煙草西柏三烯二醇穩(wěn)定性及其抑菌活性研究

劉雨露 張建會 付秋娟 韓曉 解勝男 肖勇 杜詠梅

摘要：為明確西柏三烯二醇（CBT-diols）的穩(wěn)定性及其抑菌活性，采用高效液相色譜法定不同光照、溫度、pH、溶劑條件下CBT-diols的降解規(guī)律，并以煙草黑脛病病原真菌為供試材料，采用菌絲生長速率法研究CBT-dolls降解對抑菌效果的影響。結(jié)果表明，光照、溫度、pH、溶劑等均對Cbt-diols降解率產(chǎn)生顯著影響，且其降解率隨暴露時間延長而增加，但抑菌活性降低幅度顯著低于降解率升高幅度CBT-dois在陽光暴露63h后降解（36650.86）%，其抑菌率降低了（20.980.16）%日光燈光強410KLUX范圍內(nèi)，不同光強間CBT-diols降解率差異不顯著;隨溫度升高，CBT-dois降解率顯著升高，80℃條件下暴露40h后降解了（89032.29）%，菌絲生長抑制率降低了（55.000.72）%;CBT-dolls在pH79范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性和抑菌活性;CBT-dolls在乙醇溶劑中最穩(wěn)定，在二甲基亞砜、正丙醇溶劑中穩(wěn)定性相對較差;不同暴露條件下，B-CBT-dois穩(wěn)定性優(yōu)于q-CBT-dolls。

關(guān)鍵詞：煙草;CBT-dolls：穩(wěn)定性;抑菌活性

西柏三烯二醇（Cembratrien-diols，CBT-dolls）屬西柏烷型二萜（Cembranoid type diterpenes）類化合物，該類化合物主要存在于海洋生物（主要為軟珊瑚、柳珊瑚）及煙草、松屬、大戟屬等植物中，以煙草中含量最為豐富。CBT-dolls是煙草腺毛分泌物的主要成分，目前分離鑒定出的異構(gòu)體有兩個，分別為、-2，7，11-西柏三烯-4，6-二醇（、-CBI-doil）P2，不同類型煙草中兩者一般以2：1～3：1的比率存在。CBT-dolls在煙草花序中含量最高，可達3.5%5。研究表明，CBT-dolls不僅是卷煙優(yōu)雅香氣的重要前體物質(zhì)，還具有抑菌、殺菌、抗腫瘤和神經(jīng)保護等多種生物活性，在生物農(nóng)藥、醫(yī)藥等方向具有較好開發(fā)價值。目前國內(nèi)外對CBT-dolls的抗菌活性有較多的報道，MENETREZ等發(fā)現(xiàn)CBT-doil的兩種異構(gòu)體都可抑制煙草藍色霉菌孢子的萌發(fā)。KENNEDY等2研究發(fā)現(xiàn)α、B-CBT-diols對巴氏芽孢桿菌孢子的半數(shù)抑制濃度（ICso）分別為3.0和2.9ugm2隨后發(fā)現(xiàn)CBT-dolls可抑制黃瓜炭疽病孢子萌發(fā)。DUAN等采用生長速率法測定煙草提取物對來自子囊菌門、半知菌亞門和擔子菌門的11種致病性植物真菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)CBT-dolls是煙草提取物中的主要抑菌物質(zhì)。YANG等發(fā)現(xiàn)CBT-dois不同異構(gòu)體、β-CBT-doil對灰葡萄孢菌菌絲生長的FCs值分別為13.11和12.34mgL，兩者抑制率差異不顯著，且不存在協(xié)同增效作用。CBT-dolls還具有良好的調(diào)節(jié)植物生長、增強植株抗病性等活性，在植物源殺菌劑方向有較好開發(fā)前景究植物源提取物在自然環(huán)境下的降解特性及對其抑菌活性的影響，是進行殺菌制劑研發(fā)并提高藥效的基礎。本研究分析了不同光照、溫度、pH、溶劑等條件下CBT-dolls不同異構(gòu)體的降解規(guī)律，并以煙草黑脛病原真菌為材料，采用室內(nèi)菌絲生長速率法，研究了CBT-dolls降解對抑菌效果的影響旨在為CBT-dolls殺菌制劑研發(fā)利用和穩(wěn)定性的改良提供研究基礎。

1材料與方法

1.1材料及儀器

1.1.1供試材料煙草CBT-doil浸膏：本實驗室制備，質(zhì)量分數(shù)為70%，其中q-CBT-dolls：B-CBT-doil=3：1。

10%CBT-dolls微乳劑制備：準確稱取10%CBT-dolls浸膏，加入10%環(huán)己酮和20%正丁醇攪拌均勻，加入25%乳化劑3625，攪拌均勻透明后加水補足。

供試菌株：煙草黑脛病菌（Phytophthora parasiticavar.nicotianae），由中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所植物保護研究中心提供。

1.1.2試劑乙醇、二氯甲烷、環(huán)己酮、二甲基亞砜、正丙醇、正丁醇、檸檬酸、檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn);乙腈為色譜純，MERCK公司生產(chǎn)。

1.1.3主要儀器與設備WatersACQUITYUPLCH-class超高效液相色譜儀，美國Waters公司生產(chǎn);ZF-20D暗箱三用紫外分析儀，驥輝分析儀器有限公司生產(chǎn);CONVIRONADAPTIS-A1000探入式多用途植物培養(yǎng)箱，上海澤泉科技股份有限公司生產(chǎn)電熱恒溫鼓風干燥箱，杭州藍天化驗儀器廠生產(chǎn);SartoriusPB-10酸度計，賽多利斯科學儀器有限公司生產(chǎn)AL104電子分析天平（感量0001g），梅特勒-托利多儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2試驗設計

1.2.1試驗樣品制備參照張帥等的方法。稱取定質(zhì)量的CBT-dolls浸膏，配制成0.6%的CBT-dolls-二氯甲烷溶液，準確移取5mL配制好的上述溶液于直徑為6cm的玻璃培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿水平放置于通風櫥中，待溶劑自然揮發(fā)后，CBT-dolls均勻涂布在培養(yǎng)皿中，備用。

1.2.2CBT-dolls在不同光照、溫度條件下的穩(wěn)定性（1）CBT-doil陽光暴露試驗：該試驗于2019年9月10-17日（8：3017：30）在中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所四川省涼山州西昌市西南試驗基地進行，試驗地點晝溫20～24℃，光照強度3.73～68.8kLux。將1.2.1中制備的涂布CBT-dolls的培養(yǎng)皿放置于太陽光下照射（3.7368.8kLux），暴露時間分別為3、6、9、12、15、18、21、24、27、33、39、4554、63h，每處理3個重復，以0h處理為對照。各處理陽光暴露試驗完成后，培養(yǎng)皿中CBT-dolls用5mL95%乙醇溶解，用液相色譜法（1.3）測定CBT-dolls的含量，用菌絲生長速率法（1.4）測定不同處理的抑菌活性。

（2）不同光照強度及光源暴露試驗：將1.2.1中制備的培養(yǎng)皿放置于4、6、8、10kLux日光燈、

24W紫外燈下照射，暴露時間分別為：0、2、4、6、8、16、24h，每處理3個重復，以0h處理為對照。各處理光照暴露試驗完成后，CBT-dolls降解率測定同上。

（3）溫度處理試驗：將1.2.1中制備的培養(yǎng)皿放置于烘箱40、60、80℃恒溫加熱，暴露時間分別為：0、4、8、12、16、20、24、32、36、40h，每處理3個重復，以0h處理為對照。各處理溫度暴露試驗完成后，CBT-dolls降解率及抑菌活性測定同上。

1.2.3CBT-dolls在不同pH條件下的穩(wěn)定性配制pH為4、5、67、9、11的緩沖液。準確移取2mL09%6CBT-dolls微乳劑放入盛有28mL上述緩沖液的玻璃試管中，混勻，室溫避光放置0、1、2、3、4、5、6、7d，每處理3個重復，以0d處理為對照。各處理試驗完成后，CBT-dolls降解率及抑菌活性測定同1.2.2。

1.2.4CBT-dolls在不同溶劑條件下的穩(wěn)定性根據(jù)CBT-dolls溶解特性，選取環(huán)己酮、二甲基亞砜、乙醇、正丙醇、正丁醇為溶劑，分別配制成0.6%的CBT-dolls溶液，放入石英具塞試管中，置于8KLUX日光燈下照射，暴露時間處理分別為：0、1、2、3、4d，每處理3個重復，以0d處理為對照。各處理試驗完成后，CBT-dolls降解率測定同1.2.2。

1.3CBT-dolls檢測

參照付秋娟等的方法，利用超高效液相色譜（UPLC）進行檢測。以上各處理獲得的CBT-dolls溶液，用流動相（60%乙腈）稀釋、混勻，以0.22um有機濾膜過濾至液相安瓿瓶中，UPIC檢測。

CBT-dolls降解率計算公式：Y=（R-R，）/Rox100%，式中Y表示CBT-doil降解率（%）Ro表示對照處理的CBT-dollsI的質(zhì)量（mg）;R，表示光照等處理后CBT-dolls的質(zhì)量（mg）。

1.4不同處理抑菌活性測定

參照DUAN等的方法，采用菌絲生長速率法測定不同條件處理后的藥液對供試真菌的抑制作用，將藥液與培養(yǎng)基以1：100的體積比混勻制成含藥培養(yǎng)基，待凝固后，接入生長狀態(tài)一致的直徑為5mm的菌餅，于28℃培養(yǎng)，待對照平板菌圈生長至平板約2/3處時，用十字交叉法測定菌落直徑，然后按（1）、（2）式計算不同處理對煙草黑脛病病原菌菌絲生長的抑制率。

菌圈直徑（mm）=實際測得直徑-5

菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100

1.5數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SAS9.1和Excel軟件進行統(tǒng)計分析，應用Duncan氏新復極差法進行多樣本間差異顯著性檢驗（p《0.05）。

2結(jié)果

2.1光照對CBT-dolls降解及抑菌活性的影響

2.1.1陽光暴露條件下CBT-oils降解率的變化及

抑菌活性陽光暴露對CBT-dolls的降解率及抑菌活性的影響見圖1。由圖1看出，隨暴露時間延長，CBT-diols降解率呈持續(xù)增加趨勢，而其抑菌活性則呈持續(xù)降低趨勢。CBT-dolls在太陽光中暴露63h，降解率達（360840.07%，菌絲生長抑制率由（68340.34）%降低至（54.740，29）%，降幅為（20.980.16）%，其抑菌活性降低的幅度顯著低于降解率升高的幅度。CBT-dolls在陽光暴露627h范圍內(nèi)，其降解率及對菌絲生長的抑制率變幅均較小;暴露33h后，CBT-doil降解率迅速升高，但對菌絲生長的抑制率降幅較小，且在暴露時間33～63h內(nèi)，CBT-dolls對菌絲生長的抑制活性差異不顯著。

2.1.2不同光照強度及光源對CBT-dolls降解的影響不同光照強度及光源對CBT-dolls降解率的影響見圖2。由圖2看出，隨光照時間延長，不同光照強度的日光燈及紫外燈光源條件下，CBT-doilse的降解率均呈持續(xù)增加趨勢。本試驗條件下，CBT-dolls在日光燈4、6、8、10kLux光強和紫外光條件下暴露24h后降解率分別為（21.3540.70%（21.750.70）%、（21.260.96）%、（21.20生1.09）%（31.600.69）%。同一光照時間條件下，日光燈不同光照強度處理間CBT-dolls降解率差異不顯著。暴露時間16～24h范圍內(nèi)，紫外照射條件下CBT-coils降解率顯著高于4～10kLux日光燈照射。

2.2溫度對CBT-dolls降解及抑菌活性的影響不同溫度對CBT-doil的降解率及80℃處理對CBT-dolls抑菌活性的影響見圖3。由圖3看出，溫度處理48h內(nèi)，CBT-dolls降解速窣較慢，且不同溫度處理間降解速率差異不顯著，至12h以后，隨暴露時間延長，不同溫度處理CBT-dolls降解速率均呈顯著增加趨勢，且不同溫度處理間CBT-dolls降解速率差異顯著，表現(xiàn)為80℃》60℃》40℃;暴露40h時，CBT-dolls在40、60、80℃條件下的降解率分別為（13.53+0.91）%、（29.390.15）%、（89032.29）%80℃暴露40h后，CBT-dolls對菌絲生長抑制率降低了（55000.72）%，說明80℃條件下暴露12h后，CBT-dolls迅速降解，但其對菌絲生長抑制率降低速率低于其降解速率。

2.3溶液pH對CBT-dolls降解及抑菌活性的影響不同pH條件下CBT-dolls降解率及其抑菌活性的變化結(jié)果見表1、2。由表1看出，不同pH條件下，隨暴露時間延長，CBT-dolls降解率均呈顯著增加的趨勢。在pH45條件下，CBT-dolls降解幅度較大，穩(wěn)定性較差，而在pH6～11尤其是pH7-9條件下，降解幅度相對較小，穩(wěn)定性相對較好。由表2看出，pH4～11范圍內(nèi)，CBT-dolls1均保持較高的抑菌活性。

2.4溶劑對CBT-dolls降解的影響

CBT-doil在不同溶劑中降解率的變化結(jié)果見表3。由表3看出，隨暴露時間延長，CBT-dolls在不同溶劑中降解率均呈顯著增加趨勢，但在同一暴露時間條件下，CBT-dolls在不同溶劑中的降解率也存在顯著差異。CBT-dolls在乙醇、正丁醇、環(huán)己酮溶劑中降解率較低，穩(wěn)定性較好，尤其在乙醇中穩(wěn)定性最佳。因此在進行CBT-dolls殺菌劑的研制時，可首選乙醇作為溶劑。

2.5不同暴露條件對CBT-doil不同異構(gòu)體降解率的影響

為進一步考察不同暴露條件對CBT-dolls不同異構(gòu)體降解率的影響，將不同光照、溫度、pH、溶劑條件下暴露前后-CBT-dolls與-CBT-dolls的質(zhì)量比（ma/mg）列于表4.由表4看出，CBT-dolls在太陽光、紫外燈和日光燈4kLu暴露前后mmp值無顯著差異，而在日光燈6～10klux暴露后，mmp值顯著降低。

CBT-doil在40℃暴露40h，mm值無顯著差異，隨著溫度的升高，60-80℃暴露40h后mmp值均顯著降低，且溫度越高降幅越大。

不同pH值緩沖溶液中momp值差異較大，可能是由于緩沖溶液體系中的復雜離子對CBT-dolls結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。pH值46條件下暴露7d后，mmp值顯著降低，且pH值越低降幅越大。pH7-9條件下暴露7d后，mom值差異不顯著。綜合CBT-dolls及其不同異構(gòu)體在不同pH條件下降解率的差異，CBT-doil在pH7-9條件下較為穩(wěn)定。在環(huán)己酮溶液中暴露4d后，m/mp值顯著降低，而在二甲基亞砜、乙醇、正丙醇、正丁醇溶液中，mom值則變化不顯著。

綜上分析，不同條件下暴露后，mmp值或者差異不顯著，或者顯著降低，無m∥m值顯著升高的現(xiàn)象。在CBT-dolls降解率較低的情況下，α與β-CBT-dolls降解率差異不大，但在CBT-dolls降解率較高的情況下，β-CBT-dolls降解率低于a-CBT-dolls，說明β-CBT-doil穩(wěn)定性較-CBT-doli。

3討論

光化學降解是農(nóng)藥在環(huán)境中分解的主要途徑之ー，也是影響農(nóng)藥藥效及環(huán)境殘留的重要因素。

吳傳萬等1發(fā)現(xiàn)，在太陽光或20W紫外燈照射下，苦參堿光半衰期均小于1h，阿維菌素光半衰期均在3h左右。張帥等研究發(fā)現(xiàn)表魚藤酮365m紫外光照射后半衰期為2.3h。本研究表明，CBT-diols在太陽光（3.7～68.8kLux）、日光燈（4～10kLux）、紫外燈暴露條件下，均會發(fā)生降解，其24h降解率分別為13.27%、21.20%～21.75%、31.60%，CBT-diols陽光暴露63h降解率為36.08%。因此，與其他生物農(nóng)藥相比，CBT-dolls具有較好的光穩(wěn)定性。

CBT-diols在不同光源條件下暴露16h后，紫外光暴露下的降解率顯著大于陽光、日光燈，這可能由于Cbt-diols結(jié)構(gòu)中雙鍵的a位（烯丙位）易吸收紫外光發(fā)生自由基反應，從而使目標化合物產(chǎn)生降解。在日光燈4～-10kLux范圍內(nèi)，不同光照強度對CBT-diols降解率影響不大，這可能與CBT-diols對日光光波沒有吸收有關(guān)。

熱貯穩(wěn)定性是農(nóng)藥制劑質(zhì)量評價的重要指標。本研究表明，溫度對CBT-diols降解率影響較大，隨溫度升高，CBT-diols降解率呈顯著升高趨勢。CBT-diols在高溫下降解原因也可能與雙鍵的位（烯丙位）在高溫下易發(fā)生自由基反應有關(guān)。在CBT-diols農(nóng)藥制劑研制中，需加入抗氧化劑以提高其熱貯穩(wěn)定性。

CBT-diols1在pH45范圍內(nèi)降解率較高，在pH6～11范圍內(nèi)降解率顯著降低，可能是由于在酸性條件下，醇羥基容易與以氫鍵結(jié)合形成氧鹽，氧鹽脫水生成碳正離子，碳正離子遵循扎依切夫原則，發(fā)生消去反應形成更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，下ー步還需通過試驗驗證上述現(xiàn)象。根據(jù)CBT-diols在不同pH范圍的降解特性，CBT-diols應避免與酸性農(nóng)藥混用。本硏究表明，CBT-diols在陽光、高溫條件下抑菌活性降低幅度均顯著低于降解率升高幅度;CBT-diols在pH45范圍內(nèi)，降解率顯著較高，但其抑菌活性卻與pH6～11范圍無顯著差異，這可能與CBT-diols的降解物仍具有較高的抑菌活性有關(guān)。劉亞南等研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63活性代謝產(chǎn)物roflamycoin對太陽光和日光燈光源敏感，而紫外光并不能引起其光分解。Roflamycoin光照分解后對12種病原菌仍有抑

制作用，其中對番茄灰霉病菌、玉米穗腐病菌等6種病原菌的抑制活性顯著增強，推測roflamycoin的光分解產(chǎn)物仍具有抑菌活性。以上研究結(jié)果與本研究相似。

本研究表明，β-CBT-dois穩(wěn)定性相對優(yōu)于-CBT-dolls。因此，在以CBT-dolls提取物作為殺菌劑的實際應用中，為提高煙草CBT-dolls提取物的穩(wěn)定性，可以篩選β-CBT-dolls含量較高的煙草材料，或通過生物技術(shù)手段提高β-Cb-doils含量。

4結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，光照、溫度、pH、溶劑均對CBT-dolls降解率產(chǎn)生顯著影響，降解率隨暴露時間延長而升高，抑菌活性隨暴露時延長而降低，但菌活性降低幅度顯著低于降解率升高幅度。CBT-diols在紫外光下較在其他光下更易降解，不同日光照射強度對CBT-diols降解率的影響差異不顯著。80℃條件下CBT-diols易降解，CBT-diols在pH79范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性和抑菌活性，CBT-diols在乙醇溶液中最為穩(wěn)定。不同暴露條件下，β-CBT-dolls穩(wěn)定性較-Cb-doils高。下一步將對CBT-diols在不同暴露條件下的降解產(chǎn)物進行深入研究，以揭示CBT-diols降解機制。

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