乳酸菌降膽固醇作用及降解機(jī)制研究進(jìn)展

劉孝芳，雷文平，2，遲珺曦，劉成國，2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128）

膽固醇是一種人體必需的甾類化合物，其含量在血液中超出正常值時(shí)，人體則患高膽固醇血癥。19～20世紀(jì)，研究人員就針對膽固醇含量與人體健康的關(guān)系進(jìn)行了大量研究，1847年，VOGEL醫(yī)生發(fā)現(xiàn)動脈血管粥樣硬化斑塊中存在膽固醇；1913年，NIKOLAI ANITSCHOV發(fā)現(xiàn)血液中過剩的膽固醇造成嚴(yán)重的動脈硬化癥[1]。過剩的膽固醇含量會引起腦血栓、冠心病等心腦血管疾病，這類疾病一般靠他汀類藥物或手術(shù)治療，但手術(shù)治療風(fēng)險(xiǎn)大、價(jià)格高，他汀類藥物服用后對人體機(jī)能有損傷，副作用大、價(jià)格高。因此，如何降低治療的風(fēng)險(xiǎn)和價(jià)格是亟待解決的問題。從患者膳食著手，食用乳酸菌制品是治療高膽固醇血癥患者的有效方法[2]，大多數(shù)乳酸菌制品具有降膽固醇特性，且安全性高、價(jià)格低，可逐步替代藥物治療。

乳酸菌是一類無芽孢、革蘭氏染色呈陽性的細(xì)菌，它通過乳酸發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸、特殊酶系等物質(zhì)。以上物質(zhì)賦予乳酸菌諸多生理功能[3]：維持腸道平衡、增強(qiáng)免疫功能、延緩人體衰老、改善人體機(jī)能等。目前已證實(shí)乳酸菌對降低膽固醇產(chǎn)生顯著作用[4]，主要通過共沉淀作用、吸收吸附及蛋白質(zhì)調(diào)控作用實(shí)現(xiàn)。本文就國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于乳酸菌降膽固醇的體外、體內(nèi)研究及機(jī)制進(jìn)行總結(jié)，并對研究現(xiàn)狀進(jìn)行分析與展望，為后續(xù)深入乳酸菌降膽固醇作用研究奠定基礎(chǔ)。

1 乳酸菌降膽固醇特性

1.1 乳酸菌體外降膽固醇的效果

乳酸菌體外降膽固醇的效果一般是通過溶鈣圈法、甲基紅-溴酚藍(lán)顯色劑法[5]篩選出乳酸菌，再將菌株培養(yǎng)于含適量膽固醇培養(yǎng)基中，測定菌株對培養(yǎng)基中膽固醇的去除率。體外研究結(jié)果能夠證明乳酸菌具有降膽固醇的潛力，該結(jié)果是進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)。范穎等[6]對來源于西藏地區(qū)的乳酸菌進(jìn)行研究，利用鄰苯二甲醛方法測定膽固醇去除率，發(fā)現(xiàn)20株乳酸菌膽固醇去除率＞20%，其中植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）膽固醇去除率最高，可達(dá)47.89%。任大勇等[7]從東北傳統(tǒng)食品篩選出57株植物乳桿菌膽固醇去除率＞40%，其中6株去除率＞85%。吳海珍等[8]從酸奶、泡菜和青貯飼料中分離得到90株乳酸菌中，初篩得到18株膽固醇去除率＞35%的乳酸菌，其中植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）JY20和JY41效果最好，將其與山楂混合發(fā)酵后，與降脂有關(guān)的活性成分含量及膽固醇和膽鹽吸附能力顯著提高。研究表明，不同地區(qū)、不同種的乳酸菌，在體外降膽固醇的效果大多數(shù)呈良好狀態(tài)。

1.2 乳酸菌體內(nèi)降膽固醇的效果

在體外降解能力的基礎(chǔ)上，菌株還必須耐受人體內(nèi)嚴(yán)苛的消化環(huán)境，才能發(fā)揮降解體內(nèi)膽固醇的作用。自1974年以來，MANG G V等[9]研究發(fā)現(xiàn)，東非的馬賽人血清中的血脂含量普遍偏低，是由于馬賽人長期食用含嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）的發(fā)酵乳制品，從而猜測這種菌株具有降低人類血清中膽固醇含量的功能。PARK Y H等[10]研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）43121能夠降低對高膽固醇血癥誘導(dǎo)的豬血清膽固醇含量。HEO W等[11]利用泡菜中分離的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LRCC 5273喂食LP 5273組小鼠（以高膽固醇食物為食），又利用等量的生理鹽水喂食對照組小鼠（以商業(yè)正常食物為食），6周后測量小鼠的血脂含量，通過對比對照組和LP 5273組小鼠的膽固醇含量發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LRCC 5273具有體內(nèi)降膽固醇的作用。SAVARD P等[12]也曾通過58名健康志愿者連續(xù)食用4周加拿大Yoptimal酸奶（雙歧桿菌（Bifidobacterium）BB12和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）LA-5在每份酸奶中的含量為109CFU）的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Yoptimal酸奶中的活菌可降低志愿者血清膽固醇含量并維持在正常范圍內(nèi)。

體外呈現(xiàn)良好降膽固醇效果的菌株，在體內(nèi)不一定呈現(xiàn)。LIN S Y等[13]研究發(fā)現(xiàn)，服用了嗜酸乳桿菌（具備體外降膽固醇能力）的354名志愿者血液中的膽固醇含量并無顯著變化，由此說明具備體外降解能力的菌株，還要根據(jù)其對人體消化環(huán)境的耐受性及在胃腸道的定植情況，判斷是否可降低人體內(nèi)膽固醇含量。

2 乳酸菌降膽固醇作用機(jī)制

關(guān)于乳酸菌降膽固醇作用機(jī)制的假說，主要有以下幾類：①乳酸菌可分泌膽鹽水解酶，該酶將結(jié)合態(tài)膽鹽水解成游離的膽汁酸，在酸性環(huán)境下，游離的膽汁酸與膽固醇共同沉淀，以沉淀的形式排出體外；②乳酸菌的細(xì)胞膜通過吸附固定或直接吸收將膽固醇截留；③乳酸菌對膽固醇合成與分解中的關(guān)鍵酶、前體物質(zhì)等起調(diào)控作用，調(diào)控膽固醇在人體內(nèi)的代謝，進(jìn)而減少膽固醇在血液中的含量；④乳酸菌代謝產(chǎn)物能與游離的膽汁酸結(jié)合，游離的膽汁酸被結(jié)合后能抑制腸肝循環(huán)的進(jìn)行，以減少膽固醇的吸收。

2.1 乳酸菌自身酶的水解產(chǎn)物與膽固醇發(fā)生共沉淀

血液中膽固醇的來源主要有兩種，一種是通過外源性食物獲取的，另一種則是通過內(nèi)源性代謝自身合成的[14]。膽汁酸的生物合成與內(nèi)源性膽固醇的主要代謝去路有關(guān)，同時(shí)膽汁酸作為膽汁的重要組成成分具有乳化等作用，又與膽固醇的排泄有關(guān)，由此可見膽汁酸的代謝過程對人體內(nèi)膽固醇的排泄起著重要作用。

膽汁酸按照結(jié)構(gòu)分為兩類，一是游離型膽汁酸；二是結(jié)合型膽汁酸，由游離型膽汁酸與甘氨酸或?；撬崴Y(jié)合而成，結(jié)合型比游離型膽汁酸更穩(wěn)定，在酸和Ca2+存在的情況下不易沉淀析出[15]。膽汁酸還可按來源分為兩類，一是初級膽汁酸，由膽固醇直接合成；二是次級膽汁酸，是初級膽汁酸在腸道中，由7α-羥化酶催化，經(jīng)脫羥基作用形成的。ISHIMWE N等[16]研究報(bào)道，初級膽汁酸是由食品中的膽固醇形成的，初級膽汁酸又與甘氨酸或?；撬嵬ㄟ^酰胺鍵結(jié)合成甘氨膽酸或牛磺膽酸最終形成結(jié)合型膽汁鹽。結(jié)合型膽汁鹽的溶解性較好，易被人體吸收進(jìn)入腸肝循環(huán)，導(dǎo)致膽固醇再血液中的積累。大量研究表明，乳酸菌能合成膽鹽水解酶，此酶作用導(dǎo)致酰胺鍵斷裂，將結(jié)合型膽汁鹽水解成游離的初級膽汁酸，而游離的初級膽汁酸溶解性差，不易被腸道吸收，以糞便的方式排出體外，最終使人體內(nèi)膽固醇含量降低或維持平衡。

“共沉淀”現(xiàn)象[17]是大多學(xué)者較認(rèn)可的降解機(jī)制，即乳酸菌發(fā)酵液pH值＜6.0時(shí)，體系中游離的膽汁酸開始沉淀，但此時(shí)的膽固醇未沉淀；一旦將pH值調(diào)節(jié)到＜5.5時(shí)，體系中的膽固醇會隨著游離的膽汁酸一起沉淀?！肮渤恋怼爆F(xiàn)象受到體系中pH值和膽固醇膠束穩(wěn)定狀態(tài)的共同影響[18]，游離的膽汁酸的酸度系數(shù)（pKa）較低，一般為5.0～6.0，當(dāng)環(huán)境中的pH值＜5.0時(shí)，游離膽汁酸的溶解性變得極差，由TAHRI K 等[19]的體外試驗(yàn)證明，體系中的pH值為4.0～5.5時(shí)，游離的膽汁酸和膽固醇共沉淀，當(dāng)利用緩沖劑將pH值回升到7.0時(shí)，沉淀發(fā)生了可逆性的溶解，以上可見“共沉淀”在4.0＜pH＜5.5的范圍內(nèi)發(fā)生。另外，在培養(yǎng)基中，當(dāng)膽固醇以膠束狀態(tài)存在時(shí)，結(jié)合型膽汁鹽有利于維持它的穩(wěn)定存在，但在酸性環(huán)境下，游離的膽汁酸可以打破膽固醇膠束穩(wěn)定的狀態(tài)，從而發(fā)生共沉淀；若膽固醇以非膠束狀態(tài)存在，即便體系中的pH值降至4.0，這種非膠束狀態(tài)的水溶性膽固醇也不會隨游離的膽汁酸沉淀而共沉淀[20]，由此說明“共沉淀”現(xiàn)象的發(fā)生與膽固醇存在的形式及膠束狀態(tài)下的穩(wěn)定性密切相關(guān)，只有當(dāng)體系環(huán)境pH值處于4.0～5.5，且膽固醇以膠束狀態(tài)存在時(shí)，這一降解機(jī)制才成立。BRASHEARSM M等[21]利用干酪乳桿菌探索菌株去除膽固醇機(jī)制的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了此觀點(diǎn)。

2.2 乳酸菌對膽固醇的吸收與吸附作用

乳酸菌不僅能利用自身酶的作用，使體系降低對膽固醇的吸收，還能通過自身組織結(jié)構(gòu)截留膽固醇。乳酸菌能直接吸收膽固醇至細(xì)胞內(nèi)，也能將膽固醇吸附在菌體的細(xì)胞膜表面，從而達(dá)到去除膽固醇的目的。目前已有研究報(bào)道乳酸菌對膽固醇的吸收吸附作用，NOH D O等[22]研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌ATCC 43121具備吸收膽固醇的能力。李雅迪[23]通過實(shí)驗(yàn)得到植物乳桿菌S11菌株在含有膽固醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，菌株針對培養(yǎng)基中的膽固醇去除率高達(dá)79.17%，同時(shí)檢測到實(shí)驗(yàn)組以下組分中膽固醇的含量：①培養(yǎng)上清液中約為0.021 mg/mL②菌體破碎后洗脫上清液中約為0.036 mg/mL③菌體細(xì)胞碎片懸浮液中約為0.002 mg/mL。實(shí)驗(yàn)組菌體破碎后洗脫上清液的膽固醇含量比對照組的高0.033 mg/mL，說明該植物乳桿菌S11能直接吸收膽固醇以降低膽固醇含量。LIONG M T等[24]研究也表明，所有的乳酸菌菌株能夠吸收膽固醇，其吸收的范圍在12.03～32.25 μg/mL。

細(xì)胞膜是菌體固有的結(jié)構(gòu)，只要結(jié)構(gòu)存在，膽固醇就能被吸附，KIMOTO H等[25]報(bào)道活菌體和熱殺死菌體都可以脫除培養(yǎng)基中的膽固醇，但熱殺死菌體的膽固醇去除率遠(yuǎn)不及活菌體。以此可見，細(xì)胞膜本能地對膽固醇進(jìn)行吸附。趙瑞香等[26]利用電鏡掃描觀察嗜酸乳桿菌菌體吸附膽固醇的現(xiàn)象，在不含膽固醇培養(yǎng)基中的菌體表面平滑、無附著痕跡，形狀為細(xì)桿狀，而在含膽固醇培養(yǎng)基中的菌體表面粗糙、附著痕跡明顯，形狀為粗短桿狀或橢圓狀。呈被吸附狀態(tài)的膽固醇比較穩(wěn)定，一般的洗滌方式不能破壞這種穩(wěn)定，但可通過離心方式破壞。此外，菌體吸附膽固醇后可能改變了細(xì)胞膜的組成結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜的韌度也隨著結(jié)構(gòu)的變化而增強(qiáng)[27]，不含膽固醇培養(yǎng)基中的菌體和含膽固醇培養(yǎng)基中的菌體同時(shí)進(jìn)行超聲波處理，結(jié)果表明后者對超聲波的抵抗能力更強(qiáng)，云月英等[28-29]均證實(shí)吸附膽固醇的菌株對超聲波的抗性強(qiáng)。以上試驗(yàn)均證明菌體能夠通過細(xì)胞膜吸收、吸附的方式降低膽固醇（吸附作用對降解膽固醇的作用影響甚微），但這些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象均出自于體外探究，僅能視為乳酸菌體外降解膽固醇的方式。

2.3 乳酸菌控制膽固醇代謝的相關(guān)蛋白質(zhì)

膽固醇在人體內(nèi)的吸收、合成、分解均與蛋白質(zhì)的表達(dá)有關(guān)。3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMG-CoA-R）、膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7 alpha hydroxylase，CYP7A1）控制著體內(nèi)膽固醇的合成；尼曼-匹克C1型類似蛋白1（niemann-pick type C1 like 1，NPC1L1）參與著膽固醇的吸收過程；CYP7A1、膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）能促進(jìn)膽固醇的分解與排泄。

甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）是合成膽固醇的前體物質(zhì)，它是由3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）經(jīng)HMG-CoA-R催化生成的，因此HMG-CoA-R作為膽固醇合成中的限速酶，乳酸菌通過抑制其活性便可降低膽固醇的合成量。膽酸同樣作為合成膽固醇的前體物質(zhì)，其合成過程中的限速酶是CYP7A1，乳酸菌可提高CYP7A1的活性，控制膽酸的合成速率從而抑制體內(nèi)膽固醇的合成[30]。WANG C Y等[31]發(fā)現(xiàn)，用乳酸菌發(fā)酵的谷物糊狀物喂養(yǎng)高脂倉鼠，能使高脂倉鼠CYP7A1的活性增強(qiáng)，最終將體內(nèi)富余的膽固醇以糞便的形式排出體外。LI C等[32]發(fā)現(xiàn)，高脂大鼠口服植物乳桿菌NCU116后，CYP7A1的表達(dá)得以改善，高脂大鼠通過體內(nèi)對CYP7A1的調(diào)控來控制自身脂質(zhì)代謝，以保持正常膽固醇含量。小腸內(nèi)膽固醇的吸收與NPC1L1表達(dá)密切相關(guān)，NPC1L1是膽固醇吸收過程中的轉(zhuǎn)運(yùn)體。田建軍等[33]報(bào)道乳酸菌可以抑制NPC1L1的表達(dá)，再進(jìn)一步地抑制膽固醇的吸收，此文還提到CYP7A1在膽固醇分解中起作用，它也是膽固醇分解代謝過程中的限速酶，提高它的活性不僅可以抑制膽固醇的合成還能加強(qiáng)膽固醇的分解排泄。BSH在“共沉淀”現(xiàn)象中也起著關(guān)鍵性作用，由BSH催化形成的游離態(tài)膽酸在酸性條件下與膽固醇共同沉淀排出體外，董改香等[34]經(jīng)研究表明，乳酸菌BSH活性高低影響小鼠血液膽固醇含量。以上提到的蛋白質(zhì)、前體物質(zhì)，類似“控制閥”，乳酸菌能對它們進(jìn)行控制，以便促進(jìn)或抑制膽固醇在體內(nèi)的合成、分解。膽固醇血癥、心腦血管疾病的治療，一般采用含以上蛋白質(zhì)的藥物來緩解病癥，同樣地，乳酸菌也具備這樣的潛力。

2.4 乳酸菌的代謝產(chǎn)物與膽固醇黏附

乳酸菌的代謝產(chǎn)物種類繁多，胞外多糖就是其中一類。胞外多糖是乳酸菌在生長代謝途中分泌至細(xì)胞壁外的一類碳水化合物。突破以往的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，這種由乳酸菌產(chǎn)生的分泌物—胞外多糖，也具備降低血液中膽固醇含量的能力，BHAT B等[35]研究發(fā)現(xiàn)，從人乳中分離得到的產(chǎn)胞外多糖副干酪乳桿菌M7有良好的降低膽固醇功能特性，體外試驗(yàn)顯示產(chǎn)胞外多糖的副干酪乳桿菌M7能呈現(xiàn)較高的膽固醇降低活性（70.78%）。PIGEON R M等[36]通過研究報(bào)道，利用產(chǎn)胞外多糖菌體發(fā)酵的發(fā)酵乳喂養(yǎng)小鼠，可以降低小鼠的血清膽固醇含量，而不產(chǎn)胞外多糖菌體發(fā)酵的發(fā)酵乳未能達(dá)到此效果。具有降低膽固醇的效果還要?dú)w結(jié)于產(chǎn)胞外多糖的菌體可以黏附游離的膽汁酸，切斷結(jié)合型膽汁酸的合成，進(jìn)而降低膽固醇的合成量。隨即猜測胞外多糖可能對膽固醇的結(jié)合、吸收、排泄等代謝過程起到了重要的作用。“胞外多糖和游離膽汁酸的黏附”與共沉淀機(jī)制中“與游離的膽汁酸結(jié)合”頗為相似，前者是胞外多糖與游離的膽汁酸結(jié)合，結(jié)合后導(dǎo)致膽汁酸無法被腸道吸收，抑制了腸肝循環(huán)的進(jìn)行，而后者是膽固醇與游離的膽汁酸結(jié)合，二者在酸性條件下形成沉淀排出體外。

3 結(jié)論與展望

人體血液中的膽固醇含量超出正常范圍值，隨著血液的黏稠度提高，人體的心臟負(fù)荷增加。另外黏稠物還可以在血管壁上堆積，出現(xiàn)血管粥樣硬化斑塊的現(xiàn)象，是心腦血管疾病的前兆。關(guān)于乳酸菌各種降膽固醇假說機(jī)制，其中游離的膽汁酸去路是值得更深入研究的。起初報(bào)道游離的膽汁酸通過直接結(jié)合膽固醇的方式降低了膽固醇的溶解性，以沉淀的方式排出體外，再是游離的膽汁酸與胞外多糖的結(jié)合，從而抑制腸肝循環(huán)和腸道對膽固醇的吸收，那么在膽固醇代謝過程中，游離的膽汁酸產(chǎn)生與排泄途徑值得人們更深入的了解和探討。除此之外，實(shí)驗(yàn)篩選出的菌株，其降解膽固醇能力又受自身種類、生長狀況及培養(yǎng)條件等影響，不僅同一菌屬的菌體降解能力差異大，而且同一株菌在同一批次的實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出的降解能力仍有一定的差異。在未來的研究中，怎樣縮小同一菌株降解能力的差異性也顯得尤為重要。

如果要將降膽固醇乳酸菌制品應(yīng)用到生產(chǎn)加工中，首先要保證安全性。因?yàn)樵谀扄}水解酶將結(jié)合型膽汁鹽水解成游離的膽汁酸時(shí)，會伴有脫氧膽酸和石膽酸的產(chǎn)物，而這兩種膽汁酸對人體有致癌作用。此外，還可從來源上抑制人類對高膽固醇食物的攝取，進(jìn)而控制人體內(nèi)膽固醇的含量，如讓牲畜食用降解膽固醇的菌株，家雞食用后，雞蛋內(nèi)膽固醇含量明顯降低，食用這種低膽固醇含量的雞蛋將不會增加人體患高膽固醇血癥的風(fēng)險(xiǎn)。微生物降低人類患病概率具有相當(dāng)多的優(yōu)勢，乳酸菌作為微生物的一種，用來降低膽固醇含量有著廣闊的發(fā)展前景。