羊肚菌液體發(fā)酵的集硒特性及生物活性物質(zhì)研究

向戌蓮 周大寨 冉青 劉信平 張馳

摘要：【目的】研究羊肚菌液體發(fā)酵培養(yǎng)條件，以及隨硒濃度變化菌絲中活性物質(zhì)的變化規(guī)律，為羊肚菌的集硒特性及其生物活性物質(zhì)研究提供參考依據(jù)。【方法】以亞硒酸鈉為無機硒源，以羊肚菌菌絲將無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒的硒源利用率為評價指標，采用正交試驗對液體培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。利用水提醇沉法和Sevage法對多糖進行提取及純化，蛋白質(zhì)采用磷酸緩沖液提取，并對不同溶解性蛋白進行提取，以硫酸銨沉淀和透析法進行純化;使用原子熒光法測定硒含量。采用試劑盒測定菌絲總超氧化物歧化酶（T-SOD）活力、過氧化物酶（POD）活性、多酚氧化酶（PPO）活性及脯氨酸（Pro）含量?！窘Y(jié)果】羊肚菌菌絲富集有機硒深層發(fā)酵的最佳培養(yǎng)條件為：硒濃度25 μg/mL、培養(yǎng)溫度24 ℃、培養(yǎng)時間5 d、裝液量200 mL，在此條件下，亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化為菌絲有機硒的硒源利用率為1.85%。4個因素影響排序為：硒濃度>培養(yǎng)天數(shù)>培養(yǎng)溫度>裝液量。硒濃度為20 μg/mL時多糖集硒效果較好，硒濃度為30 μg/mL時蛋白集硒效果較好。堿溶性和鹽溶性蛋白的集硒能力更強，且集硒蛋白大多在30%硫酸銨飽和度時沉淀。相較于未加硒組（0 μg/mL），加硒組菌絲有更強的抗氧化活性。硒濃度在50 μg/mL以內(nèi)，硒濃度的增加促使T-SOD活力不斷增強;硒濃度的增加則抑制POD活性，但硒濃度超過30 μg/mL后POD活性略有回升;硒濃度對PPO活性有一定的抑制作用，且隨硒濃度的增加呈先升后降的變化趨勢。補硒能提高菌絲Pro含量，從而提高抗逆性，但超過30 μg/mL也會對其抗逆性產(chǎn)生負面影響?！窘Y(jié)論】羊肚菌液體發(fā)酵菌絲的集硒特性良好，能產(chǎn)生更有利的活性物質(zhì)，是一種有效的羊肚菌集硒方法。

關(guān)鍵詞： 羊肚菌;菌絲;硒源利用率;硒多糖;硒蛋白;酶活性

中圖分類號： S646? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）10-2523-09

Selenium collecting characteristics and biological active substances in liquid fermentation of Morchella esculenta

XIANG Xu-lian， ZHOU Da-zhai， RAN Qing， LIU Xin-ping， ZHANG Chi*

（College of Biological Science and Technology，Hubei University for Nationalities/Key Laboratory of Biological Resources Conservation and Utilization of Hubei Province， Enshi， Hubei? 445000， China）

Abstract：【Objective】This paper studied the liquid fermentation culture conditions of Morchella esculenta and the corresponding changes of the active substances in the mycelium with the change of selenium concentration，so as to provide reference for the research on the selenium collecting characteristics of M. esculenta and the research methods of their bioactive substances. 【Method】Sodium selenite was used as the inorganic selenium source，and the selenium source utilization rate of the transformation of inorganic selenium into organic selenium by the mycelium of M. esculenta was used as the index. Orthogonal analysis method was used to optimize the liquid culture conditions. Polysaccharides were extracted and preliminarily purified by water extraction，alcohol precipitation and Sevage，proteins were extracted by phosphoric acid buffer，and proteins with different solubilities were extracted by ammonium sulfate precipitation and dialysis. Sele-nium content was determined by atomic fluorescence spectrometry. The activity of mycelium of total superoxide dismutase（T-SOD），peroxidase（POD），polyphenol oxidase（PPO） and proline（Pro） were determined by kit method. 【Result】The optimum culture conditions for deep fermentation of organo-selenium-rich mycelium of M. esculenta were as follows：selenium concentration of 25 μg/mL，culture time of 5 d，culture temperature of 24 ℃，and loading volume of 200 mL. Under these conditions，the selenium source utilization ratio of sodium selenite to organic selenium in mycelium was 1.85%. And the order of the factors influencing the size was as follows： selenium concentration>culture days>culture temperature> loading liquid amount. When the selenium concentration was 20 μg/mL， selenium collecting ability of polysaccharide was strong， and when the selenium concentration was 30 μg/mL， selenium collecting ability of? of protein was strong. Alkali-soluble and salt-soluble proteins had stronger selenium collecting ability，and most of the selenium protein precipitated at the saturation of 30% ammonium sulfate. Compared with the selenium-free group（0 μg/mL），selenium group showed stronger antioxidant activity. Within 50 μg/mL of selenium concentration，the increasing concentration of selenium conti-nuously enhanced the activity of T-SOD. The increase of selenium concentration inhibited the POD activity，but when the selenium concentration exceeded 30 μg/mL，the POD activity recovered. Selenium concentration had a certain inhibition on PPO activity，the inhibition effect with the increase of selenium concentration first increased and then decreased. Selenium supplementation could improve the content of mycelium Pro，thus improving the stress resistance，but the selenium supplementation concentration over 30 μg/mL would also have negative impact on its stress resistance. 【Conclusion】The liquid fermentation mycelium of M. esculenta has good selenium collecting characteristics and can produce more favora-ble active substances，which is an effective selenium collecting method of M. esculenta.

Key words： Morchella esculenta; mycelium; selenium source utilization rate; selenium polysaccharide; selenoprotein; enzyme activity

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（81402225）; Special Project of the Central Government to Guide Local Science and Technology Development（2016）; Key Science and Technology Project of Enshi（D2017 0039）; Open Fund Project of Hubei Engineering Research Center for Selenium Food Nutrition and Health（PT082008）

0 引言

【研究意義】羊肚菌是子囊菌中最著名的美味食用菌，有“素中之葷”的美稱（劉書暢等，2018）。羊肚菌富含多糖和蛋白，可有效抑制脂褐質(zhì)的形成，具有增強機體免疫力、抗疲勞、抗病毒和抑制腫瘤等多種功效（段巍鶴等，2015;李衛(wèi)東，2018）。硒的生物有機化主要通過動物、植物和微生物轉(zhuǎn)化無機硒生產(chǎn)有機硒（梁克紅等，2018;趙謀明等，2019）。對于羊肚菌富硒，生物吸附硒元素并通過菌絲細胞內(nèi)的物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化，將無機硒吸收并與大分子活性物質(zhì)結(jié)合，最終以硒蛋白或硒多糖等有機硒的形式存在（胡海濤等，2012;徐巧林等，2017;朱燕云等，2018）。硒多糖兼具硒和多糖的生理功能，硒蛋白兼具硒和蛋白的生理功能。羊肚菌在自然條件下較易富硒，相對于其他食用菌其具有更強的集硒能力，氨基酸含量為食用菌之首（丁健峰等，2013）。羊肚菌子實體較難培育，可培育種類較少，相較于羊肚菌大規(guī)模人工栽培，羊肚菌菌絲體液體培養(yǎng)具有生長速度快、高效經(jīng)濟、適合工業(yè)化生產(chǎn)等特點，因此更適合液體發(fā)酵大量培育發(fā)酵產(chǎn)物。此外，液體發(fā)酵培養(yǎng)的食用菌菌絲體與其子實體在化學(xué)組成和生理功能方面均很相似（李文佳等，2017）。因此，通過菌絲液體發(fā)酵得到羊肚菌有效物質(zhì)，并研究硒對其活性物質(zhì)的影響，對開展羊肚菌精深加工具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】至今，國內(nèi)已有不少學(xué)者對其影響羊肚菌生物量的培養(yǎng)條件及其抗氧化活性等進行探索、優(yōu)化和研究。孟凡云（2010）對羊肚菌胞內(nèi)硒多糖的抗氧化活性進行研究，結(jié)果表明胞內(nèi)硒多糖具有較強的體內(nèi)和體外抗氧化能力。丁建峰（2014）以羊肚菌富硒深層發(fā)酵技術(shù)優(yōu)化了羊肚菌生物量的工藝參數(shù)，并初步分析其硒多糖的結(jié)構(gòu)。張麗（2014）、侯玉艷等（2015）對黑脈羊肚菌抗氧化指標的酶性質(zhì)進行研究，根據(jù)熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和敏感性可推斷超氧化物歧化酶（SOD）的類型。何亞（2015）提取了羊肚菌蛋白，測定其溶解度隨溫度、pH的變化，以及乳化和起泡隨pH的變化;同時發(fā)現(xiàn)分離蛋白對DPPH自由基的清除效果最佳。冮潔等（2016）在優(yōu)化羊肚菌菌絲富硒培養(yǎng)條件的同時，證實羊肚菌多糖具有較強的體外抗氧化活性。張強等（2017）將提取的羊肚菌蛋白在菌體外進行硒化修飾，得到具有更高體外抗氧化活性的羊肚菌硒蛋白?！颈狙芯壳腥朦c】羊肚菌富硒的液體發(fā)酵技術(shù)雖然日漸成熟，但鮮見探究無機硒對羊肚菌菌絲生長發(fā)育及生理生化特性影響的研究報道，因此有必要在研究深度上更進一步，為富硒羊肚菌液體培養(yǎng)條件優(yōu)化及其功能活性物質(zhì)研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究外源無機硒添加量與羊肚菌菌絲液體培養(yǎng)獲得有機硒的關(guān)系，確定最佳硒源利用率下的液體培養(yǎng)條件，并探究不同硒濃度對羊肚菌活性物質(zhì)的影響，為羊肚菌高效富硒分子領(lǐng)域研究及精深加工方面提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

羊肚菌斜面菌種購自周玉麟食用菌技術(shù)研究所。馬鈴薯為市購;葡萄糖、磷酸二氫鉀和硫酸鎂均為國產(chǎn)分析純，瓊脂粉為生物試劑，亞硒酸鈉、硝酸、鹽酸、氫氧化鉀和硼氫化鉀均為國產(chǎn)優(yōu)級純;硒標液購自中國計量科學(xué)研究所，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。主要儀器設(shè)備：樣品粉碎機（臺灣弘荃機械企業(yè)有限公司）;單通道可調(diào)節(jié)移液[大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司];GXZ-9140數(shù)顯鼓風干燥箱、DGX型電熱鼓風干燥箱、HHS型電熱恒溫水浴鍋和BOXUN立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;TDL-802B低速臺式離心機（上海安亭科技儀器公司）;ME204E電子天平（梅特勒—托利多儀器有限公司）;MARS6微波消解儀（美國CEM公司）;UPH-I-20T型超純水制造系統(tǒng)（成都超純科技有限公司）;DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪儀器廠）;SPX-30085H-11生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）;ZWYR-2102恒溫振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）;SJ-CJ-2FDQ超凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司）;真空冷凍干燥機（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）;CARY 300Conc紫外可見分光光度計（美國Varian公司）;AvantiRJ-30I高速冷凍離心機（美國Beckman公司）;AFS-9760雙道原子熒光光譜計（北京海光儀器公司）;MuLtiskan Go-1510酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 菌種活化 羊肚菌斜面菌種置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，接種于固體綜合PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d。

1. 2. 2 硒母液配制 稱取亞硒酸鈉（純度98%）1.1185 g，溶于100 mL超純水中，配制成硒濃度為5000 μg/mL的亞硒酸鈉母液，母液和PDA液體培養(yǎng)基分別滅菌后混勻。

1. 2. 3 單因素試驗設(shè)計 進行10、20、30、40和50 μg/mL硒濃度預(yù)試驗，以菌絲干重不低于未加硒組（0 μg/mL）為標準，確定硒濃度10～30 μg/mL為最終選擇范圍。以硒源利用率為評價指標進行單因素液體培養(yǎng)，設(shè)硒濃度10、15、20、25和30 μg/mL，培養(yǎng)溫度24、25、26、27和28 ℃（李紅等，2018），裝液量100、150、200、250和300 mL（冮潔等，2016），培養(yǎng)時間2、3、4、5和6 d（丁健峰，2014）。培養(yǎng)完成后過濾菌絲，蒸餾水洗滌2遍，真空冷凍干燥，稱重。根據(jù)GB 1903.22—2016《食品安全國家標準 食品營養(yǎng)強化劑 富硒食用菌粉》，用AFS-9760雙道原子熒光光譜計測定羊肚菌粉中的有機硒含量（徐元芬，2017），再計算無機硒轉(zhuǎn)化為菌絲有機硒的硒源利用率。計算公式如下：

硒源利用率（%）=[（C1-C2）×MC3×V]×100

式中，C1為總硒含量（μg/g），C2為無機硒含量（μg/g），C3為硒濃度（μg/mL），M為菌絲干重（g），V為裝液量（mL）。

1. 2. 4 正交試驗設(shè)計 采用4因素3水平正交試驗優(yōu)化羊肚菌的富硒培養(yǎng)條件。每個試驗處理3次重復(fù)。正交試驗因素與水平見表1。

1. 2. 5 硒多糖提取與測定 硒多糖提取：干燥菌絲→粉碎過篩→熱水浸提（2次）→離心→醇沉過夜→沉淀復(fù)溶→Sevage法除蛋白→上清液即為硒多糖溶液。

硒多糖含量：采用硫酸蒽酮法進行測定。

多糖硒含量：取多糖待測液1 mL置于消解管中，按1.2.3中總硒的測定方法進行測定。

1. 2. 6 硒蛋白提取與測定 硒蛋白粗提?。焊稍锞z→粉碎過篩→加磷酸緩沖液→磁力攪拌→離心→上清液分級沉淀→靜置過夜→離心→沉淀復(fù)溶→透析→得硒蛋白粗液。

不同溶解性硒蛋白提?。何醇游M和正交最優(yōu)組的干燥菌絲→粉碎過篩→分別加蒸餾水、0.5 mol/L氯化鈉溶液、0.1 mol/L氫氧化鉀溶液和75%乙醇溶液→磁力攪拌→濾液酸化（醇提不酸化）→加硫酸銨沉淀（醇提加等體積水）→靜置過夜→離心→沉淀復(fù)溶→透析→得不同溶解性（水溶性、鹽溶性、堿溶性和醇溶性）硒蛋白溶液。

硒蛋白含量：采用考馬斯亮藍G-250法進行測定。

蛋白硒含量：取蛋白待測液1 mL置于消解管中，按1.2.3中總硒的測定方法進行測定。

1. 2. 7 不同硒濃度下活性物質(zhì)特性測定 采用試劑盒對0、10、20、30、40和50 μg/mL硒濃度培養(yǎng)下的新鮮菌絲進行總超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和脯氨酸（Pro）等物質(zhì)活性或含量測定。

1. 3 統(tǒng)計分析

采用WPS Office 2020和SPSS 6.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、制圖和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素試驗結(jié)果

2. 1. 1 硒濃度對羊肚菌菌絲培養(yǎng)的影響 硒濃度對羊肚菌菌絲干重的影響見圖1。硒濃度低于20 μg/mL時，菌絲干重隨硒濃度的增加而增加;硒濃度超過20 μg/mL后，菌絲干重呈下降趨勢，且30 μg/mL后的菌絲干重低于未加硒組。說明在本研究條件下培養(yǎng)，羊肚菌菌絲的最大耐硒度在30 μg/mL左右，故選擇10、15、20、25和30 μg/mL硒濃度進行硒源利用率的單因素試驗。硒濃度對羊肚菌菌絲硒源利用率的影響見圖2。隨著硒濃度的增加，硒源利用率呈先上升后下降的變化趨勢，在20 μg/mL時達最大值（0.29%），故確定20 μg/mL為最佳硒濃度。

2. 1. 2 培養(yǎng)溫度對硒源利用率的影響 溫度對氧氣的溶解度會造成影響，與菌體的代謝及菌體代謝產(chǎn)物有著緊密聯(lián)系。由圖3可知，隨著培養(yǎng)溫度不斷升高，羊肚菌菌絲硒源利用率呈先升后降的變化趨勢，且在25 ℃時達最大值（0.17%）。此后培養(yǎng)溫度越高，硒源利用率下降越快，說明高溫致使溶氧下降，代謝產(chǎn)物的堆積抑制菌絲生長，與羊肚菌喜涼的特性吻合。因此，確定25 ℃為最佳培養(yǎng)溫度。

2. 1. 3 培養(yǎng)天數(shù)對硒源利用率的影響 菌絲生長隨培養(yǎng)時間的推移對應(yīng)出現(xiàn)適應(yīng)、對數(shù)生長、平衡和內(nèi)代謝4個階段，內(nèi)代謝階段甚至?xí)l(fā)生自溶現(xiàn)象（丁建峰，2014）。由圖4可知，培養(yǎng)前4 d羊肚菌菌絲硒源利用率不斷升高，此階段菌絲正生長，物質(zhì)利用活躍，硒源利用率高;培養(yǎng)4 d后菌絲硒源利用率急劇下降，此階段菌絲可能因為出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，物質(zhì)利用下降;培養(yǎng)6 d時自溶產(chǎn)生的少量空間促使硒源利用率略有回升?？傮w來看，培養(yǎng)4 d時硒源利用率最高，為0.82%，故確定培養(yǎng)4 d為最佳培養(yǎng)天數(shù)。

2. 1. 4 裝液量對硒源利用率的影響 裝液量不僅影響基礎(chǔ)物質(zhì)的提供，還影響液體培養(yǎng)過程中發(fā)酵液的溶氧狀態(tài)。由圖5可知，裝液量在200 mL以下時，羊肚菌菌絲硒源利用率不斷上升，在200 mL時達最大值（0.20%）;裝液量大于200 mL后，溶氧量減少，限制菌絲代謝，硒源利用率開始下降。故確定200 mL為最佳裝液量。

2. 2 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對影響羊肚菌菌絲硒源利用率的4個因素進行3水平的正交優(yōu)化試驗。由表2可知，羊肚菌菌絲富硒培養(yǎng)條件優(yōu)化方案為A3B1C3D2，即硒濃度25 μg/mL、培養(yǎng)溫度24 ℃、培養(yǎng)天數(shù)5 d、裝液量200 mL，在此條件下，硒源利用率為1.85%。各因素對羊肚菌菌絲富硒影響排序為：硒濃度>培養(yǎng)天數(shù)>培養(yǎng)溫度>裝液量，4個因素對羊肚菌菌絲硒源利用率均有極顯著影響（P<0.01）（表3）。

2. 3 多糖試驗結(jié)果

2. 3. 1 硒濃度對硒多糖含量的影響 以標準品葡萄糖濃度為橫坐標，620 nm下測得的吸光值為縱坐標繪制標準曲線（圖6）。相對于未加硒組而言，羊肚菌粉硒多糖含量有增有減，但隨著培養(yǎng)液硒濃度的增加，菌粉硒多糖含量基本呈先升后降的變化趨勢，硒濃度為20 μg/mL時，硒多糖含量達最大值（圖7）。說明硒濃度變化在一定程度上會影響硒多糖含量變化。

2. 3. 2 硒濃度對多糖硒含量的影響 隨著培養(yǎng)液硒濃度的增加，羊肚菌粉多糖硒含量呈先升高后降低的變化趨勢，但均比未加硒的多糖硒含量高，說明硒濃度的增加，可使硒與更多的多糖結(jié)合，但多糖硒含量并非呈線性比例增加，可能是硒與不同種多糖結(jié)合的緣故。綜合來看，硒濃度為20 μg/mL時對羊肚菌粉多糖集硒有較好效果。

2. 4 蛋白質(zhì)試驗結(jié)果

2. 4. 1 硒濃度對菌絲蛋白含量的影響 以標準品牛血清白蛋白濃度為橫坐標，595 nm下測得的吸光值為縱坐標繪制標準曲線（圖9）。由圖10可知，就蛋白含量而言，無機硒的添加會限制蛋白積累，但隨著硒濃度的升高，菌絲硒蛋白含量呈先升后降的變化趨勢。說明硒的添加雖然整體上會減少蛋白含量，但可能對某些可利用硒的蛋白形成有促進作用。在硒濃度小于30 μg/mL時，這種促進作用占優(yōu)勢;硒濃度超過30 μg/mL后，則對蛋白的抑制成主導(dǎo)作用，從而使得蛋白含量降低。

2. 4. 2 硒濃度對蛋白硒含量的影響 由圖11可知，隨著硒濃度的升高，羊肚菌菌絲蛋白硒含量呈先升后降的變化趨勢，在30 μg/mL時富集量最高。相對于未加硒組而言，菌絲蛋白硒含量均有所提高，說明硒濃度對硒蛋白的形成有一定促進作用。此外，蛋白硒含量的增加和減少均呈線性趨勢，即等比例增減，說明羊肚菌菌絲蛋白中的硒結(jié)合位點較固定，很可能是與某種氨基酸結(jié)合造成的結(jié)果。

2. 4. 3 不同溶解性蛋白硒含量的比較 從圖12可看出，未加硒組羊肚菌菌絲醇溶性蛋白硒含量最高，加硒的正交最優(yōu)組羊肚菌菌絲則以堿溶性蛋白硒含量最高;正交最優(yōu)組羊肚菌菌絲的4種溶解性蛋白硒含量均比未加硒組有所提高，且主要是堿溶性和鹽溶性蛋白，說明堿溶性和鹽溶性蛋白含有更多的含硒氨基酸。

2. 4. 4 不同硫酸銨飽和度下蛋白硒含量的比較

從圖13可看出，相對于未加硒組，正交最優(yōu)組的羊肚菌菌絲蛋白硒含量在各硫酸銨飽和度下均有所提高;未加硒組在低于40%硫酸銨飽和度和高于70%硫酸銨飽和度時，蛋白硒含量均≤0.02 μg/g，在50%～70%硫酸銨飽和度下蛋白硒含量有所增加;而正交最優(yōu)組在30%、50%、70%和80%硫酸銨飽和度下均具有較高蛋白硒含量，且在30%飽和度時最高。說明含硒量高的蛋白在較低飽和度下就能被沉淀分離出來。

2. 5 抗氧化指標測定結(jié)果

2. 5. 1 T-SOD活力 由圖14可知，隨著硒濃度的增加，羊肚菌菌絲T-SOD活力不斷增強，說明在50 μg/mL硒濃度以內(nèi)，硒濃度對T-SOD活力均有促進作用。可能是因為菌絲中的硒能清除自由基及抑制自由基生成，使得T-SOD活力增強。

2. 5. 2 POD活性 從圖15可看出，在硒濃度低于30 μg/mL時，隨著硒濃度的增加，羊肚菌菌絲POD活性不斷降低，可能是因為硒能保護酚類物質(zhì)不被氧化成醌類，說明硒的添加能抑制POD活性;當硒濃度超過30 μg/mL后，由于較高硒濃度開始抑制菌絲生長，繼而相應(yīng)的POD活性開始增強。

2. 5. 3 PPO活性 從圖16可看出，隨著硒濃度的增加，羊肚菌菌絲PPO活性呈先升后降的變化趨勢，當硒濃度小于40 μg/mL時，PPO活性逐漸增強，硒濃度為20 μg/mL時已超過未加硒組;但硒濃度超過40 μg/mL后，PPO活性急劇下降，在硒濃度為50 μg/mL時小于未加硒組。說明添加較低硒濃度對羊肚菌菌絲PPO活性有明顯的促進作用，但硒濃度超過40 μg/mL后，對PPO活性則呈抑制效果。

2. 5. 4 Pro含量 由圖17可知，硒濃度30 μg/mL是Pro積累的最佳濃度;低于30 μg/mL時，Pro含量隨著硒濃度的增加而提高;硒濃度超過30 μg/mL后，Pro含量呈下降趨勢。在濃度較低時，硒濃度的增加對菌絲抗逆性有不斷促進作用，高硒濃度促進作用反而減小，但在50 μg/mL以下仍較未加硒組有更好的抗逆作用。說明補硒能提高羊肚菌菌絲Pro含量，從而提高其抗逆性，但過高的補硒濃度也會對其抗逆性產(chǎn)生負面影響。

3 討論

丁建峰（2014）研究表明，優(yōu)化的工藝參數(shù)（搖床轉(zhuǎn)速100 r/min、培養(yǎng)基裝料量150 mL、培養(yǎng)溫度25.73 ℃、發(fā)酵時間5.22 d、硒濃度86.67 μg/mL）能促使羊肚菌菌絲生物量達10.339 g/L、硒含量達18.6 μg/mL。冮潔等（2016）以優(yōu)化后的條件（亞硒酸鈉濃度10 mg/L、pH 7.0、裝液量100 mL/250 mL、溫度25 ℃）培養(yǎng)得到羊肚菌菌絲生物量為8.27 g/L、硒含量為0.13 mg/g。在硒與羊肚菌的探索上，大多研究者以探析硒濃度對羊肚菌生物量或硒含量的影響為目的，且基本測定的是總硒含量，其有機硒和無機硒含量無法確定。本研究以亞硒酸鈉添加量中轉(zhuǎn)化為有機硒的有效利用率為考察指標，更加明確有機硒的獲得條件，通過單因素和正交試驗確定最大利用率的條件：硒濃度25 μg/mL、培養(yǎng)溫度24 ℃、培養(yǎng)天數(shù)5 d、裝液量200 mL，在此條件下測得無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒的硒源利用率為1.85%。本研究依據(jù)羊肚菌液體發(fā)酵時對硒的科學(xué)利用，使得正交最優(yōu)組在有機硒得率方面更高效，且硒濃度適中，既能獲得較高的有機硒，又能節(jié)約亞硒酸鈉添加量。

前人對于羊肚菌活性物質(zhì)的探究主要集中在對提取工藝進行優(yōu)化和改良，抗體外氧化活性方面基本是以超氧陰離子、羥自由基和DPPH自由基試驗為主（何亞，2015;冮潔等，2016）。本研究分析了不同硒濃度對液體發(fā)酵產(chǎn)物多糖和蛋白及其硒含量、T-SOD活力、POD活性、PPO活性、Pro含量多種生理生化指標的影響，著重反映硒濃度對羊肚菌菌絲的生理生化作用效果。發(fā)酵物中硒蛋白和硒多糖含量均有不同程度的增加，且酶活性等其他指標表明在培養(yǎng)液中添加硒能促使菌絲抗氧化性能增強，說明硒的添加在一定程度上能增強羊肚菌菌絲本身活性物質(zhì)的優(yōu)勢。

本研究結(jié)果表明，硒濃度在羊肚菌菌絲的液體培養(yǎng)中具有重要研究價值，在液體培養(yǎng)基中加入適宜無機硒，可有效增加菌絲中有機硒含量，無機硒通過羊肚菌菌絲自身轉(zhuǎn)化與多糖、蛋白結(jié)合，同時對菌絲內(nèi)的多種成分起不同作用。下一步將著力于對羊肚菌富硒機理和功能性產(chǎn)品方面進行深入研究。

4 結(jié)論

羊肚菌液體發(fā)酵菌絲的集硒特性良好，且能產(chǎn)生更有利的活性物質(zhì)，是一種有效的羊肚菌集硒方法。

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（責任編輯 羅 麗）