基于正交試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法優(yōu)化復(fù)方金錢草顆粒提取工藝

潘鵬超，陳嘯飛，諶 衛(wèi)，郭志勇，柴逸峰（海軍軍醫(yī)大學(xué)：. 藥學(xué)院藥物分析教研室，. 長(zhǎng)海醫(yī)院腎內(nèi)科，上海200433）

0 引言

復(fù)方金錢草顆粒由廣金錢草、車前草、光石韋以及玉米須四味中藥組成，為成方制劑，收錄于《中國(guó)藥典》（2015年版），該藥具有清熱利濕、通淋排石的作用，在臨床上常用于泌尿系結(jié)石、尿路感染證候者[1-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明復(fù)方金錢草顆粒具有利尿、抑制泌尿系結(jié)石形成、抗炎、抗氧化作用，能有效抑制結(jié)晶腎損傷，其中，廣金錢草作為君藥，發(fā)揮主要藥理作用，車前草和光石韋也起到一定輔助作用[4-7]。經(jīng)鑒定，復(fù)方金錢草顆粒中主要成分包含黃酮類、萜類、生物堿類、酚酸類、甾醇類、多糖類、揮發(fā)油等[8-9]。近年來(lái)研究表明，其主要活性成分為黃酮類、萜類、酚酸類以及多糖類[10-12]。因其成分復(fù)雜，極性強(qiáng)弱各異，目前的中藥提取方法主要有煎煮法、加熱回流法、半仿生提取法等[13-15]。然而，這些方法對(duì)于復(fù)方金錢草顆粒中指標(biāo)性有效成分提取的效率尚無(wú)系統(tǒng)研究，因此，目前復(fù)方金錢草顆粒尚無(wú)通用的提取工藝，有效成分含量未知。

正交試驗(yàn)因其具有較高的科學(xué)性，較短的操作時(shí)間以及簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)步驟被廣泛應(yīng)用于中藥材提取工藝優(yōu)化[16]。響應(yīng)曲面法通過(guò)直觀的等高線圖和三維立體圖比較各因素的相互作用且能通過(guò)回歸模型預(yù)測(cè)最佳提取參數(shù)，從而在醫(yī)藥食品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。本研究通過(guò)結(jié)合正交試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法兩種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，在選定14個(gè)復(fù)方金錢草顆粒代表性有效成分的基礎(chǔ)上，優(yōu)化得到有效成分含量最大化提取工藝，為后續(xù)該藥物的藥理藥效研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

200 g搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；BP121S電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；KQ-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Heraeus Multifuge X1R臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；Agilent1290 液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Agilent 6538 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）。

1.2 試藥

分析純無(wú)水乙醇(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)；質(zhì)譜純乙腈（Merck,Germany）、甲酸（Merck,Germany）；超純水（Milli-Q A10超純水制備系統(tǒng)美國(guó)Millipore公司）；二甲基亞砜（Merck,Germany）；芹菜素對(duì)照品、木犀草素對(duì)照品、大豆皂苷Ⅰ對(duì)照品（上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）；復(fù)方金錢草顆粒（每袋裝10 g）來(lái)源于長(zhǎng)海醫(yī)院腎內(nèi)科。

2 試驗(yàn)方法

2.1 試驗(yàn)因素水平選擇

通過(guò)前期的文獻(xiàn)調(diào)研以及對(duì)復(fù)方金錢草顆粒提取主要因素的考慮，筆者選取超聲提取時(shí)間（A）、超聲溫度（B）、乙醇比例（C）作為試驗(yàn)因素并確定了其因素水平表，具體見表1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

表1 試驗(yàn)因素水平表

分別精密稱取芹菜素、木犀草素、大豆皂苷Ⅰ對(duì)照品各5 mg，加一定量的二甲基亞砜（DMSO）溶解，得到濃度均為80 mmol/L的對(duì)照品溶液。

2.3 復(fù)方金錢草顆粒供試品溶液的制備

取復(fù)方金錢草顆粒進(jìn)行初步粉碎，精密稱取2.0 g，置于50 ml錐形瓶中，根據(jù)試驗(yàn)方案加入不同比例的乙醇提取液25 ml，稱定質(zhì)量并記錄，并按各提取條件進(jìn)行超聲加熱回流提取藥液，經(jīng)室溫冷卻后，再次稱定并用提取液補(bǔ)足損失的質(zhì)量，15 000 r/min離心20 min，取上清液并經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，得各供試品溶液。

2.4 色譜條件

色譜柱：XBridge BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水，B為0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫，洗脫條件見表2；進(jìn)樣量為3 μl，流速為0.4 ml/min，柱溫為40 ℃。

表2 梯度洗脫條件

2.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（正離子模式）；質(zhì)量掃描范圍:50～1 500m/z；干燥氣溫度: 350 ℃；干燥氣流速:11.0 L/min；霧化氣壓力: 45 psig；毛細(xì)管電壓: 4 000 V；碎片電壓: 120 V。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

2.6.1 芹菜素

取芹菜素對(duì)照品溶液，用DMSO溶液稀釋得到質(zhì)量濃度為0.676、1.351、2.027、2.702、6.756、13.512 μg/ml的工作溶液，按“2.4”“2.5”項(xiàng)條件進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制曲線。

2.6.2 木犀草素

取木犀草素對(duì)照品溶液，用DMSO溶液稀釋得到質(zhì)量濃度為0.217、0.716、1.073、1.431、3.578、7.156 μg/ml的工作溶液，按“2.4”“2.5”項(xiàng)條件進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制曲線。

2.6.3 大豆皂苷Ⅰ

取大豆皂苷Ⅰ對(duì)照品溶液，用DMSO溶液稀釋得到質(zhì)量濃度為1.886、7.545、11.317、15.090、22.635、45.270 μg/ml的工作溶液，按“2.4”“2.5”項(xiàng)條件進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制曲線。

2.7 精密度試驗(yàn)

取濃度為4.054 μg/ml的芹菜素、2.147 μg/ml的木犀草素、18.862 μg/ml的大豆皂苷Ⅰ混合對(duì)照品溶液，按“2.4”“2.5”項(xiàng)條件進(jìn)樣，在1 d之內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，并且連續(xù)進(jìn)樣4 d，測(cè)定其芹菜素、木犀草素、大豆皂苷Ⅰ的色譜峰面積并計(jì)算其各自的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）,考察其日內(nèi)精密度和日間精密度。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取復(fù)方金錢草顆粒提取液，平行制備6份，按“2.4”“2.5”項(xiàng)條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其芹菜素、木犀草素、大豆皂苷Ⅰ的色譜峰面積并計(jì)算其各自的RSD值,考察其重復(fù)性。

2.9 回收率試驗(yàn)

精密量取一定濃度的芹菜素、木犀草素、大豆皂苷Ⅰ混合對(duì)照品溶液和已知含量的復(fù)方金錢草顆粒提取液各0.5 ml混合，平行制備6份，按“2.4”“2.5”項(xiàng)條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其芹菜素、木犀草素、大豆皂苷Ⅰ的色譜峰面積并計(jì)算其各自的含量和RSD值，考察其加樣回收率。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取復(fù)方金錢草顆粒提取液，按“2.4”“2.5”項(xiàng)條件分別在0、6、12、24、48 h進(jìn)樣，測(cè)定其芹菜素、木犀草素、大豆皂苷Ⅰ的色譜峰面積并計(jì)算各自的RSD值，考察其穩(wěn)定性。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.1 芹菜素

如圖1A所示，回歸方程為Y=50 999X+33 373，r=0.999 9，表明芹菜素在0.676～13.512 μg/ml濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.1.2 木犀草素

如圖1B所示，回歸方程為Y=45 861X+15 784，r=0.999 9，表明木犀草素在0.215～7.156 μg/ml濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.1.3 大豆皂苷Ⅰ

如圖1C所示，回歸方程為Y=19 763X+68 383，r=0.999 9，表明大豆皂苷Ⅰ在1.886 ～45.270 μg/ml濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，日內(nèi)精密度試驗(yàn)中，芹菜素的RSD為0.98%，木犀草素的RSD為1.90%，大豆皂苷Ⅰ的RSD為2.18%，說(shuō)明這3個(gè)化合物的日內(nèi)精密度良好。日間精密度試驗(yàn)中，芹菜素的RSD為1.53%，木犀草素的RSD為0.87%，大豆皂苷Ⅰ的RSD為1.40%，說(shuō)明這3個(gè)化合物的日間精密度良好。

表3 日內(nèi)、日間精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

平行制備復(fù)方金錢草顆粒提取液，重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算，結(jié)果芹菜素的RSD為3.09%，木犀草素的RSD為2.83%，大豆皂苷Ⅰ的RSD為2.21%。說(shuō)明復(fù)方金錢草顆粒提取液進(jìn)樣測(cè)定的重復(fù)性良好。

3.4 回收率試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，芹菜素的平均回收率為99.58%，其RSD為1.24%；木犀草素的平均回收率為101.07%，其RSD為1.83%；大豆皂苷Ⅰ的平均回收率為100.59%，其RSD為1.22%，說(shuō)明該測(cè)定方法準(zhǔn)確性良好。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知，復(fù)方金錢草顆粒提取液在0、6、12、24、48 h共進(jìn)樣5次，3個(gè)成分的峰面積在48 h內(nèi)無(wú)明顯波動(dòng)，計(jì)算得芹菜素、木犀草素、大豆皂苷Ⅰ的RSD分別0.86%、3.83%、1.44%，說(shuō)明復(fù)方金錢草顆粒提取液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為探討復(fù)方金錢草顆粒最佳提取工藝，筆者采用復(fù)方金錢草顆粒中的指標(biāo)性成分的峰面積之和來(lái)代表其提取效果。共選取14種不同的化合物，為代表其合理性，在各味藥材中都選取一定數(shù)量的化合物，主要為經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道的有藥理作用的成分以及各味藥材中含量相對(duì)較高的成分。筆者采用UHPLC-TOF/MS對(duì)復(fù)方金錢草顆粒提取成分進(jìn)行鑒定，得到其質(zhì)譜總離子流圖及提取離子流圖（圖3），其化合物詳細(xì)信息見表5。

采用L9(33)正交試驗(yàn)表劃分各個(gè)試驗(yàn)的因素水平，其具體的試驗(yàn)方案和結(jié)果分析見表6。根據(jù)表6的試驗(yàn)結(jié)果分析，通過(guò)比較K值，得到其提取最優(yōu)參數(shù)水平為A1、B2、C2，通過(guò)比較極差R值，可以看到因素A的極差最大，其次為C、B，即超聲提取時(shí)間對(duì)復(fù)方金錢草顆粒的提取效果影響最大，其次是乙醇比例，最后是超聲溫度。結(jié)果表明，適宜超聲提取時(shí)間和溫度能促進(jìn)化合物的溶出，但當(dāng)超聲提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、溫度過(guò)高時(shí)，可能會(huì)破壞物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使得溶出的化合物含量反而降低；適宜的乙醇比例可以使復(fù)方金錢草顆粒中的水溶性和脂溶性成分都能最大限度的溶出。

表5 復(fù)方金錢草指標(biāo)性有效成分列表

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

進(jìn)一步采用IBM SPSS Statistics 19軟件對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，各因素對(duì)復(fù)方金錢草顆粒的提取效果由F值和P值進(jìn)行檢驗(yàn)，具體結(jié)果見表7。

對(duì)表7結(jié)果進(jìn)行分析，影響復(fù)方金錢草顆粒提取效果的因素中，A＞C＞B，這與上述根據(jù)表6的極差得到的結(jié)果一致。顯著性分析發(fā)現(xiàn)，因素A和因素C的P值＜0.05，差異顯著，而因素B＞0.05,其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表7 方差分析表

3.7 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用軟件Design-Expert 10，以超聲提取時(shí)間、超聲溫度、乙醇比例為自變量，指標(biāo)性化合物峰面積之和為響應(yīng)值設(shè)計(jì)試驗(yàn)。共設(shè)17組試驗(yàn)點(diǎn)，其中，分析點(diǎn)12個(gè)，零點(diǎn)5個(gè)，零點(diǎn)代表重復(fù)實(shí)驗(yàn)，常用于估算試驗(yàn)誤差。本試驗(yàn)方案及結(jié)果見表8。

將表8的試驗(yàn)結(jié)果輸入Design-Expert 10軟件進(jìn)行綜合分析，可以得到復(fù)方金錢草顆粒指標(biāo)性成分峰面積之和與各因素變量的回歸方程模型：

通過(guò)對(duì)表9的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，可以看到該模型的P＜0.01，r=0.960，失擬項(xiàng)顯著，說(shuō)明該模型雖存在試驗(yàn)誤差，但模型擬合度較好，能夠用來(lái)預(yù)測(cè)復(fù)方金錢草提取效果與各因素變量的關(guān)系。同時(shí)，各因素顯著性分析顯示,超聲提取時(shí)間（A）以及乙醇比例（C）的P＜0.05，說(shuō)明它們對(duì)復(fù)方金錢草顆粒的提取效果作用明顯，而超聲溫度對(duì)其提取效果影響不顯著，這與前面的正交試驗(yàn)結(jié)果相一致。

表8 響應(yīng)曲面試驗(yàn)方案及結(jié)果

表9 響應(yīng)曲面二次回歸模型的方差分析

3.8 響應(yīng)曲面各因素間的交互分析

利用Design-Expert 10軟件可以得到其等高線圖和3D響應(yīng)曲面圖，如圖4所示。其中，等高線的形狀反映兩者交互作用的強(qiáng)弱，圓形代表交互作用弱，橢圓形代表交互作用強(qiáng)。觀察發(fā)現(xiàn)，A圖顯示的超聲提取時(shí)間和乙醇比例交互作用最強(qiáng)，B圖顯示的超聲提取時(shí)間和超聲溫度交互作用次之，C圖顯示的超聲溫度和乙醇比例交互作用最弱。

3.9 復(fù)方金錢草顆粒最優(yōu)提取參數(shù)預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

使用回歸模型進(jìn)行最優(yōu)提取參數(shù)預(yù)測(cè)，得到當(dāng)超聲提取時(shí)間為10 min，超聲溫度為55.12 ℃，乙醇比例為54.56%時(shí)，得到的指標(biāo)性峰面積之和為77 471 863.44。結(jié)合實(shí)際操作，選用超聲提取時(shí)間10 min，超聲溫度55 ℃，乙醇比例55%進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)3次平行試驗(yàn)，得到其平均值為77 978 123.33，RSD為1.91%，與模型的預(yù)測(cè)值基本一致，表明該預(yù)測(cè)模型的穩(wěn)定性強(qiáng)、適用性良好。

4 結(jié)論

本研究的評(píng)價(jià)指標(biāo)為14個(gè)指標(biāo)性有效成分的峰面積之和，以乙醇為提取溶劑，采用正交試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法進(jìn)行復(fù)方金錢草顆粒提取工藝的優(yōu)化，正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，其最佳提取工藝參數(shù)為超聲提取時(shí)間10 min，超聲溫度60 ℃，乙醇比例50%；響應(yīng)曲面法則通過(guò)回歸模型對(duì)復(fù)方金錢草顆粒提取工藝參數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到其預(yù)測(cè)的最佳參數(shù)為：超聲提取時(shí)間10 min，超聲溫度55 ℃，乙醇比例55%，通過(guò)兩種試驗(yàn)方法得到的參數(shù)基本一致，且通過(guò)響應(yīng)曲面法預(yù)測(cè)得到的峰面積之和更大。綜上所述，我們選擇工藝參數(shù)為：超聲提取時(shí)間10 min，超聲溫度55 ℃，乙醇比例55%，并在此提取條件下進(jìn)行驗(yàn)證，其UHPLC-TOF/MS圖譜中峰面積之和平均值為77 978 123.33，說(shuō)明該模型穩(wěn)定可靠，可以用于復(fù)方金錢草顆粒的提取。

由于前期采用水提法提取復(fù)方金錢草顆粒，導(dǎo)致水溶性小的成分沒有被完全提取出來(lái)，故而改進(jìn)方法，采用一定比例的乙醇溶液為提取溶劑，并且優(yōu)化了最佳提取時(shí)間和溫度，使得其指標(biāo)性有效成分都能被有效提取，并為后續(xù)復(fù)方金錢草的藥效和藥理研究提供可靠的方法依據(jù)。