鹽穗木病程相關(guān)蛋白HcPR10抗血清的制備及鑒定

張花 楊濤 衡友強(qiáng) 王艷

摘?要：病程相關(guān)蛋白（PRs）在植物抗病抗逆過程中發(fā)揮重要作用。鹽穗木病程相關(guān)蛋白基因HcPR10（GenBank：KF673356）來自鹽穗木（Halostachys capsica）在600 mmol·L-1 NaCl脅迫下的鹽抑制差減文庫。為探究鹽穗木病程相關(guān)蛋白HcPR10發(fā)揮生物學(xué)功能的機(jī)制，該研究通過體外表達(dá)和純化HcPR10重組蛋白制備特異性的HcPR10多克隆抗體。并采用雙酶切構(gòu)建原核重組表達(dá)載體pET28a-HcPR10，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（Escherichia coli）BL21誘導(dǎo)表達(dá)，通過正交分析優(yōu)化重組蛋白可溶性誘導(dǎo)表達(dá)的條件，利用Ni-NTA親和層析柱純化融合蛋白，免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體，基于純化獲得的His-HcPR10重組蛋白和轉(zhuǎn)HcPR10擬南芥總蛋白，分別利用ELISA和Western Blotting檢測(cè)抗血清效價(jià)和特異性。結(jié)果表明：成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-HcPR10;正交結(jié)果顯示誘導(dǎo)溫度27 ℃，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速200 r·min-1，IPTG濃度0.7 mmol·L-1，誘導(dǎo)時(shí)間6 h條件下可誘導(dǎo)表達(dá)大量可溶性目的蛋白;ELISA檢測(cè)抗HcPR10血清效價(jià)達(dá)1∶243 000，Western Blotting印跡結(jié)果顯示制備的抗血清可以與重組蛋白和轉(zhuǎn)基因擬南芥（Arabidopsis thaliana）中異源表達(dá)的HcPR10蛋白特異性結(jié)合。該研究獲得了效價(jià)高、特異性強(qiáng)的鹽穗木病程相關(guān)蛋白HcPR10抗血清，為進(jìn)一步研究HcPR10的亞細(xì)胞定位及生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鹽穗木病程相關(guān)蛋白HcPR10， 原核表達(dá)， 蛋白純化， 抗體制備及鑒定

中圖分類號(hào)：Q946.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2020）12-1732-08

Abstract：Pathogenesis-related proteins （PRs） play important roles in plants in response to pathogen attack and diverse environmental stresses. HcPR10 （GenBank：KF673356） was isolated from the Suppression Subtractive Hybridization cDNA libraries of Halostachys caspica under the stress of 600 mmol·L-1 NaCl. In order to investigate the biological function of HcPR10， the specific polyclonal antibody of HcPR10 was prepared by expression and purification of recombinant HcPR10 protein in vitro. In this study， recombinant prokaryotic expression vector pET28a-HcPR10 was constructed by double digestion and then was transformed into Escherichia coli strain BL21 to induce HcPR10 expression. We explored the optimal expression condition for soluble recombinant protein in BL21 by orthogonal analysis. Fusion proteins which were purified by the Ni-NTA affinity chromatography column were injected to BALB/c mice for preparing the HcPR10 polyclonal antibody. The titer and specificity of HcPR10 antiserum were detected respectively by ELISA and Western Blotting using recombinant protein His-HcPR10 and total protein of transgenic HcPR10 Arabidopsis thaliana. The results were as follows：The recombinant expression vector pET28a-HcPR10 was successfully constructed; The maximum amount of soluble fusion protein was obtained under the 27 ℃， 200 r·min-1 and 0.7 mmol·L-1 IPTG for induction 6 h; The antiserum for HcPR10 possessing 1∶243 000 titer could bind specifically to recombinant protein His-HcPR10 and the heterologous protein from transgenic HcPR10 Arabidopsis thaliana. The high titer and specific antiserum for HcPR10 has been prepared successfully， the results of this study provide the foundation for further investigating the subcellular localization and biological function of HcPR10.

Key words：pathogenesis-related protein 10 from Halostachys caspica （HcPR10）， prokaryotic expression， protein purification， antibody preparation and identification

病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related proteins，PRs）是植物受到生物或非生物脅迫時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)的一類特異性蛋白，在植物疾病防御、響應(yīng)生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用（溫韻潔等，2008）。病程相關(guān)蛋白廣泛存在于單子葉和雙子葉植物中，根據(jù)它們的電泳遷移率、植物起源、血清學(xué)關(guān)系和氨基酸序列同源性，病程相關(guān)蛋白被分為17個(gè)家族，其中PR10因包含100多個(gè)成員而備受關(guān)注（Van et al.， 2006;Sels et al.， 2008）。

PR10首次在體外培養(yǎng)的歐芹（Petroselinum crispum）細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)（Somssich et al.， 1988），之后又相繼鑒定了水稻（Oryza sativa）、甘蔗（Saccharum officinarum）、三七（Panax notoginseng）和鷹嘴豆（Cicer arietinum）的病程相關(guān)蛋白10（Wu et al.， 2016;Peng et al.， 2017;Tang et al.， 2019;Chatterjee et al.， 2019），其蛋白分子量在15～19 kDa之間，等電點(diǎn)偏酸性、無信號(hào)肽序列、屬胞內(nèi)蛋白（Radauer et al.， 2008），是一類結(jié)構(gòu)保守并發(fā)揮多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)（楊濤和王艷，2017）。過表達(dá)不同來源的PR10基因能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)多種病原體的抗性（Zandvakili et al.， 2017;Tang et al.， 2019），目前普遍認(rèn)為RNase活性是PR10發(fā)揮生物脅迫抗性的關(guān)鍵（Peng et al.， 2017;Finkina et al.， 2017）。體外研究顯示具有RNase活性的煙草（Nicotiana tabacum）NtPR10對(duì)煙草赤星病菌（Alternaria alternata）具有抑菌活性（張玉等，2018）;過表達(dá)茉莉酸誘導(dǎo)的病程相關(guān)蛋白10（JIOsPR10）增強(qiáng)了水稻對(duì)稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的耐受性（Wu et al.， 2016）;玉米（Zea mays）ZmPR10也顯示出廣譜的抗真菌活性（Zandvakili et al.， 2017）。近年來，一些研究發(fā)現(xiàn)PR10基因也受鹽、干旱、寒冷等非生物因子的誘導(dǎo)，在植物非生物脅迫防御中同樣發(fā)揮重要作用。旱柳（Salix matsudana）SmPR10的過表達(dá)增加了擬南芥的鹽脅迫抗性，水稻RSOsPR10的過表達(dá)增強(qiáng)了水稻對(duì)干旱脅迫及剪股穎（Agrostis stolonifera）對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性（Takeuchi et al.， 2016;Han et al.， 2017;汪志星等，2018）。除具有抗病和抗逆功能外，近年研究發(fā)現(xiàn)來自麝香百合（Lilium longiflorum）的LlPR10、水稻JIOsPR10和水稻OsPR10A的過表達(dá)調(diào)節(jié)了植株的生長(zhǎng)發(fā)育（Hsu et al.， 2014;Wu et al.， 2016;張彤等，2019）。雖然植物病程相關(guān)蛋白家族PR10已被廣泛研究，但其發(fā)揮作用的機(jī)制仍不清楚。

蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮與其在細(xì)胞中的位置密切相關(guān)（Scott et al.， 2005;He et al.， 2013），亞細(xì)胞定位是蛋白質(zhì)功能研究的關(guān)鍵特征之一。目前，大部分PR10蛋白亞細(xì)胞定位的研究方法主要采用融合報(bào)告基因進(jìn)行顯微觀察，例如，通過構(gòu)建融合GFP表達(dá)載體，顯示辣椒（Capsicum annuum）PR10-LRR1復(fù)合物的細(xì)胞質(zhì)定位是引發(fā)辣椒葉片細(xì)胞死亡的前提（Choi et al.， 2012）;鷹嘴豆CaABR18蛋白則是一個(gè)具有雙重作用模式的細(xì)胞核定位蛋白，其可通過增加真菌膜的通透性和核崩解從而發(fā)揮抗真菌活性（Chatterjee et al.， 2019）。此外，采用免疫膠體金技術(shù)顯示華東葡萄（Vitis pseudoreticulata）VpPR10.2蛋白分布在葉綠體和細(xì)胞壁，從而發(fā)揮其酶活性并抵抗病原體的早期入侵（He et al.， 2013）。以上結(jié)果表明不同PR10蛋白定位于不同細(xì)胞器，進(jìn)而通過不同的機(jī)制發(fā)揮生物學(xué)功能。

鹽穗木是新疆鹽堿環(huán)境分布最廣泛的建群種和優(yōu)勢(shì)種，是鹽生植物的先鋒代表，有著極強(qiáng)的生命力（郗金標(biāo)等，2006;Zeng et al.， 2015）。HcPR10（GenBank：KF673356）是鹽穗木中的一個(gè)鹽響應(yīng)基因，前期研究發(fā)現(xiàn)該基因受到各種非生物脅迫誘導(dǎo)且可顯著提高轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽和耐旱性（文章未發(fā)表），但對(duì)其參與生物學(xué)功能的機(jī)制仍不清楚。PSORT（http：//psort.hgc.jp/form.html）在線預(yù)測(cè)顯示鹽穗木病程相關(guān)蛋白HcPR10可能定位表達(dá)在線粒體基質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)和過氧化物酶體等亞細(xì)胞水平的結(jié)構(gòu)中。因此，本研究通過構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-HcPR10，利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)并純化融合蛋白His-HcPR10，免疫小鼠，制備效價(jià)高、特異性強(qiáng)的鹽穗木病程相關(guān)蛋白HcPR10的多克隆抗體，為HcPR10的組織和細(xì)胞定位及生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料?擬南芥為Columbia-0（Col-0）生態(tài)型，本小組前期通過農(nóng)桿菌（Agrobacterium）介導(dǎo)的花序浸染法獲得了轉(zhuǎn)HcPR10擬南芥OE1和OE9兩個(gè)純系植株。大腸桿菌DH5α和BL21感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，DH5α-pET28a（+）和DH5α-pMD18-T-HcPR10為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.1.2 試劑?限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、Eco RⅠ、Taq酶及T4 DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司。蛋白和DNA Marker均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;BCA法和Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;SDS-PAGE電泳各項(xiàng)試劑均為北京賽馳生物科技有限公司產(chǎn)品;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;其他常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)載體pET28a-HcPR10的構(gòu)建?根據(jù)本實(shí)驗(yàn)前期克隆獲得的鹽穗木病程相關(guān)蛋白HcPR10基因序列（GenBank登錄號(hào)：KF673356），分別設(shè)計(jì)上游含Eco RⅠ、下游含Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物，上游引物HcPR10 EP1：5′-cggGAATTCATGGGTGTATTTACAT-3′;下游引物HcPR10 HP2：5′-tgtAAGCTTTCAAGCATAAAGCTG

AGG-3′（下劃線表示相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，小寫字母為保護(hù)堿基）。以pMD18-T-HcPR10質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。HcPR10 PCR產(chǎn)物和pET28a表達(dá)載體雙酶切后回收，T4連接酶16 ℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α菌株，獲得的重組質(zhì)粒pET28a-HcPR10經(jīng)雙酶切鑒定正確后送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.2 重組蛋白的原核表達(dá)、優(yōu)化及純化?將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET28a-HcPR10轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，按照張冀等（2018）的方法誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，將誘前、誘后、誘后上清和誘后沉淀于4 ℃，12 000 r·min-1，離心2 min，各取20 SymbolmA@

L點(diǎn)樣，用15% SDS-PAGE檢測(cè)。以可溶性融合蛋白占總蛋白含量的百分比為依據(jù)，對(duì)誘導(dǎo)的IPTG濃度（0.4、0.7、1.0 mmol·L-1）、溫度（27、31、37 ℃）、轉(zhuǎn)速（180、200、220 r·min-1）和時(shí)間（4、5、6 h）進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)（表1），設(shè)計(jì)正交分析表（表2），分析這4個(gè)因素對(duì)HcPR10重組蛋白可溶性的影響，優(yōu)化表達(dá)體系。對(duì)正交實(shí)驗(yàn)9組不同條件下誘導(dǎo)的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并通過ImageJ對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度掃描，確定HcPR10原核誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件。在最佳誘導(dǎo)條件下表達(dá)重組蛋白His-HcPR10，收集菌體，超聲破碎，8 000 r·min-1，離心10 min收集上清，上鎳柱純化蛋白，然后用200 mmol·L-1的咪唑洗脫，SDS-PAGE檢測(cè)洗脫蛋白，用索萊寶公司BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，分裝置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 抗血清的制備?以純化的His-HcPR10融合蛋白為抗原，采集免疫前BALB/c小鼠血清為陰性對(duì)照。取50 μg抗原與等體積弗氏完全佐劑乳化，采用腹腔注射法對(duì)小鼠進(jìn)行初次免疫，并分別在第10天、第29天、第33天用等體積弗氏不完全佐劑乳化的目的蛋白加強(qiáng)免疫，每只50 μg劑量。第4次免疫4 d后采用眼部取血法采血，將收集的血清37 ℃孵育2 h，4 ℃過夜，5 000 r·min-1，離心15 min分離血清，于-80 ℃保存。

1.2.4 多克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)?以純化的His-HcPR10融合蛋白為抗原每孔加1 μg包被ELISA板，4 ℃過夜，用TTBS洗滌3次，每次10 min，用200 μL 1% BSA封閉液37 ℃封閉1 h。先加入用1% BSA封閉液梯度稀釋的免疫前和免疫后血清（每孔100 μL），37 ℃孵育1 h，用TTBS洗滌3次，每次3 min，再加入1∶1 000的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IGg二抗，37 ℃孵育1 h，用TTBS洗滌4次，每次3 min，最后以TMB為底物進(jìn)行顯色，待呈現(xiàn)梯度藍(lán)色后每孔加入50 μL 2 mol·L-1的H2SO4終止反應(yīng)，檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下的吸光度。免疫前血清為對(duì)照，免疫前后A450值分別為N和P，以P/N>2.1為標(biāo)準(zhǔn)判斷血清有效效價(jià)。

1.2.5 Western Blotting檢測(cè)?以營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)4周齡的擬南芥為材料，按照Koteyeva et al.（2011）所述的方法提取植物總蛋白，用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量。分別取10 μg His-HcPR10重組蛋白和10 μg擬南芥植株總蛋白，經(jīng)15% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印至NC膜上，用含5%脫脂奶粉的PBST 4 ℃過夜封閉，用1∶1 500（v/v）一抗，37 ℃孵育2 h，PBST洗膜3次，每次10 min;加入1∶2 000（v/v）的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育2 h，PBST洗滌3次，每次10 min，洗滌后DAB顯色。

2?結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體pET28a-HcPR10的構(gòu)建及鑒定

提取構(gòu)建獲得的重組質(zhì)粒pET28a-HcPR10，采用Eco RⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳獲得了與預(yù)期486 bp大小相符的目的基因片段和載體片段（圖1），測(cè)序結(jié)果正確，表明原核表達(dá)載體pET28a-HcPR10構(gòu)建成功。

2.2 重組蛋白HcPR10的原核表達(dá)條件優(yōu)化及純化

2.2.1 重組蛋白HcPR10的原核表達(dá)?將重組質(zhì)粒pET28a-HcPR10轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，隨機(jī)挑取4個(gè)BL21-pET28a-HcPR10單克隆，在0.7 mmol·L-1 IPTG、37 ℃誘導(dǎo)溫度、220 r·min-1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速下進(jìn)行4 h初步誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，與誘導(dǎo)前相比，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后4個(gè)單克隆均在約25 kDa處誘導(dǎo)出一條增強(qiáng)的蛋白條帶（圖2：A），且單克隆間無表達(dá)量的差異，表明該蛋白在BL21大腸桿菌中成功表達(dá)。對(duì)誘導(dǎo)后的蛋白進(jìn)行超聲破碎，用15% SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后、誘導(dǎo)后上清、誘導(dǎo)后沉淀樣品，結(jié)果表明重組蛋白HcPR10以可溶性和包涵體兩種形式存在（圖2：B）。

2.2.2 重組蛋白HcPR10的原核表達(dá)優(yōu)化及純化?為獲得大量可溶性HcPR10重組蛋白，對(duì)正交實(shí)驗(yàn)9組不同條件下誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白超聲并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，使用ImageJ對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描，進(jìn)行含量計(jì)算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（圖3），根據(jù)數(shù)據(jù)顯示可知，9組正交實(shí)驗(yàn)中第8組的可溶性蛋白含量最低，第4組的可溶性蛋白含量最高，約為第8組的3.5倍，因此，BL21-pET28a-HcPR10菌種在IPTG濃度0.7 mmol·L-1、溫度27 ℃、轉(zhuǎn)速200 r·min-1下誘導(dǎo)6 h時(shí)表達(dá)的可溶性HcPR10重組蛋白量最大。在最優(yōu)條件下對(duì)含有pET28a-HcPR10重組質(zhì)粒的菌種進(jìn)行大量表達(dá)，收集大腸桿菌菌體，超聲破碎，離心取上清液，用組氨酸標(biāo)簽親和層析柱對(duì)上清液中的融合蛋白進(jìn)行純化，對(duì)誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后、誘導(dǎo)后上清、誘導(dǎo)后沉淀、純化的His-HcPR10蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示在最優(yōu)條件下誘導(dǎo)表達(dá)后，誘導(dǎo)的目的蛋白大部分以可溶性形式存在，并在純化后得到分子量大小約為25 kDa的目的重組蛋白HcPR10（圖4）。以BCA蛋白定量試劑盒測(cè)得純化蛋白濃度為500 μg·mL-1。

2.3 多克隆抗體的免疫效價(jià)及特異性分析

采用間接ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)。將抗血清用1%BSA封閉液按1∶1 000、1∶3 000、1∶9 000、1∶27 000、1∶81 000、1∶243 000稀釋后進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖5：A所示。由圖5可知，當(dāng)抗血清稀釋243 000倍時(shí)，小鼠抗血清的光吸收值與陰性對(duì)照相比大于2.1，即抗血清效價(jià)達(dá)1∶243 000，表明該抗血清滴度較高。以純化的His-HcPR10重組蛋白、野生型及兩個(gè)轉(zhuǎn)HcPR10基因擬南芥植株總蛋白為樣品進(jìn)行Western Blotting鑒定，結(jié)果顯示純化的重組蛋白在約25 kDa處出現(xiàn)了一條雜交條帶（圖5：B），兩個(gè)轉(zhuǎn)HcPR10基因擬南芥株系總蛋白在約18 kDa（圖5：C）處均出現(xiàn)了與預(yù)期分子量大小一致的特異性雜交條帶，而野生型擬南芥總蛋白沒有出現(xiàn)雜交條帶，說明制備的HcPR10抗血清不僅能與重組的His-HcPR10蛋白結(jié)合，而且也能夠特異地識(shí)別擬南芥中異源表達(dá)的HcPR10蛋白。效價(jià)高、特異性強(qiáng)的His-HcPR10融合蛋白抗血清制備成功。

3?討論與結(jié)論

高效的蛋白表達(dá)系統(tǒng)是研究蛋白結(jié)構(gòu)、定位及功能的基礎(chǔ)。本研究的核心目的是純化目的蛋白，制備效價(jià)高、特異性好的鹽穗木病程相關(guān)蛋白HcPR10的抗血清。大腸桿菌是最常用的原核表達(dá)系統(tǒng)，具有遺傳背景清楚、遺傳穩(wěn)定、表達(dá)量高、成本低廉、表達(dá)產(chǎn)物易純化及使用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)（Nuc & Nuc， 2006）。此外，本研究選擇pET28a作為表達(dá)載體，不僅由于其含有高表達(dá)目的蛋白的噬菌體T7啟動(dòng)子，且其N端和C端各有一個(gè)可編碼6個(gè)連續(xù)His的標(biāo)簽，方便后續(xù)融合蛋白的純化。本試驗(yàn)將構(gòu)建成功的鹽穗木重組表達(dá)載體pET28a-HcPR10導(dǎo)入大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)后的蛋白以可溶性和包涵體兩種形式存在，影響了蛋白的大量獲得及后續(xù)純化工作的開展。誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速是影響原核表達(dá)及蛋白可溶性的主要因素，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)可減少試驗(yàn)次數(shù)和縮短試驗(yàn)周期，并能明確各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響是否顯著以及各因素的交互作用，常被用于多因素多水平的最優(yōu)搭配探索（溫耀安等，2014）。本試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)對(duì)原核誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定在溫度27 ℃、IPTG 0.7 mmol·L-1、時(shí)間6 h、轉(zhuǎn)速200 r·min-1時(shí)，融合蛋白HcPR10在大腸桿菌內(nèi)的可溶性含量最高，從而增加了HcPR10重組蛋白的數(shù)量和純化效率，有助于蛋白純化及多克隆抗體的制備。趙樂等（2015）選擇pET32a作為表達(dá)載體，采用控制變量法對(duì)誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度及誘導(dǎo)起始宿主菌密度這4個(gè)因素對(duì)蛋白表達(dá)的影響研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)溫度30 ℃、IPTG濃度0.4 mmol·L-1、起始宿主菌密度A600為0.8、誘導(dǎo)時(shí)間8 h為蛋白可溶性表達(dá)的最佳條件。張玉等（2018）選擇pCold Ⅱ低溫表達(dá)載體對(duì)目的蛋白表達(dá)條件研究顯示，與37 ℃相比，15 ℃條件下融合蛋白表達(dá)量更大，可溶性更高。因此，推測(cè)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最佳培養(yǎng)條件與所選擇的表達(dá)載體和目的蛋白自身的性質(zhì)密切相關(guān)。

在最佳條件下誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，用Ni2+親和層析獲得純化的目的蛋白，免疫小鼠獲得HcPR10抗血清，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示制備的HcPR10抗血清效價(jià)達(dá)1∶243 000?？贵w對(duì)抗原蛋白的專一性是抗體應(yīng)用的關(guān)鍵，本研究提取了野生型和轉(zhuǎn)HcPR10基因擬南芥中的總蛋白，通過Western Blotting鑒定HcPR10抗血清的特異性，結(jié)果兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系OE1、OE9在18 kDa附近均出現(xiàn)一條特異條帶，而野生型擬南芥總蛋白沒有出現(xiàn)雜交條帶，因此，制備的HcPR10抗血清具有高特異性。以上結(jié)果為利用該抗血清進(jìn)一步研究HcPR10蛋白的組織和細(xì)胞定位及生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了鹽穗木病程相關(guān)蛋白HcPR10的原核表達(dá)載體pET28a-HcPR10。通過4因素3水平正交試驗(yàn)獲得了可溶性His-HcPR10重組蛋白表達(dá)的最優(yōu)誘導(dǎo)條件：溫度27 ℃、IPTG 0.7 mmol·L-1、時(shí)間6 h、轉(zhuǎn)速200 r·min-1，并純化獲得500 μg·mL-1的重組蛋白。制備的多克隆抗體效價(jià)達(dá)1∶243 000，Western Blotting檢測(cè)該血清能與轉(zhuǎn)基因植物中異源表達(dá)的HcPR10特異性結(jié)合，可用于HcPR10的亞細(xì)胞定位研究。

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（責(zé)任編輯?周翠鳴）