(jí)醇是黃酒中的重要風(fēng)味物質(zhì)，是含3個(gè)以上碳原子醇類的總稱。黃酒中的高級(jí)醇主要為異丁醇、異戊醇、異丙醇、正己醇、β-苯乙醇和正丙醇等[4]。適量的高級(jí)醇賦予黃酒特有的醇香、豐滿圓潤(rùn)和協(xié)調(diào)的口感，但高級(jí)醇的含量過高，會(huì)產(chǎn)生異雜味和較強(qiáng)的致醉性[5]，因此，控制黃酒中的高級(jí)醇含量對(duì)提高黃酒品質(zhì)具有重要意義。

高級(jí)醇是在發(fā)酵過程中由微生物代謝產(chǎn)生，包括氨基酸降解代謝和糖代謝合成兩種途徑[6]。在降解代謝途徑中，蛋白質(zhì)水解生成氨基酸，氨基酸在轉(zhuǎn)氨酶的作用下，將氨基轉(zhuǎn)移給α-酮戊二酸形成谷氨酸和α-酮酸，α-酮酸經(jīng)脫酸、還原后形成比原氨基酸少一個(gè)碳的高級(jí)醇；在合成代謝途徑中，葡萄糖經(jīng)過糖酵解作用和三羧酸循環(huán)產(chǎn)生了α-酮酸中間體，在酮酸脫羧酶和脫氫酶的作用下還原形成相應(yīng)的高級(jí)醇。

目前，黃酒的釀造原料除稻米和黍米外，玉米、高粱、苦蕎等具有高營(yíng)養(yǎng)、低食用性的作物也用來釀造黃酒，以期擴(kuò)大黃酒原料，增加農(nóng)作物附加值。相比其他谷物，燕麥具有更加獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)特性，蛋白質(zhì)含量高，氨基酸組成均衡，富含維生素、蒽酰胺和酚類等抗氧化物質(zhì)[7-8]。已有學(xué)者使用燕麥作為黃酒的釀造原料，研究燕麥黃酒發(fā)酵工藝及燕麥黃酒的抗氧化活性[9-10]，但作為影響黃酒營(yíng)養(yǎng)特性和質(zhì)量特性的高級(jí)醇含量及其與微生物間的代謝關(guān)系少見報(bào)道。本研究旨在檢測(cè)燕麥黃酒發(fā)酵過程中的高級(jí)醇變化和微生物動(dòng)態(tài)，分析高級(jí)醇產(chǎn)生的微生物機(jī)制，為燕麥黃酒品質(zhì)控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

燕麥，壩莜1號(hào)(張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供)；黃酒酒曲，北宗黃酒麥曲。

1.2 儀器與設(shè)備

50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取纖維頭和57330- U型固相微萃取手柄，美國(guó)Supelco公司；2010 PLUS型氣相色譜質(zhì)譜儀，日本島津株式會(huì)社；E.Z.N.A.土壤DNA試劑盒，美國(guó)Omega Bio-Tek, Norcross, GA公司；GeneAmp 9700型PCR儀，美國(guó)ABI 公司；Illumina MiSeq平臺(tái)，美國(guó)Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1燕麥黃酒的釀造

將燕麥淘洗干凈并浸泡24 h，加入3倍去離子水煮熟，加入0.1%糖化酶糖化60 min，隨后加入15%的黃酒酒曲拌勻，裝入黃酒發(fā)酵罐中28 ℃下發(fā)酵10 d。每?jī)商烊右淮?，取約10 g樣品4 000r/min離心10 min，取上清液，用于測(cè)定高級(jí)醇。剩余約30 g樣品轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中用于提取DNA。每個(gè)樣品(記作：OD0、OD2、OD4、OD6、OD8、OD10)取3組平行，共計(jì)測(cè)定18個(gè)樣品(記作：OD0_1至OD0_3，OD2_1至OD2_3,OD4_1至OD4_3，OD6_1至OD6_3，OD8_1至OD8_3，OD10_1至OD10_3)。

1.3.2燕麥黃酒中高級(jí)醇的測(cè)定

通過頂空固相微萃取/氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀(HS-SPME/GC- MS)分析酒樣中的高級(jí)醇種類及含量。取0.5 mL燕麥黃酒發(fā)酵液加入SPME玻璃小瓶頂空瓶中，再加入5.44 mL體積分?jǐn)?shù)為15%的乙醇和60 μL內(nèi)標(biāo)物(2-辛醇，質(zhì)量濃度為8 800 μg/L)。將萃取纖維頭插入SPME小瓶中，50 ℃溫水浴下超聲萃取45 min。萃取結(jié)束后，將萃取纖維頭插入GC- MS進(jìn)樣口，在250 ℃下熱解吸7 min。通過DB- 氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)分析樣品。

GC- MS條件：初始溫度為40 ℃，保持3 min，以6 ℃/min的速率升高至100 ℃，以10 ℃/min的速率升高至230 ℃并保持7 min。載氣為純度大于99.999%的高純度氦氣，不分流，氣體流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣器和檢測(cè)器溫度均設(shè)定為250 ℃，離子源溫度設(shè)定為230 ℃。質(zhì)譜儀的電離方式為電子轟擊電離(EI)，EI發(fā)射電流為50 μA，EI的離子能量為70 eV。m/z掃描33～400 u范圍內(nèi)的總離子流。通過NIST譜庫(kù)對(duì)比出高級(jí)醇。

高級(jí)醇的半定量分析是通過2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行。通過用GC- MS檢測(cè)的高級(jí)醇和內(nèi)標(biāo)的峰面積代入式(1)，計(jì)算燕麥黃酒中高級(jí)醇的含量。

(1)

式(1)中：C為燕麥黃酒中某種高級(jí)醇的質(zhì)量濃度，μg/L；Cis為樣品中內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度，μg/ L；Ac為燕麥黃酒中待測(cè)高級(jí)醇的峰面積；Ais為內(nèi)標(biāo)物峰面積。

1.3.3燕麥黃酒發(fā)酵中微生物多樣性的測(cè)定

利用土壤DNA試劑盒從發(fā)酵物中抽提微生物DNA。完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA質(zhì)量和純度。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增細(xì)菌的16S rRNA基因的V3～V4高變區(qū)。PCR反應(yīng)體系的過程設(shè)定為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 40 s；72 ℃延伸10 min，25個(gè)循環(huán)，引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。同時(shí)，通過PCR擴(kuò)增真菌的ITS1區(qū)域，PCR反應(yīng)體系的過程設(shè)定為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s；61 ℃ 30 s；72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。引物為ITS1F(5′-AxxxCTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-BGCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)[11]。PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。純化的擴(kuò)增子以等物質(zhì)的量比匯集，并在Illumina MiSeq平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序(2×300)。

Miseq測(cè)序得到的PE reads先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量通過Trimmomatic進(jìn)行質(zhì)控和過濾，通過FLASH做數(shù)據(jù)合并，進(jìn)行OTU(operational taxonomic unit)聚類分析和物種分類學(xué)分析。使用Usearch (版本7.0 http://drive5.com/uparse/)以97%相似性為截止值對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，最終生成OTU表格。采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU 代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，分別在各分類水平：domain(域)、kingdom(界)、phylum(門)、class(綱)、order(目)、family(科)、genus(屬)、species(種)統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。16S細(xì)菌和古菌核糖體使用Silva數(shù)據(jù)庫(kù)[10](Release128 http://www.arb-silva.de)；ITS 真菌使用Unite[11](Release 7.0 http://unite.ut.ee/index.php)真菌數(shù)據(jù)庫(kù)。基于OTU聚類分析結(jié)果，進(jìn)行多樣性指數(shù)分析；基于分類學(xué)信息，可以在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)。

通過單樣本的多樣性(Alpha多樣性)分析微生物群落的多樣性，使用Simpson指數(shù)估算樣本中微生物多樣性，Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低。通過計(jì)算物種之間的相關(guān)性，構(gòu)建物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)物種與物種之間的相關(guān)系數(shù)符合0.05閾值時(shí)則構(gòu)建連線。最后使用Networkx復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析工具包，獲得物種和樣本的組內(nèi)相關(guān)信息。16S功能預(yù)測(cè)則是通過PICRUSt對(duì)OTU豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，去除16S marker基因在物種基因組中的拷貝數(shù)目的影響，根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的信息，獲得代謝通路的3個(gè)水平信息，并分別得到3個(gè)水平的代謝路徑豐度表。

1.3.4燕麥黃酒中高級(jí)醇與微生物關(guān)聯(lián)分析

為將高級(jí)醇代謝與微生物代謝聯(lián)系起來，利用皮爾遜(Person)相關(guān)性建立了高級(jí)醇和屬水平微生物的顯著性關(guān)聯(lián)。使用Benjamini-Hochberg方法通過FDR調(diào)整P值和P校正值，利用R語(yǔ)言編程，根據(jù)所有重要的關(guān)聯(lián)構(gòu)建關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，P值設(shè)定為P≤0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 高級(jí)醇在燕麥黃酒發(fā)酵過程中的動(dòng)態(tài)變化

通過GC- MS檢測(cè)以燕麥為原料釀造黃酒過程中高級(jí)醇的種類及含量，結(jié)果見表1。由表1可見，整個(gè)發(fā)酵過程中共檢測(cè)到包括β-苯乙醇在內(nèi)的18種高級(jí)醇，其中發(fā)酵末期(第10天)檢測(cè)到6種高級(jí)醇，分別是β-苯乙醇、異戊醇、異丁醇、2-甲基-2-乙基- 十三醇、1-十六烷醇和2-[2-(乙烯氧基)乙氧基]乙醇。高級(jí)醇的總含量在發(fā)酵末期達(dá)到最大值，為(15 011.968±6.050)μg/L。所有高級(jí)醇中，穩(wěn)定存在的高級(jí)醇(檢出次數(shù)≥4)包括：β-苯乙醇、異戊醇、2-甲基-2-乙基- 十三醇和1-十六烷醇。在投料當(dāng)天，即發(fā)酵第0天，(Z,Z)-2-(9,12-十八碳二烯基氧基)- 乙醇是最主要的高級(jí)醇，占當(dāng)日高級(jí)醇總檢出量的43.13%；發(fā)酵第2天的主要高級(jí)醇是β-苯乙醇，占當(dāng)日高級(jí)醇總檢出量的50.80%；在發(fā)酵的第4天，β-苯乙醇和異戊醇都具有較高的含量，分別占當(dāng)日總檢出量的40.22%和44.33%；在發(fā)酵第6天和第10天，2-甲基-2-乙基- 十三醇都具有較高的含量，分別占各天高級(jí)醇總檢出量的56.89%和58.19%。同時(shí)，在整個(gè)發(fā)酵過程中，2-甲基-2-乙基- 十三醇具有最高的單次檢出量，為(8 734.937±0.905) μg/L。3,3-二甲基-2-戊醇、植物醇和叔十六烷硫醇僅在投料當(dāng)天被檢測(cè)到。

表1 高級(jí)醇在燕麥黃酒發(fā)酵過程中的變化

“—”表示未檢出。

圖1 燕麥黃酒發(fā)酵過程中細(xì)菌門水平和屬水平的多樣性Fig.1 Bacterial diversity during fermentation of oat Huangjiu on phylum level and genus level

2.2 燕麥黃酒發(fā)酵過程中的細(xì)菌多樣性

采用MiSeq二代測(cè)序技術(shù)研究燕麥黃酒中細(xì)菌多樣性，經(jīng)過有效序列篩選后18個(gè)樣品共獲得791 608個(gè)有效序列，在各個(gè)生物學(xué)分類水平上分別獲得：1界，27門，50綱，104目，192科，413屬；在3%非相似度(cutoff)水平上分析發(fā)酵液中細(xì)菌多樣性，獲得1 124個(gè)OUT。燕麥黃酒發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性如圖1。門水平上的最優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門(Firmicutes)，其相對(duì)豐度呈先急劇升高后緩慢降低再稍有回升的趨勢(shì)；變形菌門(Proteobacteria)是次優(yōu)門，其相對(duì)豐度呈現(xiàn)先急劇降低再逐漸緩慢升高的趨勢(shì)；擬桿菌門(Bacteroidetes)在發(fā)酵第8天呈現(xiàn)較高的相對(duì)豐度。屬水平上乳球菌屬(Lactococcus)是最優(yōu)勢(shì)屬，從發(fā)酵第2天起，其相對(duì)豐度呈現(xiàn)不斷降低的趨勢(shì)；乳桿菌屬(Lactobacillus)在第6天有較高的相對(duì)豐度；片球菌屬(Pediococcus)在發(fā)酵第10天有較高的相對(duì)豐度。

通過Alpha多樣性分析(Simpson指數(shù))發(fā)現(xiàn)(如圖2)，發(fā)酵過程中微生物的細(xì)菌多樣性在投料開始時(shí)較高，在發(fā)酵第2天急劇降低，隨后逐漸升高。

圖2 燕麥黃酒發(fā)酵過程中細(xì)菌Alpha多樣性分析Fig.2 Bacterial Alpha diversity analysis during fermentation of oat Huangjiu

圖3 燕麥黃酒細(xì)菌相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析Fig.3 Bacterial network analysis of oat Huangjiu

對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間樣本間的物種豐度信息進(jìn)行相關(guān)性分析，物種在黃酒發(fā)酵樣本中的共存在關(guān)系和物種間的相互作用情況如圖3。所有菌屬間所建立的相關(guān)性均為正相關(guān)，其中厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的多屬微生物之間建立了復(fù)雜的獨(dú)立正相關(guān)性；Spongiimonas、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)和弧菌屬(Vibro)相互間建立正相關(guān)并且未與其他菌屬建立相關(guān)性。

根據(jù)Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)的信息，可以獲得代謝通路信息，用PICRUSt獲得代謝通路的3個(gè)水平信息，level 1和level 2水平的豐度如圖4。膜運(yùn)輸、氨基酸代謝和碳水化合物代謝是相對(duì)豐度最高的代謝通路。

圖4 KEGG代謝通路水平1和水平2相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of KEGG pathway on level 1 and level 2

2.3 燕麥黃酒發(fā)酵過程中的真菌多樣性

對(duì)18個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)序，研究發(fā)酵物的真菌多樣性，優(yōu)化后共得到648 999個(gè)序列，在各個(gè)分類水平上分別包括1界、3門、4綱、4目、8科、8屬。在3%非相似度(cutoff)水平上分析發(fā)酵液中真菌多樣性，獲得13個(gè)OUT。燕麥黃酒發(fā)酵液中的門水平和屬水平的微生物相對(duì)豐度如圖5。圖5中，門水平上子囊菌門(Ascomycota)占有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，其相對(duì)豐度為99.97%～100.00%；屬水平上酵母菌屬(Saccharomyces)是最具優(yōu)勢(shì)的菌屬，其相對(duì)豐度為99.72% ～ 99.98%。

通過Alpha多樣性分析(Simpson指數(shù))(如圖6)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中的微生物真菌多樣性無明顯變化，且真菌多樣性較低。

圖5 燕麥黃酒發(fā)酵過程中真菌門水平和屬水平的多樣性Fig.5 Fungal diversity during fermentation of oat Huangjiu on phylum level and genus level

圖6 燕麥黃酒發(fā)酵過程中真菌Alpha多樣性分析Fig.6 Fungal Alpha diversity analysis during fermentation of oat Huangjiu

2.4 燕麥黃酒中微生物與高級(jí)醇代謝的相關(guān)性預(yù)測(cè)

利用Person相關(guān)性預(yù)測(cè)燕麥黃酒發(fā)酵過程中微生物與高級(jí)醇的關(guān)聯(lián)，設(shè)定P≤0.05，在檢測(cè)到的18種高級(jí)醇中有16種高級(jí)醇與297屬微生物共建立了869項(xiàng)關(guān)聯(lián)。1-(十二烷)乙醇與153屬微生物建立了關(guān)聯(lián)，是建立關(guān)聯(lián)數(shù)最多的高級(jí)醇；2-苯氧乙醇與151屬微生物建立了關(guān)聯(lián)；3,3-二甲基-2-戊醇、植物醇和叔十六烷硫醇都與136屬微生物建立了關(guān)聯(lián)；(Z,Z)-2-(9,12-十八碳二烯基氧基)-乙醇與125屬微生物建立關(guān)聯(lián)；2-[2-(乙烯氧基)乙氧基]-乙醇、異丁醇和1-十六烷醇都僅與7屬微生物建立關(guān)聯(lián)；1-十二烷醇、亞麻醇、1-十一烷醇和2-乙基- 正葵醇都僅與2屬微生物相關(guān)聯(lián)；異辛醇和異戊醇都與嗜熱真菌屬(Thermomyces)建立了關(guān)聯(lián)；β-苯乙醇與根霉菌屬(Rhizopus)建立了關(guān)聯(lián)。

圖7 FDR校正后燕麥黃酒中微生物與高級(jí)醇代謝的相關(guān)性預(yù)測(cè)Fig.7 Correlation between microorganisms and higher alcohols of oat Huangjiu after adjusting by FDR

利用False Discovery Rate (FDR)對(duì)P值進(jìn)行校正，設(shè)定P(adjust)≤0.05，發(fā)現(xiàn)共有8種高級(jí)醇與244屬微生物建立了675項(xiàng)更緊密的關(guān)聯(lián)(如圖7)。其中，1-(十二烷)乙醇仍與124屬微生物建立關(guān)聯(lián)，建立關(guān)聯(lián)數(shù)最多；2-苯氧乙醇與118屬微生物建立了緊密關(guān)聯(lián)；3,3-二甲基-2-戊醇、植物醇和叔十六烷硫醇都與110屬微生物建立了緊密的關(guān)聯(lián)；(Z,Z)-2-(9,12-十八碳二烯基氧基)-乙醇與92屬微生物建立緊密關(guān)聯(lián)；2-[2-(乙烯氧基)乙氧基]-乙醇與片球菌屬(Pediococcus)等7屬微生物建立關(guān)聯(lián)； 1-十六烷醇與馬拉色氏霉菌屬(Malassezia)等4屬微生物建立緊密關(guān)聯(lián)。高豐度的微生物中，羅爾斯通菌屬(Ralstonia)和紅球菌屬(Rhodococcus)均與高級(jí)醇的代謝建立了關(guān)聯(lián)。

3 討 論

β-苯乙醇作為黃酒中常見的高級(jí)醇之一，是本研究中一直穩(wěn)定存在的高級(jí)醇。β-苯乙醇是一種具有持久的玫瑰型香味的高級(jí)芳香醇，是玫瑰香氣的主要成分，天然存在于多種植物花、葉及其提取物中，在食品領(lǐng)域和日用化學(xué)品中有著廣泛的應(yīng)用。一定濃度的β-苯乙醇能夠抑制革蘭氏陰性菌、球菌、桿菌以及部分真菌的生長(zhǎng)繁殖，具有抑菌效果[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，乳球菌在發(fā)酵中后期受到抑制，其抑制有可能來自β-苯乙醇。一些真菌和酵母菌株具有生產(chǎn)β-苯乙醇的能力[13]。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，β-苯乙醇在微生物機(jī)體內(nèi)的主要代謝路徑是苯丙氨酸代謝途徑，其生成是通過L-苯丙氨酸去羧基生成苯乙胺，苯乙胺由于去氨基作用生成苯乙醛，苯乙醛再經(jīng)還原作用生成β-苯乙醇[14]。研究表明，多種酵母，如黏紅酵母(Rhodotomlaglutinis)、畢赤酵母(Pichiapastoris)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、異常漢遜釀酒酵母(Unusualhansonsaccharomycescerevisiae)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)及真菌，如黑曲霉(Aspergillusniger)、猴頭菌(Hericiumerinaceus)、白地霉(Geotrichumcandidum)具有生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生成β-苯乙醇的能力[15-17]。β-苯乙醇與苯乙醛之間可以相互轉(zhuǎn)化，本研究發(fā)現(xiàn)，根霉屬菌(Rhizopus)與β-苯乙醇的代謝呈負(fù)相關(guān)，因此，根霉菌屬可能參與β-苯乙醇轉(zhuǎn)化生成苯乙醛。

異戊醇是酒類發(fā)酵過程中最主要的高級(jí)醇組分。Atsumi等[18]利用13C核磁共振波譜法和氣相色譜質(zhì)譜法發(fā)現(xiàn)，亮氨酸經(jīng)由Ehrlich途徑代謝可得到異戊醇。異戊醇在本實(shí)驗(yàn)中也占有較高的比例，其含量在發(fā)酵中后期均高于β-苯乙醇，因此，控制異戊醇的產(chǎn)量對(duì)控制黃酒發(fā)酵中高級(jí)醇含量具有重要意義。研究表明，異戊醇的生成量不嚴(yán)格隨酵母添加量的增多而增多[19]。異戊醇可能被分解或轉(zhuǎn)化，其可能經(jīng)酯化反應(yīng)與酸反應(yīng)生成酯，也有可能在微生物的作用下轉(zhuǎn)化生成其他物質(zhì)。關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，異戊醇的產(chǎn)生與嗜熱真菌屬(Thermomyces)呈負(fù)相關(guān)，嗜熱真菌屬可能參與異戊醇的分解代謝，可能對(duì)高級(jí)醇的控制具有積極效果。

異丁醇可用作生物燃料，同時(shí)也是人工麝香、精油和藥物的重要原料[20]。Dickinson 等[21]的研究結(jié)果表明，釀酒酵母內(nèi)能夠通過纈氨酸代謝途徑合成異丁醇，梭狀芽胞桿菌是丁醇的天然生產(chǎn)者，能在合適的發(fā)酵條件下產(chǎn)生大量丁醇。本研究發(fā)現(xiàn)，異丁醇與片球菌屬(Pediococcus)和變形桿菌屬(Proteus)等7屬微生物建立關(guān)聯(lián)且均為正相關(guān)，它們均可作為異丁醇生產(chǎn)的潛在菌屬，對(duì)高級(jí)醇的控制可能具有重要意義。

2-苯氧乙醇是一種略帶玫瑰香味、低揮發(fā)、高沸點(diǎn)的無色油狀液體[22]，是一種重要的化工原料，主要通過工業(yè)合成的方法獲取[23]。由微生物代謝產(chǎn)生2-苯氧乙醇尚未見報(bào)道。根據(jù)檢出結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2-苯氧乙醇顯示出逐漸上升的趨勢(shì)且在發(fā)酵初始階段有原料帶入。經(jīng)過FDR校正后，2-苯氧乙醇仍與酵母屬(Saccharomycopsis)等118屬微生物建立關(guān)聯(lián)，是建立關(guān)聯(lián)數(shù)較多的高級(jí)醇，由此可推測(cè)其代謝基質(zhì)較為復(fù)雜，且這118屬微生物可能參與其生物代謝過程。

在檢測(cè)到的18種高級(jí)醇中包括3種烷醇，分別為：1-十一烷醇、1-十二烷醇和1-十六烷醇。十二個(gè)碳原子以上蠟狀固體的飽和一元醇被稱為高級(jí)烷醇，含有十二個(gè)碳原子以下無色液體的鏈狀飽和一元醇被稱為低級(jí)烷醇。高級(jí)烷醇在自然界中的存在極為廣泛，通常以高級(jí)脂肪酸蠟酯的形式存在，廣泛分布于植物的根、莖、葉、果皮及籽仁中。高級(jí)烷醇對(duì)動(dòng)植物具有多種生理活性，可顯著降低膽固醇水平，具有抗血栓形成等多重作用[24]。高級(jí)烷醇在微生物體內(nèi)主要有3條脂肪醇合成途徑：以脂酰- ACP為底物合成脂肪醇；以自由脂肪酸為底物合成脂肪醇；以脂酰- CoA 為底物合成脂肪醇[25-27]。本研究中最主要的高級(jí)烷醇為1-十六烷醇，其含量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，1-十六烷醇代謝路徑主要存在于脂肪酸分解代謝過程，十六烷(脂肪酸)在長(zhǎng)鏈醛脫氫酶的作用下生成十六醛[28]，隨后長(zhǎng)鏈醇脫氫酶將十六醛轉(zhuǎn)化為十六烷醇。本研究將十六烷醇與馬拉色氏霉菌屬(Malassezia)、威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces)、Mucispirillum和Tyzzerella_3均建立了緊密的正相關(guān)。這些菌屬與十六烷醇的相關(guān)性均大于0.95，可能參與了十六烷醇的代謝，是十六烷醇的潛在生產(chǎn)菌屬。

酵母菌屬作為生產(chǎn)酒精的主要微生物，是發(fā)酵過程中不可或缺的重要菌屬之一。針對(duì)黃酒中高級(jí)醇的含量及種類的研究多集中于酵母品種、充氧量、酵母接種量、發(fā)酵溫度等對(duì)于高級(jí)醇代謝的影響[29]。其他微生物菌屬，尤其是細(xì)菌對(duì)高級(jí)醇代謝有一定影響，對(duì)細(xì)菌種類和豐度的調(diào)控可能成為調(diào)控高級(jí)醇含量的另一有效途徑。以燕麥為原料釀造黃酒是黃酒釀造工業(yè)的一個(gè)新的嘗試，對(duì)燕麥黃酒中重要質(zhì)量指標(biāo)之一的高級(jí)醇進(jìn)行研究，對(duì)燕麥黃酒后續(xù)研究和開發(fā)將具有重要意義。