紅曲霉Monascus sanguineus X1處理黃水的培養(yǎng)基優(yōu)化及酯化液制備

劉 丹， 楊 帆， 薛意斌， 王旭鋒， 張 靜， 劉歡歡，李貞景， 陳勉華， 王昌祿

(天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院/省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津 300457)

黃水是白酒釀造的酒醅中溶解于水的部分營養(yǎng)物質(zhì)，浸沉于窖池底部形成的棕黃色黏稠狀液體。年產(chǎn)上萬噸的白酒企業(yè)，每天約有10 t黃水產(chǎn)生。黃水中含有豐富的殘余淀粉、還原糖和大量的有機(jī)酸，其中乙酸、丁酸和乳酸的含量最為豐富[1]，若不經(jīng)過處理直接排放，不僅會污染環(huán)境，而且會造成資源浪費(fèi)。目前，針對黃水的研究和應(yīng)用，主要有4個(gè)方面：1)微生物多樣性分析及菌種選育[2]；2)風(fēng)味物質(zhì)萃取[3]；3)釀酒用大曲的制備[4]；4)利用微生物產(chǎn)酯化酶的特性處理黃水，制備酯化液及窖泥養(yǎng)護(hù)[5]，如唐麗云等[6]利用黃水酯化液提高濃香型白酒的質(zhì)量和口感；李河等[7]利用現(xiàn)代微生物和發(fā)酵工程技術(shù)，在酯化酶作用下將黃水、酒尾、尾水等釀酒副產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為濃香型白酒酯化液；郗曄[8]以黃水為基質(zhì)培養(yǎng)產(chǎn)香紅曲霉，在不添加其他物質(zhì)的黃水中發(fā)酵產(chǎn)生菌絲體。因此，利用紅曲霉制備黃水酯化液，用于白酒增香，具有較大的應(yīng)用潛力[9-13]。

目前黃水酯化液制備多以曲為微生物來源，且以固態(tài)發(fā)酵為主要方式，以純種紅曲霉液態(tài)發(fā)酵處理黃水制備酯化液少見報(bào)道，本文利用一株高產(chǎn)酯化酶的紅曲霉菌株X1，以酯化酶活力為指標(biāo)，對該菌株進(jìn)行了培養(yǎng)基優(yōu)化；研究了黃水、乙醇、己酸等酯化前體物質(zhì)對其液態(tài)發(fā)酵制備酯化液的影響；優(yōu)化了產(chǎn)酯化液的相關(guān)參數(shù)。該結(jié)果旨在為紅曲霉及其酯化酶在黃水中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

紅曲霉(Monascussanguineus)X1由天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院發(fā)酵食品與新資源開發(fā)研究室保藏。硝酸鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、蛋白胨、葡萄糖等均為分析純。黃水由天津津酒集團(tuán)提供。

培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基[14]。種子液培養(yǎng)基：大米粉3 g，NaNO30.3 g，KH2PO40.25 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，自來水100 mL，pH自然。發(fā)酵培養(yǎng)基：大米粉5 g，NaNO30.3 g，KH2PO40.15 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，自來水100 mL，pH值為7.0。以上培養(yǎng)基滅菌條件為121 ℃，15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW- CJ- 1FD型超凈工作臺，上海博訊事業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LS- B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；KCL2000型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，日本EYELA東京理化公司；AG22331型高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；ZWY- 2112D型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海支撐分析儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1紅曲霉X1產(chǎn)酯化酶的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.3.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1為不同發(fā)酵參數(shù)單因素實(shí)驗(yàn)條件。以酯化酶活力為指標(biāo)，選擇不同碳源、碳氮比、接種量和初始pH值，研究其對紅曲霉X1液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯化酶的影響。

表1 不同發(fā)酵參數(shù)單因素實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以碳源、碳氮比、接種量、pH值為影響因素，酯化酶活力為指標(biāo)，進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)(表2)，確定培養(yǎng)基最優(yōu)組合。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1.3 紅曲霉X1發(fā)酵產(chǎn)酯化酶最適黃水添加量的確定

在單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到的優(yōu)化條件基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究未滅菌黃水添加量(0、5%、10%、20%(體積分?jǐn)?shù)))對紅曲霉菌株X1液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯化酶的影響，得到菌株X1產(chǎn)酯化酶的最適黃水添加量。

1.3.2酯化液制備中最適底物添加量的確定

發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后，以3 000 r/min離心10 min，收集酶活最高時(shí)的發(fā)酵上清液，分兩組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，一組添加己酸(0、0.05%、0.10%(體積分?jǐn)?shù)))和乙醇(0、0.5%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%(體積分?jǐn)?shù)))；另一組則補(bǔ)加黃水(0、5%、10%、20%(體積分?jǐn)?shù)))，分別制備酯化液。研究己酸、乙醇添加量和黃水補(bǔ)加量對酯化液制備的影響。

1.3.3發(fā)酵產(chǎn)物測定

乙酸、己酸、乙醇、乙酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯的測定采用氣相色譜法。以8 000 r/min離心發(fā)酵液，取上清液，過0.22 μm濾膜后進(jìn)樣檢測。檢測條件為：氣相色譜儀配備FID檢測器(450GC，德國布魯克公司)，AT. LZP- 930白酒毛細(xì)管專用色譜柱(30 m×0.32 mm×1.0 μm，中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所)，進(jìn)樣口溫度200 ℃，檢測器溫度200 ℃，柱流速5.00 mL/min，載氣為氦氣(純度99.99%)，載氣流速25 mL/min，氫氣30 mL/min，空氣流速300 mL/min。分流比10∶1，進(jìn)樣量1 μL。程序升溫條件初始溫度60 ℃，保持5 min，以5.0 ℃/min連續(xù)升溫至180 ℃并保持3 min。

1.3.4酯化酶酶活力測定

采用1-萘酚比色法對酯化酶酶活力進(jìn)行測定[15]。酶活力定義：在37 ℃條件下，15 min水解1-醋酸萘酯產(chǎn)生1.0 nmol 1-萘酚所需酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基對紅曲霉X1產(chǎn)酯化酶的影響

以酯化酶活力為指標(biāo)，選擇不同碳源、碳氮比、接種量和初始pH值，研究其對紅曲霉X1液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯化酶的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3。

2.1.1碳源對X1菌株產(chǎn)酯化酶活力的影響

表3中，以大米粉為碳源，發(fā)酵液上清液中酯化酶活力為435.05 U/mL；以可溶性淀粉為碳源時(shí)，酯化酶活力僅為302.35 U/mL，差異明顯。二者差異可能是由于其淀粉含量及性狀不同導(dǎo)致培養(yǎng)液黏度不同，使X1生長條件不同，因而酯化酶活力存在差異。另外，大米粉營養(yǎng)更豐富，原料來源廣泛，價(jià)格低廉，雖然溶解性相對較差，但從酶活力結(jié)果來看，不影響X1菌株生長及酯化酶產(chǎn)生。

表3 碳源、碳氮比、接種量和pH值對X1菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯化酶活力的影響

碳源A*、B*分別為可溶性淀粉和大米粉。

2.1.2碳氮比對X1菌株產(chǎn)酯化酶活力的影響

碳氮比對微生物生長及代謝影響較大，若培養(yǎng)基碳源不足，易引起菌體衰老和自溶，而碳源過高，容易發(fā)生底物抑制，培養(yǎng)基酸化，不利于菌體生長；若氮源過多，菌體生長過于旺盛，不利于代謝產(chǎn)物積累[16]。霉菌細(xì)胞中碳氮比大約為10∶1，一般工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮比約為50∶1，由于酯化酶是一類蛋白酶，在發(fā)酵過程中氮源消耗多，因此，通過降低培養(yǎng)基中碳氮比，可提高酯化酶的產(chǎn)量[17]。本研究中，當(dāng)培養(yǎng)基中碳氮比為5.5∶1時(shí)，紅曲霉X1發(fā)酵液中酯化酶活力最高，為446.89 U/mL，說明此碳氮比有利于X1菌株酯化酶生產(chǎn)。

2.1.3接種量對X1菌株產(chǎn)酯化酶活力的影響

接種量對微生物生長繁殖代謝尤為重要。在發(fā)酵工業(yè)中，霉菌的接種量一般為7%～15%(體積分?jǐn)?shù))。采用較大接種量，可縮短發(fā)酵過程中菌體繁殖達(dá)到高峰的時(shí)間，加速酯化酶產(chǎn)生，并減少雜菌污染；但接種量過大，易引起菌體競爭，菌種活力不足，導(dǎo)致酯化酶活力下降。本研究中，當(dāng)紅曲霉接種量為10%時(shí)，發(fā)酵液中酯化酶活力為435.05 U/mL，適合X1菌株生長及酯化酶產(chǎn)生。

2.1.4初始pH值對X1菌株產(chǎn)酯化酶活力的影響

利用乳酸控制初始發(fā)酵培養(yǎng)基pH值為5.5時(shí)，發(fā)酵液中酯化酶活力為427.68 U/mL；pH值為5.0時(shí)，發(fā)酵液中酯化酶活力為404.25 U/mL，僅比pH值5.5的發(fā)酵液酶活力低23.43 U/mL。因此，pH值5.0和pH值5.5的培養(yǎng)基條件均較適合X1菌株生長及酯化酶產(chǎn)生。

2.1.5X1菌株產(chǎn)酯化酶發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以大米粉為碳源，控制碳氮比5.5∶1，接種量10%，pH值5.0為條件進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表4。由于正交試驗(yàn)得到的優(yōu)水平和優(yōu)組合不統(tǒng)一，須對正交結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果如表5。2號試驗(yàn)組(優(yōu)組合)的結(jié)果相對高于1號試驗(yàn)組(優(yōu)水平)，即大米粉為碳源，碳氮比為5.5∶1，接種量為10%，pH值為5.0的培養(yǎng)條件較合適。

由表5可知，X1菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯化酶的優(yōu)化培養(yǎng)基為(含量以100 mL計(jì))：大米粉7 g，大豆蛋白胨2 g，NaNO30.2 g，KH2PO40.15 g，MgSO4·7H2O 0.1 g。優(yōu)化培養(yǎng)條件為：500 mL三角瓶中裝液量50 mL，初始pH值5.0，接種量10%，培養(yǎng)溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)時(shí)間4 d。

2.1.6黃水添加對X1菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯化酶的影響

黃水中含有少量白酒釀造過程中未利用的淀粉、殘?zhí)羌鞍被岬任镔|(zhì)[18]，可作為紅曲霉生長的營養(yǎng)物，而其中豐富的有機(jī)酸，可誘導(dǎo)紅曲霉產(chǎn)生酯化酶，從而提高發(fā)酵液中酯化酶活力。在此，考察了黃水的添加對紅曲霉X1發(fā)酵產(chǎn)酯化酶的影響，結(jié)果如圖1。

表4 X1菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯化酶正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 X1菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯化酶正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

圖1 黃水添加量對酯化酶酶活力的影響Fig.1 Effect of yellow water addition in esterifying enzyme activity

在空白組和實(shí)驗(yàn)組中，發(fā)酵上清液中酯化酶活力均呈先升高后降低趨勢。空白組發(fā)酵液中酯化酶酶活力在第2天時(shí)比實(shí)驗(yàn)組高，為211.50 U/mL，且增長最快，第4天達(dá)到酶活力高峰(489.45 U/mL)，之后開始下降，在第6天時(shí)酶活力下降到392.07 U/mL，為最高時(shí)的80.1%；實(shí)驗(yàn)組紅曲霉X1均存在較長的生長適應(yīng)期，在添加5%、10%、20%黃水組，酶活力分別在第4天、5天和5天達(dá)到最高(723.38、765.95、590.98 U/mL)。由此可見，添加5%～20%黃水可提高酯化酶產(chǎn)量，其中10%效果最好；分別添加30%、40%黃水時(shí)，抑制了紅曲霉X1的生長，酯化酶活力未檢出，這可能是由于過量黃水的添加導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值較低[19]；空白組，添加5%、10%、20%、30%、40%黃水組，其培養(yǎng)基初始pH值分別為5.41、4.60、4.29、4.08、3.98、3.92。pH值對微生物生長和產(chǎn)酶有一定的影響，從而造成酯化酶活力不同。因此，添加適量黃水能夠促進(jìn)紅曲霉X1生長過程中產(chǎn)生酯化酶。

2.2 不同酯化底物的添加對酯化液制備的影響

2.2.1己酸、乙醇的添加對酯化液制備的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后，以酯化酶活力最高的發(fā)酵上清液催化不同體積分?jǐn)?shù)的己酸和乙醇制備酯化液，研究己酸和乙醇的添加對酯化液制備的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。由圖2可知，隨著己酸添加量的增加，己酸乙酯生成量也隨之增加，但己酸利用率卻隨著己酸含量的增加呈現(xiàn)先增加后降低趨勢。在空白組中，己酸乙酯體積分?jǐn)?shù)僅為0.004 8%；當(dāng)己酸添加量為0.8%時(shí)，己酸利用率達(dá)到最大，為7.61%，此時(shí)己酸乙酯體積分?jǐn)?shù)為0.029%，較空白組增加了5倍。當(dāng)己酸添加量為0.8%時(shí)，己酸利用率高，己酸乙酯生成量較大。而當(dāng)己酸添加量高于0.8%時(shí)，由于pH值降低導(dǎo)致酶活力下降，己酸利用率也隨之降低，導(dǎo)致己酸乙酯產(chǎn)量與己酸添加量不成正比。

圖2 己酸和乙醇添加量對酯化液中己酸乙酯生成量的影響Fig.2 Effect of hexanoic acid and ethanol addition on production of ethyl caproate in esterification liquid

在己酸最優(yōu)(0.8%)條件下，隨著乙醇添加量的增加，己酸乙酯濃度呈現(xiàn)先增加后降低趨勢，當(dāng)乙醇添加量為20%時(shí)，己酸乙酯體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.121%；當(dāng)乙醇添加量為25%時(shí)，己酸乙酯體積分?jǐn)?shù)僅為最高組的21.5%。這可能是由于酯化反應(yīng)所需底物乙醇的增加抑制了酯化酶活性，也可能是改變了酯化酶結(jié)構(gòu)降低了酯化速率，導(dǎo)致己酸乙酯生成量減少[20]。

2.2.2未滅菌黃水添加量對酯化液制備的影響

在酯化酶活力最高的發(fā)酵上清液中補(bǔ)加不同體積分?jǐn)?shù)的黃水制備酯化液，研究黃水添加量對酯化液制備的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。

圖3 黃水添加量對酯化液中乳酸乙酯、己酸乙酯生成量的影響Fig.3 Effect of yellow water addition on production of ethyl lactate and ethyl caproate in esterification liquid

由圖3可知，隨著黃水添加量的增加，乳酸乙酯濃度呈遞增趨勢，己酸乙酯濃度先增加后降低。當(dāng)黃水添加量為10%時(shí)，乳酸乙酯體積分?jǐn)?shù)為0.032%，己酸乙酯體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.055%。隨著黃水添加量的增加，乳酸乙酯增幅不明顯，而己酸乙酯濃度開始降低，這可能是由于在酯化反應(yīng)體系中，乳酸和己酸作為競爭性底物，在一定范圍內(nèi)，兩者均隨著底物濃度增加而呈現(xiàn)增加趨勢，超過此范圍，兩者出現(xiàn)競爭而乳酸更占優(yōu)勢，己酸乙酯的合成便會減少；也可能是由于在該培養(yǎng)基條件下，合成的酯化酶中乳酸乙酯合成酶活性高于己酸乙酯合成酶活性[21]。

當(dāng)在紅曲霉X1發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入體積分?jǐn)?shù)為0.8%的己酸和體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇繼續(xù)培養(yǎng)1 d后，酯化液中己酸乙酯體積分?jǐn)?shù)可達(dá)0.121%；而向酯化酶液中補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)為10%黃水后，己酸乙酯和乳酸乙酯體積分?jǐn)?shù)分別可達(dá)0.055%和0.032%，總酯體積分?jǐn)?shù)為0.087%。

3 結(jié) 論

研究了紅曲霉MonascussanguineusX1處理黃水的培養(yǎng)基優(yōu)化及酯化液制備條件。結(jié)果表明：該紅曲霉優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組分(以100 mL計(jì))：大米粉7.0 g，大豆蛋白胨2.0 g，NaNO30.2 g，KH2PO40.15 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，培養(yǎng)基初始pH值5.0，接種量 10%(體積分?jǐn)?shù))。在此條件下，加入體積分?jǐn)?shù)為0.8%的己酸和體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇繼續(xù)培養(yǎng)1 d后，酯化液中己酸乙酯體積分?jǐn)?shù)可達(dá)0.121%；而向酯化酶液中補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)為10%的黃水后，己酸乙酯和乳酸乙酯的體積分?jǐn)?shù)分別可達(dá)到0.055%和0.032%，總酯體積分?jǐn)?shù)為0.087%。

利用微生物酶法生產(chǎn)酯類物質(zhì)不僅反應(yīng)條件溫和、能耗低，反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率高，而且產(chǎn)品純度高，香味自然純正，使白酒風(fēng)味柔和、香醇自然，可增強(qiáng)其固態(tài)感和自然感。濃香型白酒酯化液以釀酒副產(chǎn)物黃水、酒尾、尾水等為原料，加入酶制劑、己酸，人為控制酯化液發(fā)酵條件，可以較快地得到高酯生物發(fā)酵液。許多酒廠都在積極使用酯化液發(fā)酵技術(shù)來生產(chǎn)高酯調(diào)味酒，提高濃香型白酒的優(yōu)質(zhì)品率，增強(qiáng)酒體協(xié)調(diào)性等，并使釀酒副產(chǎn)物得到綜合利用，實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)，提高濃香型白酒的質(zhì)量。