大孔樹脂純化薜荔莖總黃酮的工藝研究

王曉華 韋漢燕 桂勁松 韋巧慧

【摘?要】?目的：研究AB-8大孔樹脂純化薜荔莖總黃酮的工藝條件。 方法：采用紫外分光光度法測定薜荔莖中總黃酮的含量。以靜態(tài)吸附和動態(tài)解吸為考察指標(biāo)，確定了薜荔莖中總黃酮純化的最佳工藝參數(shù)。 結(jié)果： AB-8型大孔吸附樹脂純化薜荔莖總黃酮的優(yōu)化工藝條件為：上樣濃度為0.5g生藥材/mL，樣品溶液pH為7，上樣量為14BV，上樣速度為1mL/min，靜態(tài)吸附4h。先用5BV的蒸餾水沖洗，然后用8BV 70%乙醇以1mL/min的速度洗脫大孔樹脂。經(jīng)AB-8樹脂處理后的薜荔莖總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)64.32%。 結(jié)論：優(yōu)化的純化工藝穩(wěn)定可行，可以用于純化薜荔莖中的總黃酮。

【關(guān)鍵詞】?薜荔;總黃酮;大孔樹脂;純化

【中圖分類號】R284.2?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2020）24-0034-05

Abstract：Objective To investigate the technology of purification of total flavonoids from the stem of Ficus pumila L.by AB-8 macroporous resin. Methods The content of total flavonoids in the stem of Ficus pumila L. was measured by UV ， dynamic adsorption and static adsorption were took as index to optimize the technology of purification of total flavonoids. Results The optimal purification conditions were as follows： The concentration of sample was 0.5g/mL ， sample pH value was 7， sample volume was 14 column volume， the flow rate was 1mL/min， statically adsorb 4h， rinse with 5 column volume distilled water for impurities， the macroporous resin was eluted with 8 column volume of 70% ethanol at a rate of 1mL/min. The purity of total flavonoids increased to 64.32%. Conclusions Optimal purification technology is stable and reliable， which is suitable for purification of the total flavonoids from the stem of Ficus pumila L.

Keywords：Ficus pumila L.; Total Flavonoids;Macroporous Resin; Purification

薜荔（Ficus pumila L.）來源于?？崎艑賉1]，主要分布在廣西、湖南、四川等省區(qū)，其有相當(dāng)膨大的成熟花托，像無花果，俗稱“鬼球、鬼饅頭”，最早于明朝的《本草綱目》中記載。薜荔在我國藥用歷史悠久，根、莖、葉和果實為藥用部位，具有祛風(fēng)除濕、固腎填精、活血通絡(luò)、消炎解毒、抗菌、增強免疫力、抗腫瘤、抗感染、消炎鎮(zhèn)痛、驅(qū)蟲等作用[2]。近年研究結(jié)果顯示，薜荔植株的各部位均含有黃酮類物質(zhì)，尤以莖部含量豐富。黃酮類化合物是一類有抗氧化作用的化合物，其生理活性強，能抗動脈硬化，降低膽固醇，抗痙攣、抗輻射[3]。薜荔植株中的黃酮含量頗高，具有很高的開發(fā)利用價值，但目前缺乏對薜荔莖中黃酮類成分的研究。本實驗選擇AB-8大孔吸附樹脂，通過靜態(tài)吸附和動態(tài)解吸試驗，篩選出薜荔莖總黃酮純化的最佳工藝條件，為薜荔莖總黃酮的開發(fā)利用提供參考。

1?儀器與材料

1.1?材料?薜荔莖藥材，購自廣西桂林中草藥批發(fā)市場，經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院王曉華副教授鑒定為?？崎艑俎道驠icus pumila Linn的干燥莖;蘆丁對照品（中國藥品生物制品鑒定所）;亞硝酸鈉（AR 汕頭市西隴化工股份有限公司，批號：130902）;九水合硝酸鋁（AR 汕頭市西隴化工股份有限公司，批號：140304）;氫氧化鈉（AR 武漢宏大化學(xué)試劑廠）;AB-8型大孔樹脂（天津市海光化工有限公司）。

1.2?主要儀器?CP225D電子分析天平;SHZ-B水浴恒溫振蕩器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;UV-1600PC型紫外可見分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）;SHB-IIIT循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）;RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

2?方法與結(jié)果

2.1?薜荔莖總黃酮的測定

2.1.1?對照品溶液的制備?精密稱取蘆丁對照品10.05mg干燥至恒重，置于50mL容量瓶中，用70%乙醇溶液溶解，稀釋至刻度，搖勻，即濃度為0.201mg/mL溶液。

2.1.2?最大吸收波長的確定?準(zhǔn)確吸取蘆丁對照品溶液1.0mL，置于25mL容量瓶中，加入5%的亞硝酸鈉溶液1.0mL將其振蕩后靜置6min，加入1.0mL的10%硝酸鋁溶液，將其振蕩放置6min后加入4.0mL的4%氫氧化鈉溶液，最后用70%乙醇溶液調(diào)至刻度線[4]，振勻放置15min顯色。以不含對照品溶液的相應(yīng)試劑作為空白對照，測定200～800nm 掃描波長范圍內(nèi)的吸光度，得到最大吸收波長為503nm。因此，以503nm作為測量波長。

2.1.3?線性關(guān)系的確定?準(zhǔn)確吸取蘆丁對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，置于25mL容量瓶中，照“2.1.2”項下方法，以對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，測定503nm處的吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=10.382 C+0.0034（r=0.9993），結(jié)果如圖1所示。蘆丁濃度為0～0.0482mg/mL時線性關(guān)系較好。

2.1.4?薜荔莖提取液的制備?將薜荔莖藥材粉碎，過80目篩。取100g薜荔莖粉末，置2000mL圓底燒瓶中，加入十倍量70%乙醇浸漬30min，裝上冷凝回流裝置，加熱回流提取共3次，每次1h，趁熱抽濾[5]，最后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至濃度為1g生藥材/mL薜荔莖提取液，作為樣品溶液。

2.1.5?薜荔莖總黃酮的含量測定?精密吸取1.0mL薜荔莖提取液，用70%乙醇稀釋至10mL，搖勻，再從中吸取0.5mL放置于25mL容量瓶中。然后按“2.1.2”項下方法加入顯色試劑，以70%乙醇和相應(yīng)的顯色劑為空白，測定503nm處的吸光度值，并根據(jù)回歸方程計算總黃酮含量[6]。得薜荔莖總黃酮含量為6.25mg/mL。

2.2?大孔樹脂的預(yù)處理?取適量的AB-8大孔樹脂置于燒杯中，用適量95%酒精浸漬AB-8大孔樹脂24h， 使其充分膨脹后采取濕法進(jìn)行裝柱，用95%酒精動態(tài)沖洗樹脂，再用蒸餾水將樹脂沖洗直到嗅不到酒精味;將5%鹽酸加到柱子里浸泡樹脂2h后用蒸餾水動態(tài)沖洗樹脂使洗脫液的pH值呈中性， 然后將5% NaOH溶液加到柱子中浸泡樹脂2h后用蒸餾水動態(tài)沖洗樹脂至洗脫液呈中性;用95% 乙醇沖洗樹脂使洗脫液與水混合（1∶5）至無白濁現(xiàn)象產(chǎn)生， 最后用蒸餾水沖洗樹脂至洗脫液無酒精味， 留著備用[7]。

2.3?AB-8樹脂吸附因素的考察

2.3.1?AB-8大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附和靜態(tài)解吸實驗

2.3.1.1?靜態(tài)吸附?準(zhǔn)確稱取經(jīng)過處理的2.0g（濕質(zhì)量） AB-8大孔樹脂放入50mL具塞三角燒瓶中，加入30mL薜荔莖提取液（1g生藥材/mL）。將塞子蓋緊并于37℃水浴中振蕩12h。取上清液測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算總黃酮的濃度，得出靜態(tài)吸附率和吸附容量。 吸附量Q=（C0-Cr）V/W。在公式中，Q是吸附量（mg·g-1樹脂）， C0是初始質(zhì)量濃度 （mg/mL），Cr是吸附后的黃酮含量 （mg/mL），V是溶液的體積 （mL）， W是樹脂的質(zhì)量（g）。吸附率=（吸附前黃酮含量/吸附后黃酮含量）/吸附前黃酮含量×100%。

由表1可知，樹脂靜態(tài)吸附量為50.03mg/g，吸附率為53.36%。

2.3.1.2?靜態(tài)解吸?將已靜態(tài)吸附的飽和大孔樹脂用蒸餾水沖洗到洗脫液呈無色。然后加入70%乙醇30mL并在37℃水浴振蕩器上搖動12h解吸。解吸后，通過吸取上清液測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算總黃酮的濃度，得出靜態(tài)解吸率。解吸率D（%）=（V×Cr）/（W×D）×%。式中：Q為吸附量（mg·g-樹脂）;Cr為解吸后溶液中黃酮的含量（mg/mL）;V是溶液的體積（mL）;W為樹脂的質(zhì)量（g）。由表2可知，靜態(tài)解吸后的解吸率為84.61%。

2.3.1.3?靜態(tài)吸附動力學(xué)研究?稱量2.0g（濕質(zhì)量）已處理過的樹脂置于50mL的帶塞三角瓶中，再加入30mL濃度為1g生藥材/mL的薜荔莖提取液，在恒溫器 37℃處晃動2h， 每1h吸收一次上清液， 并測定吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程確定總黃酮濃度及吸附率， 將時間作為橫向坐標(biāo)， 吸附率為縱向坐標(biāo)，繪制動力學(xué)曲線。從圖2結(jié)果可以看出， AB-8大孔樹脂對薜荔莖總黃酮的吸附是一種快速平衡型吸附，隨著吸附時間的增加，吸附速率在3h內(nèi)迅速下降，4h后吸附速率穩(wěn)定，吸附平衡基本達(dá)到。因此，吸附時間被確定為4h。薜荔莖總黃酮的富集純化使用AB-8大孔樹脂適宜。

2.3.2?吸附條件的考察

2.3.2.1?樣品液的質(zhì)量濃度的影響?分別加入70%的乙醇溶液稀釋已制得的薜荔莖1g生藥材/mL濃度的提取液，得到質(zhì)量濃度分別為0.25、0.50、0.75 g生藥材/mL的樣品液。稱量4份已預(yù)處理過的 AB-8大孔樹脂，每2.0g（濕質(zhì)量）為一份于50mL的具塞三角瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為0.25、0.50、0.75g生藥材/mL的樣品液30mL，在恒溫水浴振動篩上于37℃放置4h，然后取上清液測量吸光度，得出總黃酮的濃度與吸附率。由表3可以看出，當(dāng)該樣品液濃度為0.5g生藥材/mL時，薜荔莖總黃酮的吸附率最佳，因此選擇0.5g生藥材/mL作為樣品液的質(zhì)量濃度。

2.3.2.2?pH值的影響?稱取5份已預(yù)處理的AB-8大孔樹脂，每2.0 g（濕質(zhì)量）為1份，把它們分別放進(jìn)一個50mL的錐形瓶里，將濃度為1g生藥材/mL的提取液30mL加入瓶中， pH調(diào)節(jié)至3、4、5、6、7在37℃下振蕩3h。測量吸光度，計算得出總黃酮的濃度與吸附率。從表4可以看出，當(dāng)pH在3 ～ 6范圍時，AB-8大孔樹脂對薜荔莖總黃酮具有較好的吸附率，當(dāng)吸附介質(zhì)pH值為7時，吸附率明顯提高， 因此，吸附劑的pH值調(diào)到7最優(yōu)。

2.3.2.3?泄漏曲線的繪制與上樣量的確定?準(zhǔn)確稱取5.0g經(jīng)過預(yù)處理的AB-8大孔樹脂，濕法裝柱，取0.5g生藥材/mL濃度（pH調(diào)為7）的薜荔莖提取液，樣品流速為1mL/min， 每10mL收集1個樣品， 收集18份樣品，測定吸光度值并計算總黃酮的濃度， 將藥物溶液體積作為橫坐標(biāo)，將未吸附率繪制在縱坐標(biāo)上以確定樣品上柱體積。未吸附率=流出液中成分含量/上柱前原液中流出物含量。圖3結(jié)果顯示，上樣量達(dá)140mL時發(fā)生明顯泄漏，樹脂柱不能完全吸附藥液中的黃酮成分，所以上樣量為140mL時更合理，故確定140mL（14 BV）作為最大上樣量。

2.3.3?洗脫條件的考察

2.3.3.1?洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的影響?取5份已預(yù)處理的AB-8大孔樹脂，分別放到50mL的具塞三角瓶中，并加入0.5g生藥材/mL（pH=7）薜荔莖提取液適量使其吸附達(dá)到飽和，再加入不同體積分?jǐn)?shù)的洗脫劑30mL（50%、60%、70%、80%、90%乙醇），放置于37℃的恒溫水浴中于振蕩器搖動4h，取其上清液，以吸光度值來計算解吸速率。從表5可以看出，當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)小于70%時，解吸首先下降然后上升，然后緩慢上升。因此，選取的洗脫劑為70%乙醇。

2.3.3.2?確定洗脫劑的用量?準(zhǔn)確稱量5.0g的AB-8大孔樹脂，濕法裝柱。取140mL濃度為0.5 g生藥材/mL（pH調(diào)至7）的薜荔莖提取液，流速為1mL/min上樣。用5倍柱體積（5BV）的純水沖洗樹脂除去雜質(zhì)，用70%乙醇以1.0mL/min的流速洗脫至洗脫液呈無色，收集10mL/份的洗脫液來測定吸光度。用于計算總黃酮含量。以總洗脫量為縱坐標(biāo) （mg） ，洗脫量 （mL）為橫坐標(biāo)，得到動態(tài)洗脫曲線。 總洗脫量（mg）=Cd2×Vd2。式中，流出物的總黃酮質(zhì)量濃度為Cd2，洗脫劑體積為Vd2。從圖4可以看出，當(dāng)洗脫液為80mL（約8BV）時，莖中的總黃酮已被完全洗脫，因此選擇8BV作為洗脫劑的量。

2.4?工藝驗證試驗?對上述所得到的最優(yōu)工藝條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗驗證，計算大孔樹脂富集純化后薜荔中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。經(jīng)過3次驗證試驗，從表6可知大孔樹脂富集純化后的薜荔莖總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為65.04%、63.56%、64.37%，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)是64.32%，其結(jié)果表明，AB-8大孔樹脂對薜荔莖總黃酮的富集純化過程是穩(wěn)定可行的。

根據(jù)上述實驗的結(jié)果，確定了薜荔莖總黃酮的純化工藝條件是：取薜荔莖提取液（0.5g生藥材/mL），藥液 pH=7，上樣量14 BV，以1mL/mL的速度通過 AB-8大孔吸附樹脂柱，靜置4h，再用5 BV的蒸餾水來沖洗水溶性雜質(zhì)，用8BV 70%乙醇以1mL/min的速度洗脫大孔樹脂，將洗脫液減壓濃縮?；厥杖軇?，烘干并干燥，得樣品。

3?討論

AB-8型大孔吸附樹脂是一種具有極大比表面積、合適孔徑的球形弱極性聚合物吸附樹脂，它可通過表面吸附、氫鍵等作用于黃酮類化合物，是黃酮類化合物的優(yōu)良吸附劑。本實驗從靜態(tài)吸附和動態(tài)解吸兩個方面對AB-8大孔吸附樹脂分離純化薜荔莖總黃酮的工藝條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明： 樣品液的濃度、pH值、樣品體積、靜態(tài)吸附時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、洗脫劑用量對薜荔莖總黃酮的吸附量和洗脫率影響較大。當(dāng)乙醇的濃度小于70%時，解吸率呈先下降后上升再緩慢增長趨勢。從實驗結(jié)果可以看出，可選擇70% ～ 90% 的乙醇體積分?jǐn)?shù)來洗脫。由于考慮到實驗室的經(jīng)濟(jì)效益方面，本實驗以70%乙醇作為洗脫液濃度。實驗結(jié)果顯示，50.03mg/g為AB-8型大孔吸附樹脂對薜荔莖總黃酮靜態(tài)的吸附量，而84.61%是解吸附率，呈現(xiàn)出其具備較好的分離純化能力。最優(yōu)的吸附工藝條件是：取薜荔莖提取液（0.5 g生藥材/mL），藥液 pH=7，上樣量14BV，以1mL/mL的速度通過 AB-8大孔吸附樹脂柱，靜置4h，再用5BV蒸餾水來沖洗水溶性雜質(zhì)，用8BV 70%乙醇以1mL/min的速度洗脫大孔樹脂，其洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮回收乙醇，干燥后得到紅褐色膏狀物。該工藝簡單易操作，無污染，樹脂可再生，生產(chǎn)效率高，具有一定的推廣應(yīng)用價值。

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（收稿日期：2020-07-05?編輯：程鵬飛）