錦帶花乙酸乙酯提取物鎮(zhèn)痛作用研究

李佳霓 應(yīng)子斕 代鑫 崔玉芳 羅學(xué)婭

摘 要：為了研究錦帶花（Weigela florida）乙酸乙酯提取物對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛作用，將錦帶花利用乙酸乙酯萃取制備錦帶花乙酸乙酯提取物，采用熱板法和扭體法疼痛動(dòng)物模型，將雌雄兼用小鼠100只隨機(jī)分為錦帶花乙酸乙酯提取物2.00、1.00、0.50 g/kg劑量組，鹽酸曲馬多0.04 g/kg劑量組和生理鹽水組，每組10只，灌胃給藥。分別觀察給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠痛閾值，或不同時(shí)間段的小鼠扭體反應(yīng)數(shù)。根據(jù)痛閾值和扭體反應(yīng)數(shù)的變化評(píng)判錦帶花乙酸乙酯提取物的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果顯示，在熱板法中，錦帶花乙酸乙酯提取物1.00 g/kg劑量組給藥后60 min和2.00 g/kg劑量組給藥后30、45、60 min的痛閾值高于生理鹽水組；1.00 g/kg劑量組給藥后45、60 min和2.00 g/kg劑量組給藥后15～60 min的痛閾值分別高于各自給藥前痛閾值（P<0.05或P<0.01）。在扭體法中，錦帶花乙酸乙酯提取物0.50 g/kg劑量組給藥后21～30 min，>31～40 min和>41～50 min，1g/kg劑量組給藥后31～40 min和41～50 min以及2.00 g/kg劑量組給藥后11～50 min 4個(gè)時(shí)間段的扭體反應(yīng)數(shù)分別比生理鹽水組明顯減少（P<0.05或P<0.01），扭體反應(yīng)抑制率顯著提高。由此得出結(jié)論：錦帶花乙酸乙酯提取物對(duì)小鼠具有一定的鎮(zhèn)痛作用，且以2.00 g/kg劑量的鎮(zhèn)痛效果最佳。鹽酸曲馬多具有顯著的鎮(zhèn)痛作用。

關(guān)鍵詞：錦帶花；乙酸乙酯提取物；鎮(zhèn)痛作用

基金項(xiàng)目：大連大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201911258184）

疼痛是一種復(fù)雜的生理心理活動(dòng)，即機(jī)體對(duì)傷害性刺激產(chǎn)生的痛感覺(jué)和痛反應(yīng)，是臨床常見(jiàn)癥狀之一，因而鎮(zhèn)痛也是臨床面臨的重要問(wèn)題之一。目前應(yīng)用的鎮(zhèn)痛藥主要包括以嗎啡為代表的阿片類(lèi)麻醉性鎮(zhèn)痛藥和以阿司匹林為代表的非甾體解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，其在選擇性抑制和緩解各種疼痛、解除患者病痛方面發(fā)揮了巨大作用，但反復(fù)應(yīng)用過(guò)程中，阿片類(lèi)藥物易產(chǎn)生成癮性，非甾體抗炎藥會(huì)有消化性潰瘍等不良反應(yīng)。這些都促使人們積極地去尋找有效且副作用小的鎮(zhèn)痛藥物。我國(guó)傳統(tǒng)中藥主要來(lái)源于天然藥及其加工品，藥材豐富，毒副作用和不良反應(yīng)相對(duì)較少，因此，許多學(xué)者圍繞著從中藥中尋找鎮(zhèn)痛效果良好且恰當(dāng)?shù)逆?zhèn)痛藥展開(kāi)工作。中藥錦帶花（Weigela florida）屬忍冬科植物，在我國(guó)東北、河北、山東、山西和江蘇北部等地廣泛分布[1]，是東北、華北地區(qū)主要的早春花灌木之一，具有觀賞、食用[2]、蠶絲印染[3]等價(jià)值，而在藥用方面，研究認(rèn)為其具有涼血、清熱、解毒、止痛、活血等功效，主要用于瘟病初起、咽喉腫痛、感冒發(fā)熱、丹毒等癥治療[4]。此外，錦帶花還具有抑菌[5-6]、抗流感病毒[7-8]等方面的作用。本課題組以錦帶花中藥學(xué)方面的功效為基礎(chǔ)，對(duì)其進(jìn)行了系列研究，旨在探討錦帶花乙酸乙酯提取物的鎮(zhèn)痛作用。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠100只，清潔級(jí)，體重19～23 g，5～6周齡，雌雄兼用，購(gòu)于大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（遼）2018—0003。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格執(zhí)行國(guó)家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用指南。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與儀器

在大連大學(xué)校園內(nèi)采集錦帶花，由大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)教授高松鑒定。鹽酸曲馬多注射液（多多藥業(yè)有限責(zé)任公司），冰醋酸（西隴化工股份有限公司），YLS-6B智能熱板儀（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站），KDM（A）自動(dòng)恒溫電熱套（天津泰斯特儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE—2000A（鞏義市予華儀器有限公司）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 制備錦帶花乙酸乙酯提取物

錦帶花干燥藥材50.00 g，適度粉碎，2 L 75%乙醇浸泡24 h，70 ℃自動(dòng)恒溫電熱套加熱回流提取2 h，提取過(guò)濾液；1 L 75%乙醇繼續(xù)加熱回流1 h，回流液過(guò)濾，棄固體錦帶花留濾液。合并兩次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀少量多次回收乙醇，將揮發(fā)乙醇后所得溶液倒入分液漏斗，加適量環(huán)己烷萃取，萃取步驟重復(fù)4次后將萃取液換成乙酸乙酯，重復(fù)萃取5次后放于烘干箱烘干，得膏狀藥物4.80 g（每克膏狀藥物相當(dāng)于10.42 g原藥），于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 小鼠熱板法疼痛模型的制備及實(shí)驗(yàn)

取雌性小鼠數(shù)只，先測(cè)量每只小鼠的給藥前痛閾值，即將小鼠分別置于測(cè)痛儀（55.0±0.5）℃的熱板上，至小鼠出現(xiàn)舔后足為止，此段時(shí)間為痛閾值。凡小鼠在30 s內(nèi)不舔后足或者逃避、跳躍者舍棄。每鼠測(cè)兩次痛閾值并取其均值為給藥前痛閾值。挑選給藥前痛閾值30 s內(nèi)的小鼠50只，隨機(jī)分5組，即錦帶花乙酸乙酯提取物2.0、1.0、0.5 g/kg劑量組，鹽酸曲馬多0.04 g/kg劑量組和生理鹽水組，每組10只，給小鼠分別以0.2 mL/10 g灌胃不同劑量的錦帶花乙酸乙酯提取物、0.2%鹽酸曲馬多注射液及等容積生理鹽水。給藥后15、30、45、60、75、90 min各測(cè)一次小鼠痛閾值至90 min為止[9]。

1.3.3 小鼠扭體法疼痛模型的制備及實(shí)驗(yàn)

取雌雄各半小鼠數(shù)只，1%冰醋酸溶液10 mL/kg，腹腔注射[10]。挑選在注射冰醋酸后的10 min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)的小鼠50只，分組及給藥同熱板法。給藥后觀察每隔10 min（11～20 min、21～30 min、31～40 min、41～50 min）內(nèi)的小鼠扭體反應(yīng)數(shù)至50 min為止。并按下式計(jì)算扭體反應(yīng)抑制率：

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（_

x±s）表示，采用t檢驗(yàn)對(duì)兩組間數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 錦帶花乙酸乙酯提取物對(duì)小鼠痛閾值的影響

由表1可見(jiàn)，與生理鹽水組比較，錦帶花乙酸乙酯提取物1.00 g/kg灌胃給藥后60 min和2.00 g/kg給藥后30、45、 60 min的痛閾值高于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與給藥前比較，1.00 g/kg給藥后45、60 min和2.00 g/kg給藥后15～60 min的痛閾值分別高于各自給藥前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)果表明錦帶花乙酸乙酯提取物對(duì)小鼠具有一定的鎮(zhèn)痛作用，以2.00 g/kg效果較佳。

鹽酸曲馬多0.04 g/kg灌胃給藥后不同時(shí)間的痛閾值與生理鹽水組比較以及各時(shí)間給藥后與給藥前比較均明顯提高，差異具有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果表明鹽酸曲馬多對(duì)小鼠有明顯的鎮(zhèn)痛作用。

2.2 錦帶花乙酸乙酯提取物對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響

由表2可知，錦帶花乙酸乙酯提取物0.50 g/kg灌胃給藥后21～30 min、31～40 min和41～50 min，1.00 g/kg給藥后31～40 min和41～50 min時(shí)間段以及2.00 g/kg給藥后10～50 min的5個(gè)時(shí)間段，小鼠扭體反應(yīng)數(shù)分別與生理鹽水組比較明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），扭體抑制率顯著提高。結(jié)果表明錦帶花乙酸乙酯提取物對(duì)小鼠具有一定的鎮(zhèn)痛作用，且以2.00 g/kg效果為佳。

鹽酸曲馬多0.04 g/kg灌胃給藥后不同時(shí)段的扭體反應(yīng)數(shù)與生理鹽水組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。表明鹽酸曲馬多對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛作用顯著。

3 討論

在臨床上，疼痛伴隨著多種疾病而出現(xiàn)，象征著危險(xiǎn)，促使人們緊急行動(dòng)，避險(xiǎn)去害。疼痛時(shí)機(jī)體常伴有恐懼、緊張、不安等情緒活動(dòng)，而劇烈疼痛還可導(dǎo)致生理功能紊亂，甚至引發(fā)休克而致命。因此，適當(dāng)使用鎮(zhèn)痛藥以緩解疼痛是非常必要的。臨床上常用的阿片類(lèi)鎮(zhèn)痛藥和非甾體抗炎藥的副作用是明確的，因此，尋找有效且副作用較小的鎮(zhèn)痛藥具有實(shí)際意義。中藥藥材豐富，毒副作用和不良反應(yīng)相對(duì)較少。錦帶花作為傳統(tǒng)中藥，具有清熱、解毒、止痛等效果，近年的研究還表明其具有抑菌、抗流感病毒等方面的作用。以此為基礎(chǔ)，本研究初步探討了其乙酸乙酯提取物的鎮(zhèn)痛作用。

在鎮(zhèn)痛藥物的研究中，多采用動(dòng)物致痛模型實(shí)驗(yàn)來(lái)篩選具有鎮(zhèn)痛作用的化合物以及評(píng)價(jià)鎮(zhèn)痛藥物的藥效強(qiáng)度。本研究采用的物理致痛法、小鼠熱板法、化學(xué)致痛法和醋酸扭體法，是鎮(zhèn)痛藥物外周鎮(zhèn)痛效果評(píng)價(jià)和篩選的常用經(jīng)典動(dòng)物模型，以此來(lái)觀察藥物對(duì)急性非特異性炎性反應(yīng)的抗炎及鎮(zhèn)痛效果。本研究過(guò)程中嚴(yán)格控制各種影響因素，研究指標(biāo)觀察統(tǒng)一，數(shù)據(jù)處理采用通用的統(tǒng)計(jì)方法，因而研究結(jié)果可信、可靠。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)錦帶花乙酸乙酯提取物2.00、1.00、0.50 g/kg給予小鼠灌胃后，痛閾值有一定程度的提高；給藥后小鼠扭體反應(yīng)數(shù)降低，扭體抑制率提高，表明錦帶花乙酸乙酯提取物對(duì)小鼠具有一定的鎮(zhèn)痛作用，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)看2.00 g/kg鎮(zhèn)痛效果更為明顯。鹽酸曲馬多作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，其痛閾值提高和扭體反應(yīng)數(shù)降低的改變均是顯著的，說(shuō)明鹽酸曲馬多的鎮(zhèn)痛作用明確、顯著。

目前，對(duì)于錦帶花的研究以栽培育種方面居多[11-12]，也有其對(duì)空氣質(zhì)量影響的研究報(bào)道[13]，但藥用方面研究甚少。有資料報(bào)道，在錦帶花乙酸乙酯提取物化學(xué)成分研究中，發(fā)現(xiàn)其成分主要為槲皮素（quercetin，I）、原兒茶酸（protocatechuic，II）、莨菪亭（Scopoletin ，III）等[14]，提示錦帶花乙酸乙酯提取物除了鎮(zhèn)痛作用外，可能還具有祛痰、止咳、平喘等作用，有待于進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)語(yǔ)

錦帶花乙酸乙酯提取物鎮(zhèn)痛作用研究是對(duì)錦帶花進(jìn)行系列研究的一部分，是對(duì)錦帶花藥理作用研究空白的填補(bǔ)。有關(guān)錦帶花乙酸乙酯提取物的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制及其鎮(zhèn)痛作用部位等問(wèn)題，將在下一步的工作中進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。

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Study on analgesic effect of extracts from Weigela Florida Ethyl Acetate

Li Jiani， Ying Zilan， Dai Xin， Cui Yufang， Luo Xueya

（Medical College， Dalian University， Liaoning 116622， China）

Abstract：In order to study the analgesic effect of Weigela Florida ethyl acetate extract on mice， ethyl acetate extract of Weigela Florida was prepared by ethyl acetate extraction. The hot plate method and writhing method were used to establish the pain animal model. 100 male and female mice were randomly divided into 2.00， 1.00 and 0.50 g/kg group， tramadol hydrochloride with 0.04 g/kg group. 10 rats in each group were given intragastric administration. The pain threshold of mice at different time points and the numbers of writhing reactions in different time periods were observed. The analgesic effect of ethyl acetate extract from broccoli was evaluated according to the changes of pain threshold and writhing reaction numbers. The results showed that in the hot plate method， the pain threshold of 1.00 g/kg ethyl acetate extract group at 60 min and 2.00 g/kg group at 30， 45 and 60 min after administration was higher than that in normal saline group； the pain threshold of 1.00 g/kg ethyl acetate extract group at 45， 60 min and 2.00 g/kg group at 15～60 min after administration was higher than that before administration respectively（P<0.05 or P<0.01）. In the writhing method， the numbers of writhing reaction 0.50 g/kg of ethyl acetate extract group were significantly decreased in the four time periods that 21～30 min， 31～40 min and 41～50 min， 1.00 g/kg group in 31～40 min and 41～50 min， and 2.00 g/kg group in 10～50 min（P<0.05 or P<0.01）， and the inhibition rates of writhing reaction were significantly increased. The conclusion is drawn that the ethyl acetate extract of broccoli has certain analgesic effect on mice， and the analgesic effect of 2.00 g/kg is the best. Tramadol hydrochloride has significant analgesic effect.

Key words：Weigela florida； ethyl acetate extract； analgesic effect