QuEChERS技術在食品真菌毒素檢測中的研究進展

趙英蓮，張梓琪，趙 鑫，張 洋，李 默，李曉娟，

（1.中國檢驗檢疫科學研究院 綜合檢測中心，北京 100124；2.中檢科（北京）測試技術有限公司，北京 100124）

真菌毒素又稱霉菌毒素，主要是一類由產毒絲狀真菌產生的有毒次生代謝產物。目前，已發(fā)現了300～400種真菌毒素。在條件適宜的情況下，農作物極易受到這些真菌侵染，從而造成真菌毒素污染，威脅人畜健康。據報道，全世界超過25%的農副產品被霉菌毒素污染，其中2%的農產品因污染嚴重而失去營養(yǎng)和經濟價值，從而造成數百億美元的經濟損失[1]。為了避免及最大限度降低真菌毒素的危害，在做好農產品倉儲以防止霉菌滋生的同時，進行真菌毒素的檢測尤為重要。國內外學者運用不同的檢測技術對食品中真菌毒素的檢測方法做了大量的研究。對真菌毒素的檢測的研究主要集中在應用單一實驗方法或分析儀器進行是單一類毒素的檢測，如應用薄層分析（thinlayer chromatography，TLC）[2]、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[3-4]、毛細管電泳色譜法（capillary electrophoresis，CE）[5]和高效液相色譜法[6]（high performance liquid chromatography，HPLC）等檢測不同真菌毒素。隨著現代分析技術的發(fā)展和推廣，越來越多的分析學者將高通量分析的儀器應用到對種真菌毒素的分析。例如氣相色譜-串聯(lián)質譜法[7]（gaschromatography-tandemmassspectrometer，GC-MSMS）、液相色譜-串聯(lián)質譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometer，LC-MS-MS）[8-9]。這些儀器既具有色譜法的高分離效率，又有質譜法定性專屬性的能力，成為真菌毒素檢測中的首選儀器分析方法。

這些儀器分析方法的廣泛應用，還需要有效的樣品前處理方法為基礎，以保證最后的分析結果。目前應用于真菌毒素的提取方法包括固相萃取[10]、超臨界萃取[11]、加速溶劑萃取[12]和免疫親和柱[13]等。這些方法多數用于單一類真菌毒素的提取，針對于多種真菌毒素的分析報道較少。免疫親和柱雖然能同時分析多種真菌毒素，但是價格昂貴，增加了分析成本。而一種新型的多種真菌毒素樣品前處理方法—QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged and safe）[14-16]由于其高效、簡便和環(huán)保的特點，逐漸地在真菌毒素分析檢測領域得到廣泛應用。利用該技術，能夠有效地提取和凈化基質中多種真菌毒素，從而降低食品中真菌毒素的暴露風險，保證食品安全。本文根據QuEChERS 技術的特點，探討了應用QuEChERS技術對真菌毒素進行預處理過程中，提取、鹽析和凈化步驟所應用的方法及對真菌毒素提取效率的影響，總結了QuEChERS技術在食品真菌毒素檢測中的應用，并提出該技術現階段應用中亟待解決的問題，提出了展望和建議，旨在推動QuEChERS技術在真菌毒素領域的深入應用。

1 真菌毒素的在食品中的存在及危害

真菌毒素是絲狀真菌在新陳代謝過程中產生的化學結構各異且對人和動物有害的生物活性物質。自然界中的真菌毒素多以固體形式存在，大多數真菌毒素化學性質穩(wěn)定、不易分解、易溶于有機試劑且熔點高[1]。常見的真菌毒素包括黃曲霉毒素（aflatoxins，AFs）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、伏馬菌素（fumonisins，FUN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和展青霉素（patulin，PAT）等。AFs主要是由黃曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）、特異曲霉（Aspergillus specific）和假溜曲霉（Aspergillus tamarii）產生的代謝產物，主要污染糧油食品、玉米、花生、堅果類、乳及乳制品。其中以花生和玉米污染最嚴重的。它們能夠抑制脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）的合成，破壞凝血機制，具有高致癌和高毒性。其中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的毒性最大，早在1993年就被國際癌癥研究所（International Agency for Research on Cancer，IARC）列為人類一級致癌物。OTA是由赭曲霉（Aspergillus ochraceus）、疣孢青霉（Penicillium verruculosum）、純綠青霉（Penicillium verrucosum）及另外幾種霉菌產生的，是異香豆素的衍生物，能夠危害人畜的泌尿系統(tǒng)，產生急性或慢性中毒，這類毒素主要污染玉米、花生、大米和小麥等谷物。ZEN是一類2,4-二羥基苯甲酸內酯化合物，具有類雌激素的作用，能與子宮內雌激素受體發(fā)生不可逆結合，導致生殖系統(tǒng)機能異常，主要存在于玉米、小麥、大麥和小米等谷物。FUN是由輪枝鐮孢菌（Fusarium verticillioide）與串珠鐮孢菌（Fusarium moniliforme）在適宜條件下產生的一類熱穩(wěn)定性較高的代謝產物，具有較強的肝臟和腎臟毒性[17]，主要污染玉米及其制品。DON是由鐮孢菌（Fusarium）在低溫條件下產生的，能夠使人產生頭痛、頭暈、嘔吐和中樞神經系統(tǒng)紊亂等癥狀，主要存在玉米、小麥等糧食制品中[18]。PAT是由青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）和絲衣霉屬（Byssochlamys）菌產生的一種有毒內酯[19]。它是一種神經毒物，具有致畸性和致癌性，主要存在于腐爛的蘋果和蘋果汁中。

2 QuEChERS技術簡介

QuEChERS前處理方法是由美國農業(yè)部于2003年提出的一種新型的樣品前處理方法，該方法最早應用于水果蔬菜中農藥殘留的分析[20-21]。因該方法具有快速、簡單、廉價、有效、可靠和安全的特點，所以在真菌毒素分析方面也得到普遍應用，現已成功地推廣和應用在多種真菌毒素的分析。QuEChERS方法一般包括3個步驟[22]：提取、鹽析和凈化。樣品（干燥的樣品，如谷物需要加水）先用乙腈、乙酸乙酯或者丙酮等有機溶劑提取，然后加入硫酸鎂和氯化鈉等試劑促進有機相和水相的分離，最后取部分提取液加入凈化劑（佛羅里硅土、乙二胺-N-丙基硅烷、石墨化炭黑和C18鍵合硅膠等）經過振蕩離心后，取上清液進行檢測。

2.1 QuEChERS技術優(yōu)勢

與傳統(tǒng)的真菌毒素提取凈化方法相比，QuEChERS方法具有如下優(yōu)勢：①儀器設備簡單，只需要離心機、振蕩器即可；②技術難度低、前處理步驟簡單；③耗時短。整個提取過程不超過30 min；④通過設計提取液比例、鹽包成分和凈化劑的種類，可實現真菌毒素的同時提取?；谝陨蟽?yōu)點，QuEChERS技術正逐漸成為真菌毒素檢測前處理領域研究的熱點。

2.2 QuEChERS操作過程

2.2.1 提取

提取作為QuEChERS技術的關鍵步驟之一，其效果決定了分析結果的準確性。在傳統(tǒng)方法中，乙腈、甲醇和丙酮均具有較好的提取效果，在QuEChERS法中，乙腈因其提取效率較高，且與色譜分析（LC-MS-MS或者GC-MS）的兼容性強，應用最多。但是對于極性敏感的化合物，還需要在提取液中加入乙酸、甲酸等物質以提高其萃取效果。如OTA和FUN，可以在提取液中加入一定比例的甲酸或乙酸[23-24]以提高其提取率。

甲醇的極性低于乙腈，對于部分極性化合物具有較好的提取效率。ZHANG J M等[25]研究發(fā)現，甲醇對谷物中的FB1、FB2和OTA的提取效率高于乙腈。但對于極性較強的真菌毒素如雪腐鐮刀菌烯醇（nivalenol，NIV）和DON，甲醇的提取率低于60%[26]。為了取得更好的提取效果，甲醇通常不單獨使用，而是與其他試劑混合使用。SOSPEDRA I等[26]以甲醇和乙腈體積比為85∶15的混合液作為提取液，應用于小麥粉中的NIV和DON的提取，回收率在86%～108%。

丙酮的極性與乙腈相似，與乙腈相比，揮發(fā)性更強，能夠縮短樣品濃縮的時間，對于AFs和OTA均有較好的提取效率[27]。但丙酮與水不易分層，鹽析效果差，提取雜質較多，基質效應強。MOL H G J等[28]比較了三種提取溶劑甲醇、乙腈、丙酮，對真菌毒素提取的影響，結果表明丙酮提取的回收率最高，其次是乙腈。而對于基質干擾，乙腈影響最小，甲醇最差。綜合考慮最終選擇乙腈為提取劑，回收率范圍為70%～120%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為5%～10%，且基質效應較低，能夠用于日常檢測。

2.2.2 鹽析

提取液中的殘留的水分會影響凈化劑的除雜能力，通過加入一些鹽可以降低有機相在水中的溶解度促進相分層和待測物向有機相中轉移。常用的鹽析劑有硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和醋酸鈉等。其中最常用的是硫酸鎂和氯化鈉。硫酸鎂有強結合水的能力，能夠顯著降低混合提取液中水的含量，氯化鈉能夠降低有機相的溶解度，可加速有機相和水相的分層。但是，硫酸鎂吸水會放出大量熱，添加過量的硫酸鎂，會迅速吸收樣品中的水分，容易造成樣品結塊從而導致提取溶劑與樣品接觸不完全，可能會導致提取率偏低。因此合理的鹽析劑使用量，能夠有效促進待測物的提取效率。在真菌毒素分析中，最常用的硫酸鎂和氯化鈉的質量比為4∶1，但也有其他的鹽析體系應用于真菌毒素的檢測[29-32]。史娜等[33]則采用硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸三鈉和二水結晶鹽、以及檸檬酸氫二鈉合一個半水結晶鹽為鹽析劑對豆制品中的14種真菌毒素進行檢測，該方法的回收率在65.3%～120.8%之間。

2.2.3 凈化

樣品經過鹽析之后，蛋白質、脂肪、有機酸、色素和糖等組分并不能全部從樣品中去除，這些物質會嚴重干擾分析結果。因此，一般采用石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）、碳18（carbon 18，C18）和乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondaryamine，PSA）等去除這些物質。GCB具有吸附平面結構的作用，可以脫除某些色素。同時它也能脫除具有平面結構的毒素，如AFs和ZEN等[34]，一般不建議用于這類毒素的檢測。C18（或十八烷基硅烷鍵合硅膠（ostade-cylsilane，ODS））作為使用廣泛的反相吸附材料，可利用非極性吸附非極性的性質，去除一些非極性的化合物，如淀粉、脂肪和糖等。蘇碧玲等[35]在分析糧食制品中的DON及其代謝衍生物和ZEN時，就采用了C18和弗羅里硅土作為凈化劑。PSA在結構上有兩個氨基，可以通過氫鍵結合去除碳水化合物、有機酸和少量色素。TREBSTEIN A等[32]在分析小麥和玉米中的DON、ZEN、T-2毒素、HT-2毒素時，發(fā)現PSA能夠有效地去除色素和酸性雜質，但是它也能夠與FUN和OTA分子上的羧基發(fā)生反應，如果PSA使用過量會導致這類毒素回收率偏低。王少敏等[36]利用QuEChERS前處理技術研究瓜蔞皮中22種真菌毒素時，考察了C18和PSA這兩種凈化劑的使用量對目標化合物回收率的影響，結果發(fā)現C18量過少或者過多，會導致HT-2和赭曲霉毒素的回收率低于60%；而過多的PSA會造成FUN的回收率下降，當兩者含量均為300 mg時，22種真菌毒素的回收率在80%～120%之間，相對標準偏差0.31%～7.43%。

3 QuEChERS技術在食品真菌毒素檢測上的應用

3.1 QuEChERS技術在植物源性食品中的應用

真菌毒素主要存在于谷物及其制品、堅果和水果等食品。對于含水量較低的且含有高淀粉和高蛋白（如玉米、小麥及其制品）的樣品，在提取和凈化過程中基質中的淀粉和蛋白質容易發(fā)生交聯(lián)性形成網狀結構，使樣品與毒素緊密結合，不易從樣品中游離出來。因此，在樣品處理時必須加入一定量的水，充分浸潤樣品，提高萃取效率[23-24]。CUNHASC等[37]對QuEChERS方法進行改進，并結合GC-MS快速分析了谷物中5種單端孢霉烯族毒素。由于樣品含有油、脂肪和色素，在提取時采用對這些物質親和性較弱的乙腈，考察了加水量對提取的影響，結果發(fā)現加入25 mL水能夠滿足回收率的要求。提取后先加入MgSO4和NaCl進行鹽析，再加入C18進行凈化，最后樣品經過衍生后進行GC-MS分析。該方法回收率在67%～101%，RSD范圍9%～21%，檢出限2～15 μg/kg。張海霞等[38]建立了QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法快速檢測玉米中7種真菌毒素ZEN、DON、OTA和黃曲霉（AFs）四項的檢測方法，樣品經過酸化乙腈水溶液提取，加入4gMgSO4和1gNaCl進行鹽析、120mgC18，200 mg PSA和600 mg MgSO4凈化，氮吹近干，甲醇定容后待測。該方法的檢出限為0.06～10.0 μg/kg，回收率為89.7%～112.9%，相對標準偏差＜8.7%，準確度和精密度均能夠達到真菌毒素檢測要求。

3.2 QuEChERS技術在動物源性食品中的應用

動物源性食品（例如肉、奶和蛋）也容易受到真菌毒素的污染，主要是因為動物食用了被真菌毒素污染的飼料和食品而殘留在肉、組織或者血液中。由于動物組織脂肪和蛋白質含量較高，需要根據不同的基質選擇提取溶劑和凈化劑。郭禮強等[39]利用QuEChERS方法結合液相色譜-串聯(lián)質譜法測定干腌火腿中15種真菌毒素，以1%甲酸-乙腈水溶液為提取液，無鹽析過程，直接用ODS凈化，該方法的定量下限為0.05～2.50 μg/kg，回收率為79.1%～95.5%，相對標準偏差（RSD）為3.2%～12.8%。KARASEVA N M等[40]采用QuEChERS方法對乳及乳制品樣品中的AFB1和AFM1進行提取和凈化，結合液液微萃取技術進行濃縮，最后經HPLC-火焰離子檢測器（flame ionization detector，FLD）檢測。該方法的AFB1和AFM1的檢出限分別為0.1 μg/kg和0.01 μg/kg，相對標準偏差低于6%。整個分析時間1.0～1.5 h，相對于免疫親和柱法，QuEChERS方法更加省時和節(jié)省成本。FRENICH A G等[41]利用QuEChERS前處理方法，建立了雞蛋中10種黃曲霉毒素的高效液相色譜-串聯(lián)質譜法，以1%乙酸甲醇水溶液為提取液進行提取，硫酸鈉和醋酸鈉為鹽析劑，無進一步的凈化過程，采用基質空白曲線進行校正，得到該方法的檢出限為1.0～5.0 μg/kg，回收率為70%～110%，相對標準偏差低于25%。該方法簡單、可靠、成本低，能夠滿足日常的檢測。

綜上所述，QuEChERS技術在多真菌毒素分析檢測中體現出的優(yōu)勢，使得該技術備受關注。但是由于樣品基質差異大，再加上有機干擾物的影響，使得部分真菌毒素的回收較低。為了降低基質干擾、提高回收率，需要對提取溶劑、鹽析劑和凈化劑進行正交試驗或者響應面設計試驗優(yōu)化，這需要進行大量的實驗完成。目前對于這一方面的研究甚少。周健等[42]針對雞蛋中一種雜曲霉毒素利用響應面法優(yōu)化QuEChERS法，該方法回收率在86.8%～90.4%之間，日間重復性RSD為1.5%～6.2%。

4 小結與展望

QuEChER方法不僅能夠滿足真菌毒素日常檢測分析的需求，還簡化了前處理過程，提高了樣品檢測效率，為多種真菌毒素的檢測提供了一個極具發(fā)展?jié)摿Φ姆较?。建立科學、準確、穩(wěn)定的可同時檢測食品中多種真菌毒素的預處理方法，是當前食品真菌毒素分析檢測領域急需解決的問題。由于QuEChER方法最早是針對果蔬中的農藥殘留所設計的，其他類型的樣品與果蔬基質具有一定的差異性，待測物的結構與理化性質也不同，不具有普遍適用性，需要進一步的改進，以滿足多種真菌毒素的檢測。

首先，提取溶劑的選擇。單一溶劑提取效率不高，不能一次性把所有毒素都提取出來，導致某個或者某些毒素的回收率僅為60%左右。研究人員可以通過設計不同比例的提取溶液進行優(yōu)化，選擇合適的提取方式（渦旋、振蕩、超聲等）來實現多種毒素的提取；其次，針對樣品的基質選擇鹽析劑的種類，并對鹽析劑的添加量進行優(yōu)化；最后，根據吸附劑對各種毒素的吸附能力，可以選擇多種凈化劑聯(lián)合使用，并通過正交試驗或者響應面設計優(yōu)化各自的添加量，降低對目標化合物的吸附，同時減小基質效應?？傊?，QuEChERS方法還需要在提取溶劑、鹽析劑和凈化劑方面進一步改進，以滿足真菌毒素的檢測分析，并推動其在真菌毒素領域的發(fā)展。