肋果沙棘幼苗抗氧化酶系統(tǒng)及總黃酮對(duì)UV-B輻射增強(qiáng)的響應(yīng)

周璇 賈志鵬 王娟 杜梅娜 蘇雪

摘 要： 該文以青藏高原特有木本植物肋果沙棘為材料，在62 μW·cm-2的UV-B輻射強(qiáng)度下，分別測(cè)定處理了0～6 d幼苗葉片的氧化損傷程度、抗氧化系統(tǒng)酶活性和總黃酮含量及其抗氧化活性，以探究肋果沙棘對(duì)UV-B輻射的生理生態(tài)響應(yīng)機(jī)制。結(jié)果表明：隨UV-B輻射時(shí)間的增加，肋果沙棘幼苗過(guò)氧化氫含量（H2O2）和膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物（MDA）顯著增加;抗氧化系統(tǒng)酶中過(guò)氧化氫酶（CAT）活性顯著升高;過(guò)氧化物酶（POD）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性呈先降后升的趨勢(shì)，且活性均顯著低于對(duì)照，超氧化物歧化酶（SOD）活性無(wú)明顯變化;總黃酮含量隨輻射時(shí)間的積累顯著增加，作為非酶抗氧化物質(zhì)的總黃酮對(duì)1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）的清除率與其含量變化具有顯著正相關(guān)關(guān)系。綜上結(jié)果表明，肋果沙棘幼苗在抵御該輻射產(chǎn)生的氧化損傷中，通過(guò)提高CAT活性及增加總黃酮含量來(lái)抵御輻射造成的氧化損傷。

關(guān)鍵詞： 木本植物， 肋果沙棘， UV-B輻射， 抗氧化酶系統(tǒng)， 總黃酮

中圖分類號(hào)： Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 1000-3142（2020）11-1595-07

Abstract： Hippophae neurocarpa， a woody plant endemic to the Qinghai-Tibet Plateau， were used as materials to determine the degree of oxidative damage， activity of antioxidant system enzyme， content of total flavonoid in leaves and its antioxidant activity under UV-B radiation intensity of 62 μW·cm-2? under UV-B radiation treatment for 0-6 d， to explore the physiological and ecological response mechanism of H. neurocarpa to UV-B radiation. The results were as follows： With the increasement of UV-B radiation time， the contents of hydrogen peroxide（H2O2）and membrane lipid peroxidation product（MDA）increase significantly; The activity of catalase（CAT）in antioxidant system enzyme increased significantly; The activities of peroxidase（POD）and ascorbate peroxidase（APX）decreased first and then increased， and the activities were significantly lower than that the control check， while the activity of superoxide dismutase（SOD）has no significant changes; The content of total flavonoid increased significantly with the accumulation of radiation time， the total flavonoid as non-enzymatic antioxidants had a significant positive correlation with clearance rate of 1， 1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl（DPPH）and its content changes. The above results indicate that the H. neurocarpa resist the oxidative damage caused by radiation mainly depends on the improvement of the CAT activity and the increase of the content of total flavonoid. The results of the experiment provide a theoretical reference for understanding the countermeasures of woody plants like H. neurocarpa grown on the Qinghai-Tibet Plateau for adapting to UV-B radiation.

Key words： woody plant， Hippophae neurocarpa， UV-B radiation， antioxidant enzyme system， total flavonoid

近40年來(lái)，臭氧層一直受到人為的化學(xué)擾動(dòng)（Portmann et al.， 2012）。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)的臭氧濃度在過(guò)去的20年內(nèi)已減少2%～3%，南極地區(qū)的減少量已達(dá)50%，且臭氧層空洞仍在繼續(xù)擴(kuò)大（方熒等，2018），而臭氧層變薄會(huì)導(dǎo)致到達(dá)地球表面的UV-B（280～320 nm）輻射增強(qiáng)，這已引起了國(guó)內(nèi)外研究者的高度關(guān)注。盡管UV-B輻射是太陽(yáng)輻射中極小的一部分，但它具有的能量極高，即便是微量的增加，也足以對(duì)植物生存及全球生態(tài)系統(tǒng)帶來(lái)嚴(yán)重的影響（蒲曉宏等，2017）。增強(qiáng)的UV-B輻射會(huì)導(dǎo)致植物出現(xiàn)矮化、葉面積減小、葉片卷曲、葉片厚度增加、節(jié)間縮短等形態(tài)方面的變化（Shi et al.， 2004）;也會(huì)造成多數(shù)植物花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)受到不同程度的抑制（Llorens et al.， 2015）、細(xì)胞活性氧（ROS）水平增加、葉片中紫外吸收物含量增加、光合作用減弱等生理生化方面的影響;在分子水平上影響植物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成與分解、造成DNA損傷等;使生態(tài)系統(tǒng)中群落結(jié)構(gòu)和物種多樣性發(fā)生改變等。植物為抵御UV-B輻射帶來(lái)的傷害，就必須及時(shí)有效地做出相應(yīng)的適應(yīng)性反應(yīng)。許多針對(duì)此方面已開(kāi)展的研究工作表明，植物不僅可以通過(guò)抗氧化酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)以降低UV-B對(duì)其產(chǎn)生的氧化損傷（王園等，2017;褚潤(rùn)等，2018），還會(huì)促進(jìn)以黃酮類化合物為主的次生代謝產(chǎn)物的合成，來(lái)吸收紫外輻射、發(fā)揮抗氧化作用（Tegelberg et al.， 2004;李元等，2006;田向軍等，2007）。然而，國(guó)內(nèi)外此類研究多在草本植物中開(kāi)展。UV-B為短波光，會(huì)產(chǎn)生漫射性輻射，木本植物植株因較草本植物高大，且世代時(shí)間長(zhǎng)，所以比草本植物受到的輻射量大，次生代謝產(chǎn)物的積累量大（Lin et al.， 1998），這種特點(diǎn)可能會(huì)造成木本植物和草本植物不完全相同的響應(yīng)機(jī)制，因此開(kāi)展木本植物的相關(guān)研究對(duì)揭示植物響應(yīng)UV-B輻射的機(jī)制具有重要的意義。

高山、高原等全球高UV-B輻射量地區(qū)受到的紫外輻射要比同緯度其他地區(qū)強(qiáng)很多。青藏高原是世界第三極，也是臭氧遞減的強(qiáng)中心之一（劉煜和李維亮，2001;薛志航等，2018），以生存分布于此的生物為材料展開(kāi)相關(guān)研究，對(duì)于理解植物抵抗UV-B輻射的生理生態(tài)響應(yīng)機(jī)制也具有獨(dú)特的價(jià)值。肋果沙棘（Hippophae neurocarpa）是胡頹子科沙棘屬（Hippophae L.）雌雄異株的落葉灌木，喜光照，僅分布于青藏高原海拔2 800～4 300 m的河流沿岸、河灘及溝谷，具有重要的經(jīng)濟(jì)和水土保持價(jià)值（廉永善，2000;Sun et al.， 2002）。作為長(zhǎng)期生活于強(qiáng)紫外輻射環(huán)境中的特有木本植物，如何適應(yīng)這一脅迫條件？其葉片中富含的黃酮類化合物是否在其適應(yīng)強(qiáng)紫外輻射方面發(fā)揮著重要作用？這些問(wèn)題值得我們?nèi)ヌ骄俊Ｋ员疚膶?duì)增強(qiáng)UV-B輻射下肋果沙棘幼苗葉片的氧化損傷和抗氧化機(jī)制進(jìn)行研究分析，以助于我們了解肋果沙棘等生長(zhǎng)于青藏高原的植物對(duì)UV-B輻射的生理響應(yīng)及適應(yīng)機(jī)制，進(jìn)一步揭示木本植物對(duì)UV-B輻射的適應(yīng)對(duì)策，同時(shí)這對(duì)于肋果沙棘資源的保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用具有理論參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)肋果沙棘種子進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)，以其幼苗葉片作為研究對(duì)象。選取顆粒飽滿、大小均一的肋果沙棘種子，種植于直徑11 cm的塑料花盆內(nèi)，培養(yǎng)基質(zhì)為蛭石∶草炭土∶珍珠巖=2∶1∶1，每盆8顆，在植物培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，晝夜溫度26 ℃/22 ℃，保持水分充足，每天光照14 h，光強(qiáng)7 000 lx。供試?yán)吖臣N子于2016年10月采自青海省海北藏族自治州祁連縣野牛溝，地理位置為100°14′39″ E、38°20′41″ N，海拔2 936 m。

1.2 UV-B輻射增強(qiáng)處理

待肋果沙棘幼苗長(zhǎng)至20片真葉時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，隨機(jī)分配為對(duì)照組（CK）和UV-B處理組（T）2個(gè)實(shí)驗(yàn)組，處理組（T）在對(duì)照組（CK）基礎(chǔ)上，進(jìn)行UV-B輻射增強(qiáng)處理。UV-B輻射光源為國(guó)產(chǎn)紫外燈管（UV-B 313），將紫外燈管垂直懸掛于培養(yǎng)材料正上方，輻射強(qiáng)度為62 μW·cm-2，以模擬海北地區(qū)7月份UV-B輻射全天平均值增強(qiáng)30%，每天處理8 h（8：30—16：30）。隨植物生長(zhǎng)的高度，隨時(shí)調(diào)整燈管的高度以保持植物所受紫外輻射強(qiáng)度的一致，輻射劑量由UV-B輻射照度計(jì)測(cè)得。于輻射處理的第0、1、2、3、4、5、6天在同一時(shí)間取樣，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定，每個(gè)指標(biāo)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

（1）H2O2的測(cè)定：稱取0.1 g鮮葉加入2 mL丙酮進(jìn)行研磨，然后參照Patterson et al.（1984）的方法進(jìn)行測(cè)定。（2）MDA采用Aravind & Prasad（2003）的方法并略加修改。（3）抗氧化系統(tǒng)酶活性的測(cè)定：CAT活性采用紫外吸收法，酶活性用每分鐘A240減少0.01的酶量為1個(gè)酶活單位（孫群和胡景江，2006）;SOD活性和POD活性分別采用NBT光還原抑制法和愈創(chuàng)木酚顯色法（張蜀秋等，2011）;APX活性的測(cè)定參考Nakano & Asada（1981）的方法，并略加修改。（4）總黃酮的提取采用超聲法：乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取時(shí)間40 min、料液比1∶25（g·mL-1）、功率40%、溫度75 ℃，測(cè)定參考曹群華等（2004）的方法。（5）總黃酮對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定參考張曉璐和徐凱宏（2008）的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 365整理數(shù)據(jù)，SPSS 17.0進(jìn)行相關(guān)性分析，Origin 7.5進(jìn)行雙樣品t 檢驗(yàn)，

P<0.05 差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)氧化氫和膜脂過(guò)氧化程度對(duì)不同輻射時(shí)間的響應(yīng)

增強(qiáng)UV-B輻射，顯著加劇了肋果沙棘葉片中H2O2含量及膜脂過(guò)氧化程度（MDA含量），在輻射1 d時(shí)，與CK相比差異不明顯，之后隨輻射時(shí)間的延長(zhǎng)，H2O2和MDA含量總體呈上升趨勢(shì)，且均在輻射2 d后出現(xiàn)顯著升高現(xiàn)象，于6 d后達(dá)到最高值，分別與CK相比增加了107.9%和48.6%（圖1：A， B）。

2.2 抗氧化酶活性對(duì)不同輻射時(shí)間的響應(yīng)

隨著UV-B脅迫時(shí)間的增加，4種抗氧化酶表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。SOD活性只在輻射1～2 d時(shí)有明顯提高，在3 d開(kāi)始與CK相比無(wú)顯著差異，維持于平穩(wěn)狀態(tài)（圖2：A）。CAT活性在輻射處理后逐漸升高，并于2 d后上升速度加快，隨輻射時(shí)間的延長(zhǎng)，于6 d時(shí)達(dá)到最高值，較CK增加了31.8%（圖2：B）。而APX、POD在UV-B輻射處理下活性明顯降低，分別于5 d和4 d達(dá)到最低值，較CK降低了40%、82.6%，雖在后期其活性有所回升，但均顯著低于CK，且POD的活性變化較APX更為敏感（圖2：C，D）。

2.3 總黃酮含量對(duì)不同輻射時(shí)間的響應(yīng)

UV-B輻射對(duì)肋果沙棘幼苗葉片中總黃酮含量的積累具有顯著影響，在輻射處理期間，其含量隨輻射時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，且均顯著高于處理前的水平，并于輻射5 d達(dá)到最大值，

較CK增加了35.5%，但隨輻射時(shí)間的延長(zhǎng)，在輻射6 d時(shí)較輻射5 d下降了9%（圖3）。

2.4 不同輻射時(shí)間下總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率

通過(guò)對(duì)肋果沙棘幼苗葉片中總黃酮的抗氧化活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同輻射時(shí)間下總黃酮對(duì)清除DPPH自由基的能力有顯著差異。如圖4所示，總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率隨輻射時(shí)間的延長(zhǎng)明顯上升，在輻射處理3～5 d時(shí)，清除率趨于平穩(wěn)且顯著高于其他處理時(shí)間，并于4 d時(shí)達(dá)到最大值，清除率為85.7%，較CK提高8.2%。通過(guò)相關(guān)性分析表明，不同輻射時(shí)間下DPPH自由基的清除率與總黃酮含量之間呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

肋果沙棘幼苗葉片在增強(qiáng)UV-B輻射4 d后，開(kāi)始出現(xiàn)卷曲、輕度萎蔫、葉緣褪綠的現(xiàn)象，且表現(xiàn)出積累效應(yīng)。植物葉片是對(duì)UV-B、干旱、低溫等逆境較為敏感的器官，葉片會(huì)快速直接地作出響應(yīng)。但當(dāng)遭受到脅迫時(shí)，在植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)還未發(fā)生明顯可見(jiàn)的變化前，其體內(nèi)ROS就已發(fā)生產(chǎn)消失衡，誘導(dǎo)H2O2等活性氧含量增加，誘發(fā)膜脂過(guò)氧化，出現(xiàn)MDA積累，進(jìn)而造成氧化損傷。與高欣（2015）和魏曉雪等（2011）對(duì)木本植物的研究結(jié)果相似，在本實(shí)驗(yàn)中，增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)肋果沙棘幼苗葉片的H2O2和MDA含量有較大影響，且隨UV-B輻射的時(shí)間延長(zhǎng)，H2O2和MDA含量都顯著增加。

抗氧化酶系統(tǒng)可直接或間接地去除植物細(xì)胞中的ROS，從而減輕植物細(xì)胞受損程度（卡迪爾·阿布都熱西提，2018），因此成為植物抵御脅迫的主要防御機(jī)制之一。其中存在于植物葉片細(xì)胞中不同部位的SOD、CAT、APX及POD，在清除細(xì)胞ROS的不同階段發(fā)揮著不同作用。SOD主要存在于細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和線粒體中，可以使O2-·歧化為H2O2和O2，是構(gòu)成植物抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的第一道防線（Alscher et al.， 2002; Ding et al.， 2010）;而主要位于過(guò)氧化物體中的CAT和APX以及POD，則可消除H2O2。本研究中，肋果沙棘幼苗在UV-B輻射下，其葉片SOD活性在1～3 d較CK有所提高，但在輻射后期略有降低然后趨于平穩(wěn)，與CK無(wú)顯著差異，說(shuō)明前期的輻射有助于SOD提高活力以清除O2-·，雖在后期其活力略有下降，但仍與對(duì)照幾乎處于同一水平，同時(shí)這種較高的SOD活性，也可能是導(dǎo)致肋果沙棘葉片內(nèi)H2O2含量較高的原因之一。CAT在輻射過(guò)程中一直表現(xiàn)為活性增加的趨勢(shì)，且與對(duì)照差異顯著，而POD和APX活性均低于處理前水平，雖在輻射后期有所回升，但仍與對(duì)照有顯著差異，說(shuō)明CAT在增強(qiáng)UV-B輻射持續(xù)處理肋果沙棘幼苗的過(guò)程中，一直對(duì)ROS的清除起主要作用，而POD和APX雖對(duì)脅迫產(chǎn)生了一定的適應(yīng)性反應(yīng)，但具有一定的局限性。這些結(jié)果表明，肋果沙棘幼苗對(duì)較高劑量的UV-B輻射可能存在一定的耐受性，并能夠通過(guò)協(xié)調(diào)各抗氧化酶活性，達(dá)到減少UV-B輻射對(duì)肋果沙棘幼苗產(chǎn)生傷害的目的。

通過(guò)次生代謝產(chǎn)生紫外吸收物質(zhì)是植物除了抗氧化酶系統(tǒng)外的又一抵御UV-B輻射傷害的有效防御機(jī)制。黃酮類物質(zhì)主要分布于植物體近莖葉表皮細(xì)胞、葉蠟和葉茸毛及新生幼苗或幼葉中，已有研究表明，它不僅是UV-B輻射的主要吸收物質(zhì)，可通過(guò)在植物地上部分表皮層的累積以有效減少UV-B輻射在表皮層的透過(guò)率，而且還可發(fā)揮作為自由基（如羥自由基、氧自由基）清除劑等的抗氧化作用（Anna et al.， 2013），協(xié)助抗氧化酶系統(tǒng)以共同抵御UV-B輻射對(duì)植物造成的氧化損傷。而DPPH就是一種以氮為中心的穩(wěn)定的有機(jī)自由基，用于評(píng)估化合物抗氧化性的強(qiáng)弱（Foh et al.， 2010）。前人研究發(fā)現(xiàn)，青藏高原特有木本植物肋果沙棘幼苗葉片的總黃酮基礎(chǔ)值高于苦蕎、鐵皮石斛、小麥、彩色馬鈴薯等一些草本植物（孟朝妮等，2005;董新純等，2006;張新永等，2009;莫運(yùn)才等，2015），且增強(qiáng)UV-B輻射能夠誘導(dǎo)其總黃酮含量增加，Warren et al.（2002）在對(duì)其他木本植物的研究中也得到了類似結(jié)論，肋果沙棘幼苗葉片的總黃酮含量出現(xiàn)下降，這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的UV-B輻射致使葉片的氧化損傷加劇。在增強(qiáng)UV-B輻射處理過(guò)程中，不同輻射時(shí)間下總黃酮清除DPPH自由基的能力隨輻射時(shí)間的增加而增強(qiáng)，清除率可高達(dá)79.18%～85.70%，并呈現(xiàn)出與總黃酮含量變化一致的趨勢(shì)，二者具有顯著的正相關(guān)關(guān)系。以上結(jié)果表明，增強(qiáng)UV-B輻射能促使肋果沙棘幼苗葉片積累總黃酮，此類黃酮化合物除可先行屏蔽一部分紫外輻射外，還可作為自由基的清除劑，參與植物的抗氧化反應(yīng)，與抗氧化酶系統(tǒng)在抵抗氧化損傷中共同協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，從而增強(qiáng)對(duì)UV-B輻射的抵御能力。肋果沙棘幼苗葉片中較高的總黃酮含量可能是其在高寒強(qiáng)紫外環(huán)境下的長(zhǎng)期進(jìn)化形成的適應(yīng)環(huán)境的對(duì)策。但當(dāng)輻射時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，會(huì)對(duì)其葉片細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的傷害，損傷的積累效應(yīng)增強(qiáng)，從而造成總黃酮的合成困難。

綜上所述，在抗氧化酶系統(tǒng)中，肋果沙棘幼苗以提高CAT活性為主要機(jī)制，并通過(guò)協(xié)調(diào)各抗氧化酶之間的活性，來(lái)降低氧化損傷。而其較高水平的黃酮類物質(zhì)代謝和積累在吸收紫外輻射和清除自由基方面也起著重要作用。這兩大防御機(jī)制相互協(xié)同發(fā)揮作用，以抵抗UV-B輻射為其帶來(lái)的傷害，這可能是肋果沙棘應(yīng)對(duì)高海拔強(qiáng)UV-B輻射環(huán)境的適應(yīng)性對(duì)策。

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（責(zé)任編輯 何永艷）