香料煙灰霉病和菌核病病原鑒定及室內(nèi)藥劑篩選

盧燦華 藺忠龍 甄安忠 馬俊紅 王嵐鋒 羅宇卿 蓋曉彤 秦西云 夏振遠(yuǎn)

摘要：為明確保山地區(qū)香料煙新發(fā)生的“黑稈病”和“白稈病”病原及候選化學(xué)防治藥劑，本研究依據(jù)柯赫氏法則，分離驗(yàn)證病原物致病性，以形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合鑒定病原物種類，同時(shí)運(yùn)用平板法檢測(cè)11種殺菌劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果。結(jié)果表明，“黑稈病”，病原為灰葡萄孢菌（Botr-ytis cinerea Pers.r.），命名為香料煙灰霉病，病原菌對(duì)509%6多菌靈、70%甲基硫菌靈高度敏感，對(duì)55%菌核凈錳鋅中度敏感，ECs分別為0.03、0.80和6.50mgL：“白稈病”，病原為核盤(pán)菌（Sclerotinias clerotiorm（Lib）de Bary，命名為香料煙菌核病，該病原菌對(duì)50%6多菌靈、45%王銅-菌核凈、709%甲基硫菌靈和55%菌核凈-錳鋅高度敏感，ECs分別為0.60、1.05、113和1.90mgL。本研究明確了保山地區(qū)香料煙2種未知病害的病原物，并獲得了敏感性較高的殺菌劑。

關(guān)鍵詞：香料煙;真菌病害;灰霉病菌核病病害鑒定

香料煙（Aromatic tobacco）是生產(chǎn)混合型卷煙的重要原料。目前有20多個(gè)國(guó)家和地區(qū)生產(chǎn)香料煙，其中希臘、土耳其和中國(guó)是優(yōu)質(zhì)香料煙主產(chǎn)國(guó)。我國(guó)主要香料煙產(chǎn)區(qū)有云南保山、新疆、湖北十堰和浙江新昌，常年總產(chǎn)量在100～250t，其中云南保山香料煙總產(chǎn)量占全國(guó)年產(chǎn)量的909%以上2列保山香料煙通常在9月中旬開(kāi)始播種育苗，11月上移栽，移栽50d后開(kāi)始采收，翌年4月采收結(jié)束。采收時(shí)按下部葉、中部葉、上部葉自下而上依次分層采摘，每次5～6片葉頂部葉片成熟后一次性砍采。有部分煙農(nóng)也將砍采后的新生枝作為二茬煙采摘。作為無(wú)機(jī)鹽、水分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和煙堿的運(yùn)輸器官，莖稈的健康與否與中上部煙葉的產(chǎn)量與質(zhì)量息息相關(guān)。

2018年筆者在保山調(diào)查發(fā)現(xiàn)部分田塊出現(xiàn)為害率達(dá)409%以上的未知莖部病害，發(fā)病后期病株直立干枯，莖稈變黑或白化，局部著生黑色或白色霉層，當(dāng)?shù)胤Q之為“黑稈病”或“白稈病”。目前國(guó)內(nèi)香料煙上暫無(wú)該類病害的報(bào)道。本研究從病害癥狀、病原學(xué)和室內(nèi)藥劑生測(cè)等方面開(kāi)展研究，確定病原菌及候選化防藥劑，以期為病害防治提供參考。

1材料與方法

1.1田間調(diào)查與病樣采集

2018年3月和2019年3月于云南省保山市昌寧縣勐統(tǒng)鎮(zhèn)、卡斯鎮(zhèn)香料煙煙田內(nèi)對(duì)“黑稈病”和白稈病”的癥狀和發(fā)病率進(jìn)行調(diào)查分析，并采集病株莖、葉和花（圖1）。

1.2病原分離與鑒定

1.2.1分離純化病原菌分離與純化采用組織分離法。用無(wú)菌刀片切取0.5cmx0.5cm的病健交界處組織35塊;75%酒精表面消毒5s，5%次氯酸鈉溶液消毒90s，無(wú)菌水漂洗3次;用無(wú)菌濾紙吸干組織塊，置于PDA培養(yǎng)基表面，25℃恒溫培養(yǎng)2～3d挑取菌落邊菌絲轉(zhuǎn)接2次，定期觀察記錄菌落形態(tài)，顯微觀察測(cè)量菌絲與孢子的形態(tài)、大小。

1.2.2致病性測(cè)定病原菌致病性測(cè)定采用菌絲塊貼接保濕法。在25℃、光暗交替（12h：12h）恒溫溫室接種病原菌。用牙簽在煙株莖部造傷，打孔器（8mm）打取培養(yǎng)5～7d的菌餅，貼接于傷口處，用無(wú)菌水潤(rùn)濕的棉花保濕對(duì)照煙株接種無(wú)菌PDA培養(yǎng)基。記錄發(fā)病情況，顯癥后再次分離病原物，并與原分離物進(jìn)行顯微比對(duì)。

1.23rDNA-HTS序列測(cè)定病原菌基因組DNA采用FungalDNAKit（Omega，No.D3390-02）試劑盒提取。用真菌核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，S）通用引物ITS（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）FAITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）擴(kuò)増病原菌rDNA-ITS序列交由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序。用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLASTN分析IIS序列相似性。采用MEGA7.0軟件程序包中Neighbor-Joining法（bootstrap500）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3室內(nèi)毒力測(cè)定

1.3.1供試藥劑45%王銅-菌核浄可濕性粉劑（江西禾益化工股份有限公司）、50%烯酰嗎啉可濕性粉劑（山西奇星農(nóng)藥有限公司）、58%甲霜靈-錳鋅可濕性粉劑（西安鼎盛生物化工有限公司）、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑（濟(jì)源艾格弗作物保護(hù)有限公司）、15%三唑酮可濕性粉劑（江蘇省鹽城利民農(nóng)化有限公司）、55%菌核-錳鋅可濕性粉劑（浙江斯佩斯植保有限公司）、4%春雷霉素可濕性粉劑（吉林省延邊春雷生物藥業(yè)有限公司）、50%福美雙-異菌脲可濕性粉劑（江蘇快達(dá)農(nóng)化股份有限公司）、50%多菌靈可濕性粉劑（江蘇省江陰市農(nóng)藥二廠有限公司）、20%嗯霉-稻瘟靈液劑（河北三農(nóng)農(nóng)用化工有限公司）和12.5%腈菌唑可濕性乳劑（安陽(yáng)全豐生物科技有限公司）。

1.3.2帶藥培養(yǎng)基制備將殺菌劑用丙酮或無(wú)菌水配成有效濃度為1%的母液，置4℃冰箱備用。測(cè)定時(shí)，用移液器吸取一定量的母液，加入熔化并冷卻至55～60℃的培養(yǎng)基，充分搖勻后制板。

1.3.3室內(nèi)生測(cè)方法采用菌絲生長(zhǎng)速率法。在預(yù)培養(yǎng)56d的供試菌種菌落邊緣的同一圓周上，用打孔器打取直徑為8mm的菌餅，貼接于帶藥PDA培養(yǎng)皿中央，以不加藥劑處理為對(duì)照，每處理重復(fù)3次，置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)5d。測(cè)量各處理的菌落直徑，計(jì)算藥劑對(duì)菌落生長(zhǎng)的抑制率。將藥劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)值x，菌絲生長(zhǎng)抑制率轉(zhuǎn)換為幾率值y建立不同藥劑對(duì)病原菌的毒力回歸方程，計(jì)算各藥劑對(duì)病原菌的抑制中濃度（Co）

菌絲生長(zhǎng)抑制率/%=

2結(jié)果

2.1病害調(diào)查

黑稈病”該病可見(jiàn)于根莖交界處、莖稈中部、葉及花等部位，以莖稈發(fā)病為主。根莖交界處患病時(shí)，首先形成水浸狀橢圓形至卵圓形的凹陷病斑，邊緣紅褐色，輪紋明顯，長(zhǎng)約4.5～16.0cm，后期病斑表面形成灰色霉層（圖2A）。莖中部的病斑多見(jiàn)于采收形成的傷口處，中間白色，邊緣紅褐色，長(zhǎng)約05～3.9cm（圖2B和C）;發(fā)病嚴(yán)重時(shí)整株莖變黑。病原菌侵染花器時(shí)，花冠變黑腐爛，表面附著大量灰色霉層帶有病原菌的花落于葉片可導(dǎo)致葉斑（圖2D）。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在下部葉片采收期，該病在保山市昌寧縣勐統(tǒng)鎮(zhèn)和卡斯鎮(zhèn)的田間發(fā)病率為3%～10%。

2.1.2“白稈病”該病多見(jiàn)于根莖交界處，在莖中部、頂端或葉部時(shí)有發(fā)生（圖3）。病原菌由采收形成的口侵入，初期形成水漬狀病斑，中間白色，邊緣青綠色，病斑表面偶有白色菌絲體附著（圖3A和B）。"“白稈病”的病斑長(zhǎng)約1.5～30.0cm，比前述“黑稈病”病斑長(zhǎng)。后期嚴(yán)重時(shí)可整株干枯，搖動(dòng)莖有響聲，剝開(kāi)后可見(jiàn)黑色橢圓形顆粒物，為5.0～170mmx3～7mm（平均9.1mmx4.5mm，n=50）（圖3C、D、E和F）。調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病在勐統(tǒng)鎮(zhèn)和卡斯鎮(zhèn)的煙田中零星發(fā)生，個(gè)別田塊發(fā)病率可達(dá)40%以上。

2.2病原分離及致病性測(cè)定

黑稈病”組織分離法獲得多株菌落形態(tài)相似的分離物，取代表性菌株HM-1進(jìn)行回接和后續(xù)試驗(yàn)。病原菌培養(yǎng)5～6d后接種于“云香巴斯瑪1號(hào)”煙株莖部。接種幼苗時(shí)，1d煙株開(kāi)始萎蔫，5d全部枯死，枯死的組織帶有大量灰色霉層接種成株期煙株，3d植株出現(xiàn)明顯萎蔫癥狀，1d病斑處著生大量灰色霉層，煙株枯萎（圖4A）。從發(fā)病部位經(jīng)組織分離再次分離獲得菌落形態(tài)相同的菌株。故確定菌株HM-1為引起香料煙“黑稈病”的病原菌。

2.2.2“白稈病”經(jīng)病原分離獲得多株菌落形態(tài)

相似的分離物，取代表性菌株HP-1用于試驗(yàn)。將病原菌接種于煙苗莖部，接種后2d開(kāi)始萎蔫，5～6d煙苗枯死，煙株莖干枯，常伴有白色菌絲體;接種成株期煙株，5植株開(kāi)始萎蔫，10d上部葉片枯萎，病斑呈白色（圖4B）。從發(fā)病部位再次分離獲得的菌株菌落形態(tài)與初始分離病原菌相同。因此確定菌株HP-1為香料煙“白稈病”的病原菌。

2.3病原菌鑒定

2.3.1“黑稈病”菌病原菌HM-1在PDA培養(yǎng)

基上生長(zhǎng)良好，菌落呈擴(kuò)展型，表面凹凸不平，初期為白色，后期為灰色。氣生菌絲發(fā)達(dá)，呈放射狀生長(zhǎng);分生孢子梗簇生，細(xì)長(zhǎng)型，頂端分枝，未端膨大呈近球形，其上生小梗，著生大量無(wú)色單孢孢子，外觀呈葡萄穗狀;經(jīng)PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)10d，在菌絲體下可形成大量黑色菌核，圓形至長(zhǎng)圓形直徑2.1～4.6mm（圖5A）。初步的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果顯示HM-1與葡萄孢屬（Botrytis，）真菌形態(tài)相似rDNA-ITS序列同源性分析表明HM-1（MK659869與灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的序列一致性為100%?；贗TS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明HM-1與灰葡萄孢菌聚為一支（圖6）。綜合形態(tài)學(xué)特征及IS序列分析結(jié)果，可確定菌株IHM-1為灰葡萄孢菌（B.cinerea）。因香料煙“黑稈病”患病莖稈附著大量灰色霉層，加之灰葡萄孢菌常侵染作物引起灰霉病，故將香料煙“黑稈病”命名為香料煙灰霉病。

2.3.2“白稈病”菌菌株HP-1在PDA培養(yǎng)基上

生長(zhǎng)良好，菌落為擴(kuò)展型，表面光滑、平整，初期為白色，后期為灰白色。氣生菌絲不發(fā)達(dá)，呈放射狀生長(zhǎng)，菌絲無(wú)色、透明、有隔膜。病原菌培養(yǎng)7～10d，菌落邊形成不定形菌核，菌核表生，初期白色，后期黑色，表面粗糙，大小為2.4～5.0mmx1.43.8mm（平均3.4mmx2.6mm，n=50）將培養(yǎng)物和患病組織表面的菌絲體用透明膠帶粘取后顯微觀察，發(fā)現(xiàn)組織較厚，邊緣偶有菌絲著生（圖5B）。形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果表明HP-1與核盤(pán)菌屬（Sclerotinia）的真菌形態(tài)類似。DNA-TS序列同源性分析表明病菌IHP-1（MK656936）與核盤(pán)菌（S.sclerotiorum）的序列一致性為1009%?；贗TS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示HP-1與核盤(pán)菌聚為支（圖6）。綜上所述，菌株HP-1為核盤(pán)菌（S sclerotiorum）。因香料煙“白稈病”患病莖稈內(nèi)部常有大量黑色菌核形成，故將該病命名為香料煙菌核病。

2.4藥劑室內(nèi)生測(cè)

2.4.1香料煙灰葡萄孢菌由表1看出，多菌靈、甲基硫菌靈、菌核浄-錳鋅對(duì)灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用最為明顯，其抑制中濃度（ECs）分別為0.03、0.80和6.50mgL，說(shuō)明香料煙灰葡萄孢菌對(duì)多菌靈、甲基硫菌靈高度敏感，對(duì)菌核凈錳鋅中度敏感，對(duì)其余殺菌劑不敏感（ECs0大于20mgL）。

2.4.2香料煙核盤(pán)菌多菌靈、王銅-菌核浄、甲基硫菌靈、菌核凈-錳鋅等4種殺菌劑的ECs0分別為0.60、105、1.13和1.90mgL，說(shuō)明香料煙核盤(pán)菌對(duì)這4種殺菌劑高度敏感，對(duì)其余7種殺菌劑不敏感表1）。

3討論

本研究對(duì)云南保山香料煙“黑稈病”和“白稈病”病株進(jìn)行了組織分離純化，并依據(jù)柯赫氏法則對(duì)分離獲得的病原物進(jìn)行致病性檢，確定了病原真菌HM-1和HP-1在香料煙上的致病力。根據(jù)灰霉病和菌核病病原菌的形態(tài)特征1，結(jié)合本研究獲得的分離物HM-1和HP-1的形態(tài)特征、rDNA-ITS序列及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，明確了引起香料煙“黑稈病”和“白稈病”的病原菌分別為核盤(pán)菌科內(nèi)的葡萄孢屬灰葡萄孢菌（B.cinerea）和核盤(pán)菌屬核盤(pán)菌（S.sclerotiorum）。目前我國(guó)香料煙已報(bào)道的病害主要有細(xì)菌性斑點(diǎn)病、青枯病、黑脛病、叢頂病、曲葉病、普通花葉病、馬鈴薯病毒病等1，本研究屬國(guó)內(nèi)香料煙灰霉病和菌核病的首次報(bào)道?；移咸焰呔˙.catered）是第二大病原真菌，其危害僅次于稻瘟病菌1。該病菌寄主廣泛，可為害1400多種植物，如番茄、黃瓜、草莓、葡萄、煙草等經(jīng)濟(jì)作物?；移咸焰呔鷮偎荔w營(yíng)養(yǎng)型腐生真菌，從苗期至成株期均可侵染植物，易于侵染雙子葉植物成熟和衰老的組織182?；颐共≡诳緹熀拖懔蠠煹陌l(fā)病部位、發(fā)病程度均不相同?？緹熁颐共∫延袌?bào)道，主要為害成熟期中下部葉片，采收后期偶有莖稈發(fā)病2。而香料煙灰霉病主要為害香料煙莖稈，葉部發(fā)病較少。香料煙每次采摘56片葉，可形成較多傷口，易被空氣中的灰葡萄孢菌附著和侵染，室內(nèi)接種試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)摘除葉片造傷比針刺造傷更易于發(fā)病。加之24月份保山地區(qū)冷涼、蒸發(fā)小、濕度較大，也可加重該地區(qū)香料煙灰霉病的發(fā)生。

核盤(pán)菌（Ssclerotiorum）屬死體營(yíng)養(yǎng)型土傳病原菌，可為害600多種植物引起菌核病，其中包括油菜、大豆、花生、向日葵、生菜及番茄等2農(nóng)作物。冷涼潮濕的環(huán)境條件利于菌核病發(fā)生2病原菌主要以菌核在田間病殘?bào)w越冬，成為翌年的初侵染源2。菌核在土壤、病殘?bào)w中存活時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)10年，所以不能通過(guò)輪作控制菌核病232?？緹熅瞬≡谖覈?guó)北方煙區(qū)已有報(bào)道，而在云南省烤煙上鮮有發(fā)生。保山昌寧地區(qū)每年24月氣溫冷涼、空氣濕度大，利于香料煙菌核病的發(fā)生。目前，該病在保山香料煙種植田中發(fā)生不均。多數(shù)田塊不發(fā)生，部分田塊發(fā)病率在40%以上，發(fā)病較重的田塊均為往年重病田。這可能與當(dāng)?shù)亓?xí)慣秸稈還田有關(guān)。煙農(nóng)將帶有大量菌核的莖稈還田，大大增加了翌年的初侵染菌源量，也為該病的大發(fā)生埋下隱患。目前，作物灰霉病的防治主要采用化學(xué)藥劑。氟啶胺、多菌靈、咪鮮胺等高效低毒的廣譜殺菌劑是灰霉病防治的主要藥劑252。汪漢成等2研究表氟啶胺和咪鮮胺對(duì)煙草灰霉病菌絲生長(zhǎng)活性抑制最強(qiáng)，該藥劑對(duì)煙草灰霉病的保護(hù)和治療作用也較強(qiáng)。周浩等2研究表明多菌靈對(duì)煙草灰霉病菌絲生長(zhǎng)的抑制活性最強(qiáng)，其次為丙環(huán)唑、嘧霉胺和異菌脲，而異菌脲和丙環(huán)唑?qū)煵莼颐共【咦影l(fā)的制活性最強(qiáng)，離體試驗(yàn)也表明異菌脲和多菌靈對(duì)灰霉病的防治效果最好。降巧龍等28研究也表明多菌靈、菌核浄對(duì)魔芋灰霉病菌具有較強(qiáng)的毒力。本研究表明，多菌靈、菌核-錳鋅對(duì)香料煙灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性較強(qiáng)，結(jié)果與上述文獻(xiàn)結(jié)果較為一致;本研究還發(fā)現(xiàn)甲基硫菌靈對(duì)香料煙灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的扣制活性較強(qiáng)，該結(jié)果與葡萄灰霉病、黃瓜灰霉病菌對(duì)甲基硫菌靈不敏感的結(jié)果有差異23，原因可能是不同作物灰霉病菌對(duì)甲基硫菌靈的耐藥性有差異，此外本研究?jī)H測(cè)試了一株病原菌對(duì)甲基硫菌靈的敏感性，不同地理來(lái)源的香料煙灰霉病菌對(duì)甲基硫菌靈的敏感性是否存在差異需進(jìn)一步研究。

菌核浄、多菌靈是菌核病防治的主要化學(xué)藥劑。秦虎強(qiáng)等研究表明多菌靈、菌核及甲基托布津均可抑制油菜菌核萌發(fā)及殺滅子囊盤(pán)。何道根等2研究表明菌核浄對(duì)西蘭花菌核病的防治效果最好，甲基硫菌靈的防治效果則一般。高崇等評(píng)價(jià)了11種殺菌劑對(duì)煙草菌核病的室內(nèi)毒力，發(fā)現(xiàn)嘧霉胺、多-春-氟菌酰胺、腈菌唑、嘧菌酯、春雷-多菌靈對(duì)煙草菌核病菌毒力較強(qiáng)，田間防效試驗(yàn)也證明腈菌唑、春雷-多菌靈的防效達(dá)70%以上。本研究表明，香料煙菌核病菌對(duì)多菌靈、甲基硫菌靈、菌核凈錳鋅及王銅-菌核浄均敏感，結(jié)果與上述文獻(xiàn)較為致。綜上所述，多菌靈、甲基硫菌靈、菌核浄-錳鋅3種殺菌劑對(duì)香料煙灰霉病和菌核病病菌的抑菌活性均較強(qiáng)。因?yàn)橄懔蠠煛昂诙挷　迸c“白稈病”在田間常混合發(fā)生，病害防治時(shí)可采用上述3種藥劑單施或混合施用。3種藥劑在田間條件下的防治效果仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究雖從11種化學(xué)藥劑中篩選獲得3種候選藥劑，但長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑對(duì)環(huán)境產(chǎn)生副作用、病原菌將產(chǎn)生抗藥性。因此，有必要開(kāi)發(fā)新的更低毒、低殘留的替代性生物源殺菌劑。近年來(lái)，以菌防病、以菌治病的生物防治方法在農(nóng)作物病害防治方面的應(yīng)用逐漸多。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）、寡雄腐霉（Pythium oligandrun）、深綠木霉（Trichoderma atroviride）、金龜子綠僵菌（Metarhizium Anisopliae）、核盤(pán)菌病毒、小盾霉（Coniothyrium minitans）等生防資源在作物灰霉病和菌核病的防控中有較好應(yīng)用前景3。但是生物防治技術(shù)在煙草灰霉病、菌核病防治中的應(yīng)用較少有必要深入挖掘生防資源，評(píng)價(jià)其應(yīng)用潛力。

4結(jié)論

經(jīng)病原菌致病性測(cè)定，形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)方法鑒定，將香料煙“黑稈病”病原菌鑒定為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers：Fr），病害命名為香料煙灰霉病;將“白稈病”病原菌鑒定為核盤(pán)菌Sclerotinia sclerotiorum（Iib，）de Bary，病害命名為香料煙菌核病。室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，灰葡萄孢菌對(duì)多菌靈、甲基硫菌靈、菌核凈-錳鋅敏感核盤(pán)菌對(duì)多菌靈、王銅-菌核浄、甲基硫菌靈、菌核錳鋅敏感。

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