基于SNP標(biāo)記的西瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

易麗聰 王運(yùn)強(qiáng) 焦春海 姚明華 龔鈺 王舒景 戴照義

摘? ? 要：種質(zhì)資源遺傳背景狹窄是當(dāng)前西瓜育種面臨的一大瓶頸。利用449個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)64份西瓜材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，平均多態(tài)性信息含量（PIC）為0.229，平均Neis多樣性指數(shù)（H） 為0.28，平均Shannon 多樣性指數(shù)（I）為 0.43，平均期望雜合度（He）為0.282;64份材料的最優(yōu)群體結(jié)構(gòu)數(shù)為4，各亞群材料的地理來源與遺傳關(guān)系沒有顯著相關(guān)性;材料之間的平均遺傳距離為0.175。農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)分析表明，4個(gè)亞群在首雌花節(jié)位、坐果節(jié)位和果皮厚度3個(gè)性狀之間存在顯著差異。本研究將為西瓜種質(zhì)資源創(chuàng)制、雜交育種的親本選擇和培育優(yōu)異、適應(yīng)性強(qiáng)的西瓜新品種提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：西瓜;種質(zhì)資源;遺傳多樣性;SNP標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S651 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2020）12-008-06

Abstract： Watermelon is an important fruit in China， the narrow genetic background of germplasm resources is a bottleneck problem in watermelon breeding， 449 SNP markers were used to analyze the genetic diversity of 64 watermelon germplasms in this research. The results showed that， the average polymorphism information content （PIC） was 0.229， the average Nei's diversity index （H） was 0.28， the average Shannon's information index （I） was 0.43， and the average expected heterozygosity （He） was 0.282. The optimal subgroup number was 4， however， no significant correlation was found between the subpopulation and geographic origin. The average genetic distance between the 64 watermelon accessions was 0.175. According to the agronomic traits statistical analysis， the traits of the first female flower node， fruiting node and rind thickness were observed significant differences among the four subgroups. The results of this study will provide theoretical guidance for the creation of watermelon germplasm resources， the selection of parents in cross breeding and the breeding of new watermelon varieties with excellent and strong adaptability.

Key words： Watermelon; Germplasm; Genetic diversity; SNP markers

西瓜原產(chǎn)于非洲，在我國有上千年的栽培馴化歷史，不同生態(tài)區(qū)馴化產(chǎn)生了一系列形態(tài)特征差異明顯、各具特色的地方品種，如華北地區(qū)的‘三白瓜、蘭州的‘大花皮和江浙地區(qū)的‘馬鈴瓜等[1]。近年來，西瓜的種植面積和范圍迅速擴(kuò)大，成為重要的經(jīng)濟(jì)作物。目前，我國西瓜總生產(chǎn)面積達(dá)150萬hm2，面積、產(chǎn)量和銷量均居世界第一（FAOSTAT）。但是，長期的人工選擇和馴化也帶來許多問題，最突出的是育種材料遺傳多樣性狹窄[2-3]，從而導(dǎo)致品種同質(zhì)化嚴(yán)重，培育突破性新品種日益困難。

明確育種材料的遺傳背景有助于雜交育種中親本的選擇，進(jìn)而提高培育雜種優(yōu)勢(shì)明顯的新品種的效率。20世紀(jì)80年代，分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)迅速推動(dòng)了對(duì)植物各性狀調(diào)控基因的定位、克隆和分子機(jī)制的解析[4-6]。在許多作物中與抗病、雄性不育、生育期等重要性狀相關(guān)的分子標(biāo)記已經(jīng)應(yīng)用[7-10]。利用分子標(biāo)記進(jìn)行材料的遺傳背景鑒定和種質(zhì)資源核酸指紋構(gòu)建也在大部分植物中展開[11-13]。

西瓜是較早完成基因組測序的植物之一[14]，北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心基于對(duì)西瓜屬7個(gè)種的414份資源的基因組重測序共鑒定出19 725 853個(gè)SNPs和6 675 290個(gè)InDels（Insertion-Deletion）標(biāo)記[15]。該結(jié)果為西瓜種質(zhì)資源鑒定、核酸指紋圖譜構(gòu)建和基因定位提供了豐富的分子標(biāo)記。在此基礎(chǔ)上，筆者挑選了覆蓋西瓜11條染色體的449個(gè)SNP位點(diǎn)，利用高通量SNP分型對(duì)64份西瓜自交系材料進(jìn)行遺傳背景鑒定，解析其遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，為西瓜雜交育種的親本選配和資源利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

64份西瓜自交系材料為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所收集并保存，材料編號(hào)、名稱和來源見表1。

1.2 表型性狀調(diào)查

64份自交系材料的表型數(shù)據(jù)引用戴照義等[16]，這些材料于2013 年春季種植在湖北省農(nóng)科院蔬菜基地，每份材料定植20株，坐瓜方式采用人工輔助授粉。性狀描述、數(shù)據(jù)采集和記錄參照《西瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[17]，每份材料取10株?duì)顟B(tài)良好、生長一致的植株進(jìn)行性狀采集?？扇苄怨绦挝锖坑墒殖质秸酃鈨x測定。

1.3 分子標(biāo)記和基因型分析

SNP位點(diǎn)信息來源于公開發(fā)表的文獻(xiàn)[15]和葫蘆科作物基因組數(shù)據(jù)庫 （CuGenDB）（ftp：//cucurbitgenomics.org/pub/cucurbit/reseq/watermelon/v2/）。選取在西瓜11條染色體上均勻分布的449個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行測檢和分析。

2019年11月對(duì)64份西瓜資源進(jìn)行浸種催芽（55 ℃溫湯浸種，32 ℃溫箱催芽），取1～2 cm長胚根，采用CTAB法提取總DNA，該試驗(yàn)在蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。隨后將DNA送至武漢基諾賽克科技有限公司進(jìn)行后續(xù)檢測和分析，主要步驟如下：首先用Qubit 3.0檢測DNA質(zhì)量和濃度;再通過多重PCR捕獲目標(biāo)SNP位點(diǎn);最后利用Illumina 2500平臺(tái)進(jìn)行SNP分型。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Cervus 3.0.7 軟件計(jì)算多態(tài)性信息含量（PIC）。使用POPGENE 1.32 軟件計(jì)算Nei's基因多樣性指數(shù)（H）、Shannon 信息指數(shù)（I）和期望雜合度（He）。使用STRUCTURE 2.3.4軟件[18]對(duì)64份材料進(jìn)行亞群劃分，burnin period 和MCMC iterations 參數(shù)分別為 10 000和100 000，亞群數(shù)目（K）設(shè)置為1～10個(gè)，每個(gè)K值獨(dú)立運(yùn)算10次，根據(jù)ΔK法確定最佳亞群數(shù)。根據(jù)最大遺傳比例進(jìn)行亞群歸類。使用PLINK 1.9[19]軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）。利用MEGA 7.0.14 [20]軟件計(jì)算材料的遺傳距離，構(gòu)建基于遺傳距離的UPGMA聚類樹和基于SNP的系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育樹采用NJ（Neighbor-Joining）法，Bootstrap值設(shè)置為1 000。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukeys多重比較統(tǒng)計(jì)性狀差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性

利用高通量SNP分型的方法對(duì)64份普通栽培西瓜材料進(jìn)行檢測，共檢測到449個(gè)具有多態(tài)性的有效SNP位點(diǎn)，每條染色體的SNP位點(diǎn)見表2。所有位點(diǎn)均包含2個(gè)等位基因，位點(diǎn)PIC值在0.015～0.375之間，平均0.229。Neis 基因多樣性指數(shù)（H）在 0.016～0.500之間，平均0.28。平均Shannon 信息指數(shù)（I）為 0.43。期望雜合度（He）在0.016～0.504之間，平均0.282。

2.2 群體結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)449個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，ΔK法確定64份材料的最佳亞群數(shù)為4（G1、G2、G3和G4）（圖1），4個(gè)亞群分別包含9份、18份、25份和12份材料。來源于美國的材料E63（‘Crimson Sweet）劃分到G1亞群（G1群組比例為0.998）。在所有亞群中，G3亞群材料的遺傳背景最為混雜。64份材料主要來源于江蘇（29份）、河南（20份）、臺(tái)灣（8份）和新疆（5份），對(duì)亞群和材料的來源地進(jìn)行獨(dú)立性測驗(yàn)，結(jié)果表明，亞群的劃分與材料來源無顯著相關(guān)性。

2.3 PCA分析

對(duì)64份西瓜材料進(jìn)行主成分分析，前2個(gè)主成分分別解釋16.96% 和13.91%的變異（圖2）。PCA分析與群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果的一致性較好，其中G3亞群的材料不能完全區(qū)分，部分散落在G1和G4亞群中，但G1、G2和G4亞群之間可以完全區(qū)分開。

2.4 聚類分析

64份材料之間的遺傳距離在0.000～0.393之間，平均0.175。材料E33（‘JQ33）和E63（‘Crimson Sweet）遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.393，分別屬于G4亞群和G1亞群。相互之間遺傳距離為0的材料較多，在G2、G3和G4亞群內(nèi)部均有相似度極高的材料。根據(jù)遺傳距離構(gòu)建UPGMA聚類樹，64份材料被劃分為7類（圖3-A）：其中G2和G4亞群的聚類效果最好，分別聚集在Ⅶ類和Ⅳ類;G1亞群材料可進(jìn)一步劃分為3類（Ⅰ-Ⅲ）;G3亞群大部分材料聚類在一起（Ⅵ類），有少部分分散在其他類中。根據(jù)SNP數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，64份材料可以劃分為7個(gè)大的分枝（圖3-B），其中G2和G4亞群的材料分別聚類在分枝Ⅰ和分枝Ⅶ，G1和G3亞群的少部分材料聚類在一起或混在其他亞群中。基于遺傳距離的UPGMA聚類和基于SNP的系統(tǒng)發(fā)育樹一致性較好。

2.5 亞群性狀變異分析

利用單因素方差分析和多重比較檢測不同亞群部分農(nóng)藝性狀的差異，包括首雌花節(jié)位、坐果節(jié)位、果皮厚度、中心可溶性固形物含量和種子千粒重。結(jié)果表明，4個(gè)亞群的中心可溶性固形物含量和種子千粒重沒有顯著性差異，但在首雌花節(jié)位、坐果節(jié)位和果皮厚度上存在顯著差異（圖4）。G1、G2、G3和G4亞群的平均首雌花節(jié)位分別為10.2±1.9節(jié)、9.6±1.2節(jié)、7.8±1.3節(jié)和8.2±0.9節(jié)，G3和G4亞群首雌花節(jié)位極顯著低于G1和G2。G1、G2、G3和G4亞群的平均坐果節(jié)位分別為18.2±5.3節(jié)、13.1±2.6節(jié)、18.1±3.6節(jié)和17.9±1.9節(jié)，G2亞群的平均坐果節(jié)位極顯著低于其他3個(gè)亞群。4個(gè)亞群的平均果皮厚度分別為1.01±0.29、1.01±0.17、0.78±0.21和0.72±0.30 cm，G4亞群的平均果皮厚度顯著小于G1和G2亞群，同時(shí)G3亞群的平均果皮厚度極顯著小于G2亞群。

3 討論與結(jié)論

遺傳多樣性豐富的種質(zhì)資源是創(chuàng)造優(yōu)異新品種的基礎(chǔ)。西瓜作為外來引入物種，早期育種可用的資源并不多，導(dǎo)致現(xiàn)有大部分西瓜品種遺傳背景狹窄，差異化程度低。分子標(biāo)記技術(shù)是鑒定和評(píng)價(jià)西瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的有效手段，對(duì)于挖掘和利用優(yōu)異西瓜種質(zhì)、拓寬育種材料遺傳背景和提高育種效率有重要意義。

西瓜基因組序列和重測序數(shù)據(jù)的公布，極大地促進(jìn)了西瓜種質(zhì)分子鑒定和分子輔助育種的進(jìn)程[14-15]。張海英等[21]利用23對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)西瓜屬全部7個(gè)種的1 197份資源進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)估，發(fā)現(xiàn)1 197份資源的平均Neis 基因多樣性指數(shù)為0.56，Shannon 信息指數(shù)平均為 0.99，期望雜合度值平均為0.56。郭祿芹等[22]利用SSR標(biāo)記對(duì)來源于美國、中國 、南非、印度、加納和尼日利亞、土耳其、日本等國家的167份西瓜資源進(jìn)行研究，表明167份西瓜的平均Shannon 信息指數(shù)和平均期望雜合度分別為0.94和0.52。筆者基于SNP標(biāo)記對(duì)63份西瓜國內(nèi)來源和1份美國來源（表1）的自交系材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，其平均Neis 基因多樣性指數(shù)、平均Shannon 信息指數(shù)和平均期望雜合度分別為0.28、0.43和0.282。通過比較發(fā)現(xiàn)，本研究得出的材料間遺傳多樣性明顯偏低，主要原因是本研究選用的材料幾乎全為國內(nèi)育成的商業(yè)品種，而前人則是利用來源更為廣泛的資源，包括近緣種、野生種、半野生種、國外品種和地方品種等。因此，進(jìn)一步收集種類豐富的國內(nèi)外地方品種進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)價(jià)對(duì)西瓜資源的開發(fā)利用更有理論指導(dǎo)意義。此外，上述結(jié)果表明，國內(nèi)西瓜品種改良還有很大空間，通過引入國外品種和充分利用來源更為廣泛的地方種、野生種質(zhì)等創(chuàng)制新的育種材料將有效提高我國西瓜品種的多樣性。

分類學(xué)上將栽培西瓜劃分為4個(gè)生態(tài)型：東亞型、美國型、新疆-俄羅斯型和中國華北型[1]。本研究的群體結(jié)構(gòu)分析表明，64份西瓜的最優(yōu)亞群數(shù)為4（圖1），其中G3亞群有較大部分資源的遺傳背景較為混雜。通過分析各亞群材料的來源地，發(fā)現(xiàn)亞群的劃分與地區(qū)來源無顯著相關(guān)性（p = 0.339），說明國內(nèi)育種資源交流較為頻繁。本研究中唯一的國外資源E63（‘Crimson sweet，美國）被劃分到G1亞群，其G1亞群比例為0.998，該亞群其他8份資源的G1群組比例在0.731～0.470之間，說明該亞群材料主要為美國生態(tài)型血統(tǒng)。由于缺乏明確的其他生態(tài)型材料，故而不能確定其他3個(gè)亞群材料的血統(tǒng)組成。對(duì)64份材料的5個(gè)農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，不同亞群材料的中心可溶性固形物含量和種子千粒重沒有顯著差異，但首雌花節(jié)位、坐果節(jié)位和果皮厚度存在顯著性差異。該結(jié)果體現(xiàn)了高糖、較小籽粒等與品質(zhì)相關(guān)的性狀是共同的育種目標(biāo)，但由于各地區(qū)的氣候差異，熟性和耐裂性等與適應(yīng)性相關(guān)的性狀有所不同。

綜上所述，本研究利用分布于西瓜全基因組的449個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)64份栽培西瓜進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，大部分國內(nèi)資源的遺傳背景相似，且不同地區(qū)之間存在相似度極高的材料。因此，在未來的西瓜雜交育種和改良中應(yīng)在了解和掌握親本材料性狀特征和遺傳背景的基礎(chǔ)上，引入遺傳多樣性更為豐富的野生資源、國外品種和地方品種，適當(dāng)拓寬親本間的遺傳距離。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，中國園藝學(xué)會(huì)西甜瓜專業(yè)委員會(huì)，中國園藝學(xué)會(huì)西甜瓜協(xié)會(huì)，等.中國西瓜甜瓜[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000：20-21.

[2] WU S，WANG X，REDDY U，et al.Genome of ‘Charleston Gray，the principal American watermelon cultivar，and genetic characterization of 1365 accessions in the U.S.National Plant Germplasm System watermelon collection[J].Plant Biotechnology Journal，2019，17（12）：2246-2258.

[3] ZHANG H Y，WANG H，GUO S G，et al.Identification and validation of a core set of microsatellite markers for genetic diversity analysis in watermelon，Citrullus lanatus （Thunb.）Matsum.& Nakai[J].Euphytica，2012，186（2）：329-342.

[4] INGHELANDT D，MELCHINGER A E，LEBRETON C，et al.Population structure and genetic diversity in a commercial maize breeding program assessed with SSR and SNP markers[J].Theoretical and Applied Genetics，2010，120（7）：1289-1299.

[5] GAO Q，YUE G D，LI W Q，et al.Recent progress using high-throughput sequencing technologies in plant molecular breeding[J].Journal of Integrative Plant Biology，2012，54（4）：215-227.

[6] CHEN H D，XIE W B，HE H，et al.A high-density SNP genotyping array for rice biology and molecular breeding[J].Molecular Plant，2014，7（3）：541-553.

[7] 朱玉君，樊葉楊，王惠梅，等.應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇培育兼抗稻瘟病和白葉枯病的水稻恢復(fù)系[J].分子植物育種，2014，12（1）：17-24.

[8] 王飛名，孔德艷，劉國蘭，等.分子標(biāo)記輔助選擇改良‘黃華占的褐飛虱抗性與抗旱性[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2020，36（3）：9-14.

[9] 李怡斐，蔣曉英，張世才，等.加工型辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育育性基因分子標(biāo)記及輔助育種[J].分子植物育種，2016，14（4）：946-952.

[10] 宋偉，蘇愛國，邢錦豐，等.京724玉米自交系S型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系分子標(biāo)記輔助選育研究[J].玉米科學(xué)，2016，24（1）：33-36.

[11] GARCIA-MAS J，OLIVER M，GOMEZ-PANIAGUA H，et al.Comparing AFLP，RAPD and RFLP markers for measuring genetic diversity in melon[J].Theoretical and Applied Genetics，2000，101（5/6）：860-864.

[12] 劉軍，許美榮，趙志偉，等.絲瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR與SRAP分析[J].中國瓜菜，2010，23（2）：1-4.

[13] NINJUDENWAR N，AWUKU F J，DIERS B，et al.Genetic diversity，population structure and key phenotypic traits driving variation within soybean （Glycine max） collection in Ghana[J].Plant Breeding，2019，138（5）：577-587.

[14] GUO S G，ZHANG J G，SUN H H，et al.The draft genome of watermelon （Citrullus lanatus）and resequencing of 20 diverse accessions[J].Nature genetics，2013，45（1）：51-58.

[15] GUO S G，ZHAO S J，SUN H H，et al.Resequencing of 414 cultivated and wild watermelon accessions identifies selection for fruit quality traits[J].Nature Genetics，2019，51（11）：1616-1623.

[16] 戴照義，王運(yùn)強(qiáng)，劉志雄，等.西瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析[J].中國瓜菜，2015，28（6）：5-9.

[17] 馬雙武，劉君璞，王吉明，等.西瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：9-53.

[18] PRITCHARD J K，STEPHENS M，DONNELLY P.Inference of population structure using multilocus genotype data[J].Genetics，2000，155（2）：945-959.

[19] SHAUN P，BENJAMIN N，KATHE T B，et al.PLINK：a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses[J].The American Journal of Human Genetics，2007，81（3）：559-575.

[20] KUMAR S，STECHER G，TAMURA K.MEGA7：Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J].Molecular biology and evolution，2016，33（7）：1870-1874.

[21] ZHANG H Y，F(xiàn)AN J G，GUO S G，et al.Genetic diversity，population structure， and formation of a core collection of 1197 Citrullus accessions[J].HortScience，2016，51（1）：23-29.

[22] 郭祿芹，趙世豪，朱華玉，等.167份西瓜種質(zhì)材料的遺傳多樣性分析[J].中國瓜菜，2018，31（1）：5-11.