• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    化學(xué)—滲透壓法溫和破碎處理下大腸桿菌細(xì)胞胞內(nèi)蛋白質(zhì)的釋放率

    2017-11-22 09:09:47趙燁清石莉歐陽(yáng)臻聞崇煒
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年19期
    關(guān)鍵詞:可溶性化學(xué)

    趙燁清+石莉+歐陽(yáng)臻+聞崇煒

    摘要:恰當(dāng)?shù)募?xì)胞破碎工藝是獲取胞內(nèi)蛋白質(zhì)的必需環(huán)節(jié),然而現(xiàn)有細(xì)胞破碎技術(shù)仍有較多不足。為了研究合適的細(xì)胞破碎方法,擬通過(guò)化學(xué)法與滲透壓法的聯(lián)用,建立化學(xué)-滲透壓法溫和高效破碎大腸桿菌細(xì)胞的新工藝。結(jié)果表明:(1)單用化學(xué)法處理大腸桿菌細(xì)胞,最高僅能釋放37.3%的胞內(nèi)蛋白質(zhì),而化學(xué)-滲透壓法最高可以釋放842%的胞內(nèi)蛋白質(zhì);對(duì)滲透壓處理環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化后,胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率提高至93.1%及以上;(2)以優(yōu)化的化學(xué)-滲透壓法釋放重組原動(dòng)蛋白2β(PK2β)工程菌細(xì)胞的胞內(nèi)蛋白質(zhì),其中70.5%~80.2%重組PK2β呈可溶性,而超聲法處理的樣品中不含有可溶性重組PK2β,表明化學(xué)-滲透壓法不僅簡(jiǎn)便高效、成本低廉,而且有利于保留可溶性重組蛋白質(zhì),而超聲破碎法會(huì)導(dǎo)致可溶性蛋白發(fā)生變性沉淀而增加蛋白質(zhì)分離的難度。綜合分析可知,化學(xué)-滲透壓法在基因工程及生物工程中具有良好的應(yīng)用前景。

    關(guān)鍵詞:化學(xué)-滲透壓法;細(xì)胞破碎;溫和高效;胞內(nèi)蛋白質(zhì);可溶性

    中圖分類號(hào): Q939.97 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2017)19-0146-04

    收稿日期:2016-05-04

    基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):81573529);江蘇大學(xué)高級(jí)人才啟動(dòng)基金(編號(hào):1281370001);江蘇省2015年度普通高校研究生實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃(編號(hào):SJLX15_0512);江蘇大學(xué)第14批大學(xué)生科研立項(xiàng)項(xiàng)目(編號(hào):14A441)。

    作者簡(jiǎn)介:趙燁清(1992—),女,江蘇南通人,碩士研究生,主要從事食源性功能肽的研發(fā)工作。E-mail:18796020517@163.com。

    通信作者:聞崇煒,博士,副教授,主要從事食源性功能肽的研發(fā)工作。E-mail:wenchw@ujs.edu.cn。 大腸桿菌(Escherichia coli,簡(jiǎn)稱E. coli)是基因工程與生物工程中表達(dá)重組蛋白質(zhì)最常用的宿主菌。重組蛋白質(zhì)通常被表達(dá)在E.coli胞內(nèi),必須進(jìn)行細(xì)胞破碎后才能進(jìn)行相應(yīng)的分離純化[1]?,F(xiàn)有的細(xì)胞破碎方法分為機(jī)械法、化學(xué)法、物理法及生物酶法四大類,在實(shí)際應(yīng)用中這些方法仍有較多不足。例如,機(jī)械法破碎效率高,但是需要高速珠磨機(jī)、高壓勻漿機(jī)等貴重設(shè)備,同時(shí)由于發(fā)熱大,可能重組蛋白質(zhì)的生物活性[2-3];化學(xué)法簡(jiǎn)便,但所用有機(jī)溶劑及變性劑也可能影響重組蛋白質(zhì)的生物活性[4-5];物理法條件溫和,但破碎效率較低[6];生物酶法條件溫和、破碎效率較高,但碎菌成本較高[7]。因此可見(jiàn),開(kāi)發(fā)溫和且具有高破碎效率的簡(jiǎn)便工藝在基因工程及生物工程中有較高的應(yīng)用價(jià)值。

    形態(tài)結(jié)構(gòu)學(xué)研究表明,E. coli細(xì)胞壁是由脂多糖層、磷脂層與肽聚糖層組成的復(fù)合結(jié)構(gòu),具備較強(qiáng)的抗拉伸與抗剪切能力。滲透壓法利用滲透壓差破碎細(xì)胞,條件溫和,可以很好地保留蛋白質(zhì)的生物活性,但是作用力較弱,不足以完全破碎E. coli細(xì)胞壁,目前僅用于釋放出周質(zhì)空間的蛋白質(zhì)[8]。本試驗(yàn)擬研究將化學(xué)法與滲透壓法聯(lián)用(本研究均簡(jiǎn)稱為化學(xué)-滲透壓法),從而實(shí)現(xiàn)既高效徹底破壞E. coli細(xì)胞壁,又完全釋放胞內(nèi)蛋白質(zhì),同時(shí)能保留蛋白質(zhì)生物活性的可能性。本研究為該法處理E. coli BL21(DE3)、重組原動(dòng)蛋白2β(PK2β)工程菌的試驗(yàn)結(jié)果。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    E. coli BL21(DE3)為筆者所在研究室保存,重組質(zhì)粒pET-28-PK2β為筆者所在研究室構(gòu)建,按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化獲得相應(yīng)重組工程菌[9]。

    蛋白胨、酵母膏,購(gòu)自O(shè)xoid公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、考馬斯亮藍(lán)、卡那霉素、二硫蘇糖醇(DTT),購(gòu)自BBI公司(Bio Basic Inc.);溴酚藍(lán),購(gòu)自AMRESCO公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)(生物技術(shù)級(jí)),購(gòu)自Merck公司;丙烯酰胺(超級(jí)純)、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(超級(jí)純)、乙二胺四乙酸(EDTA,分析純),購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;Triton X-100(化學(xué)純),購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、過(guò)硫酸銨、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺、乙醇、冰醋酸等其他試劑均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;瓊脂粉(進(jìn)口分裝),購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司;蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)SpectraTM Multicolor Broad Range Protein Ladder,購(gòu)自MBI公司,含有10、15、25、35、40、50、70、100、140、260 ku的條帶。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 大腸桿菌培養(yǎng)和收集 E. coli BL21(DE3)采用一步法培養(yǎng):將E. coli BL21(DE3)甘油菌凍存液按1‰比例接種到新鮮LB培養(yǎng)基(含1%蛋白胨、0.5%酵母膏、1% NaCl)中,37 ℃、250 r/min過(guò)夜培養(yǎng)15 h。培養(yǎng)液于10 000 r/min離心5 min,棄上清,菌體保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    重組PK 2β的E. coli BL21(DE3)工程菌采用兩步法培養(yǎng):取3 μL重組工程菌凍存液接種到3 mL新鮮LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)中,37 ℃、250 r/min過(guò)夜培養(yǎng)15 h獲得種子。隨后將種子液按照1%比例接種到新鮮LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)中,37 ℃、250 r/min繼續(xù)培養(yǎng)至D600 nm達(dá)到0.6左右,加誘導(dǎo)劑后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)液于10 000 r/min離心5 min,棄上清,菌體保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 常規(guī)化學(xué)-滲透壓法 包括化學(xué)法預(yù)處理、滲透壓法2個(gè)環(huán)節(jié),具體操作如下:(1)稱取適量?jī)龃鍱. coli菌體,按每30 mg菌體分別加入1 mL EDTA碎菌液或2.5 mL Triton X-100 碎菌液,4 ℃混勻過(guò)夜,然后于10 000 r/min離心 5 min,收集菌體備用;(2)取上述化學(xué)法預(yù)處理所得菌體,按每30 mg菌體加1 mL高滲液的比例重懸,室溫放置20 min,8 000 r/min 離心10 min,再按每30 mg菌體加1 mL低滲液的比例重懸,室溫放置20 min,8 000 r/min離心10 min;(3)繼續(xù)按步驟(2)重復(fù)處理殘留菌體2~4次。分別收集所得上清與沉淀菌體,待分析。endprint

    化學(xué)預(yù)處理液含適量EDTA或Triton X-100,0.05 mol/L Tris·HCl(pH值8.0)及0.10 mol/L NaCl。低滲液含0.02 mol/L Tris·HCl(pH值 8.0)、0.002 5 mol/L EDTA(pH值8.0)。在低滲液中加20%蔗糖作為滲透壓穩(wěn)定劑,即得高滲液。

    1.2.3 改進(jìn)化學(xué)-滲透壓法 具體操作流程同“1.2.2”節(jié);化學(xué)預(yù)處理液成分同“1.2.2”節(jié);低滲液成分同“1.2.2”節(jié);高滲液中改用35%蔗糖或20%PEG 8000為滲透壓穩(wěn)定劑。

    1.2.4 超聲破碎法 按吳蕾等所述流程[10-11]并略作修改:取50 mg菌體重懸于預(yù)冷的低滲液中,冰浴中用超聲破碎儀(購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司)處理(功率300 W,每次超聲破碎25 s,暫停25 s,超聲20次)。取適量樣品于 13 000 r/min 離心10 min,分出上清與沉淀,待分析。

    1.2.5 蛋白質(zhì)電泳 按常規(guī)方法[12]進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析,其中濃縮膠濃度為5%,分離膠濃度為10%。電泳結(jié)束后凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色,脫色后的凝膠用成像系統(tǒng)拍照保存待分析。

    1.2.6 胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率計(jì)算 樣品中蛋白質(zhì)含量與電泳對(duì)應(yīng)條帶及染色后條帶深淺呈線性關(guān)系,因此可通過(guò)分析染色后條帶的灰度值計(jì)算蛋白質(zhì)含量[13]。SDS-PAGE凝膠圖像用Quantity OneTM v 4.5軟件(購(gòu)自Bio-Rad Laboratories Inc.)進(jìn)行各條帶的灰度值分析定量,按照以下公式計(jì)算胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率:胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率=上清蛋白灰度值×上清稀釋倍數(shù)上清蛋白灰度值×上清稀釋倍數(shù)+沉淀蛋白灰度值×沉淀稀釋倍數(shù)×100%。

    1.2.7 大腸桿菌菌落形成單位(colony forming unit assay,簡(jiǎn)稱CFU)檢測(cè) 參照Sahoo等所述流程并略作修改:用含有1.5%瓊脂粉的新鮮LB固體培養(yǎng)基(含 50 μg/mL 卡那霉素)制備平板,將對(duì)照菌液與化學(xué)-滲透壓法處理所得菌液適當(dāng)稀釋后涂平板,于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng) 16 h,取出平板,計(jì)算所得菌落數(shù)量[14-15]。

    1.2.8 大腸桿菌形態(tài)觀察 E. coli細(xì)胞按鄒如意等所述方法[16]進(jìn)行固定,用掃描電鏡技術(shù)(scanning electron microscope,簡(jiǎn)稱SEM)直接觀察E. coli細(xì)胞處理前后的形態(tài),所用儀器為日立公司的S-4800型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡,放大倍數(shù)為2 000倍。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 化學(xué)法預(yù)處理E. coli菌體

    按“1.2.2”節(jié)所述,用10~30 mmol/L EDTA與0.25%~1.25% Triton X-100預(yù)處理E. coli菌體,結(jié)果表明,以上2種試劑分別可以釋放出2.42%~11.8%與12.5%~37.3%的胞內(nèi)蛋白質(zhì),25 mmol/L EDTA與1.00% Triton X-100為各組的較優(yōu)處理(圖1)。EDTA與Triton X-100分別為溫和的螯合劑與表面活性劑,分別作用于細(xì)胞壁中的脂多糖層與磷脂層。由圖1還可以看出,Triton X-100的釋放率高于EDTA,可能因?yàn)镋DTA除去脂多糖層后,磷脂層仍保持完整,胞內(nèi)蛋白質(zhì)不易透過(guò);而Triton X-100除去磷脂層后,脂多糖層有較多間隙,胞內(nèi)蛋白質(zhì)較易透過(guò)。

    2.2 常規(guī)化學(xué)-滲透壓法破碎E. coli菌體

    為了提高胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率,將化學(xué)法預(yù)處理法與常規(guī)滲透壓法聯(lián)用,以20%蔗糖為滲透壓穩(wěn)定劑,進(jìn)行3次滲透壓法處理。結(jié)果表明,化學(xué)法預(yù)處理提高了后續(xù)滲透壓法的破碎效率,不僅釋放出E. coli周質(zhì)空間的蛋白質(zhì),而且釋放出大量胞內(nèi)蛋白質(zhì)。其中,EDTA+20%蔗糖處理可釋放出 16.9%~35.7%的胞內(nèi)蛋白質(zhì);Triton X-100+20%蔗糖處理可釋放出37.6%~84.2%的胞內(nèi)蛋白質(zhì);25 mmol/L EDTA與1.00% Triton X-100分別為各組的較優(yōu)處理(圖2)。形態(tài)結(jié)構(gòu)學(xué)研究表明, E. coli 細(xì)胞具有外膜、 內(nèi)膜的雙層膜結(jié)構(gòu),影響了高滲液與低滲液進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,因此單用滲透壓法不能完全破碎細(xì)胞。而化學(xué)法預(yù)處理可以使外膜與內(nèi)膜產(chǎn)生缺陷,有利于隨后的高滲液、低滲液迅速進(jìn)入細(xì)胞,細(xì)胞來(lái)不及發(fā)生相應(yīng)形變而被完全破碎。

    2.3 改進(jìn)的化學(xué)-滲透壓法破碎E. coli菌體

    改進(jìn)滲透壓穩(wěn)定劑與增加處理次數(shù)可以提高滲透壓法碎菌的效率,因此,分別配制含有35%蔗糖、20% PEG 8000、20% PEG 4000的高滲液進(jìn)行細(xì)胞破碎。如圖3所示:各高滲液的碎菌效率排序依次為35%蔗糖、20%PEG 8000>20% PEG 4000>20%蔗糖;5次滲透壓法碎菌效率比3次滲透壓法高6.9%~46.7%。

    綜上所述,化學(xué)-滲透壓法的最優(yōu)條件為25 mmol/L EDTA預(yù)處理E. coli菌體,再以35%蔗糖或20% PEG 8000為滲透壓穩(wěn)定劑進(jìn)行5次滲透壓法處理;或以1%Triton X-100預(yù)處理E. coli菌體,再以35%蔗糖或20%PEG 8000為滲透壓穩(wěn)定劑進(jìn)行3、5次滲透壓法處理,胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率分別可以達(dá)到93.1%、100.0%。

    2.4 改進(jìn)的化學(xué)-滲透壓法破碎重組PK2β工程菌

    以上述改進(jìn)的化學(xué)-滲透壓法處理重組PK2β工程菌,對(duì)SDS-PAGE凝膠進(jìn)行定量分析表明,25 mmol/L EDTA +35%蔗糖、25 mmol/L EDTA +20% PEG 8000處理分別可以釋放96.4%、91.3%的胞內(nèi)蛋白質(zhì);1% Triton X-100 +35%蔗糖、1% Triton X-100+20% PEG 8000處理分別可以釋放99.0%、94.3%的胞內(nèi)蛋白質(zhì);以超聲破碎法處理重組工程菌,胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率為92.5%。因此可見(jiàn),改進(jìn)的化學(xué)-滲透壓法的破碎效率與目前常用的超聲破碎法相當(dāng)。endprint

    SDS-PAGE結(jié)果還顯示,化學(xué)-滲透壓法破碎工程菌后所得上清及沉淀中均含有重組PK2β,上清中含有的可溶性重組PK2β占總量的70.5%~80.2%;而在超聲破碎法中,處理相同樣品后,重組PK2β均在沉淀中,上清中未見(jiàn)可溶性重組PK2β(圖4)。由此表明,超聲破碎法不僅損傷重組蛋白質(zhì)[17],同時(shí)會(huì)使可溶性重組蛋白質(zhì)變性沉淀,從而增加后續(xù)蛋白質(zhì)分離的難度。

    以菌落形成單位(CFU)檢測(cè)與掃描電子顯微鏡(SEM)觀察化學(xué)-滲透壓法處理對(duì)工程菌細(xì)胞的影響。菌落數(shù)量檢測(cè)結(jié)果表明,化學(xué)-滲透壓法處理后樣品所產(chǎn)生的克隆數(shù)僅為對(duì)照組的1%以下,表明該方法可以完全破碎工程菌細(xì)胞。SEM結(jié)果顯示,破碎前大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)完整,而化學(xué)-滲透壓法處理后大腸桿菌幾乎完全被破碎,留下很多無(wú)定形細(xì)胞殘片;超聲法處理后大腸桿菌發(fā)生斷裂,留下很多短棒狀細(xì)胞殘片(圖5)。由此表明,化學(xué)-滲透壓法與超聲法的碎菌機(jī)制不同,從而產(chǎn)生不同的破碎效果。

    3 討論與結(jié)論

    溫和高效地破碎大腸桿菌細(xì)胞是獲取其胞內(nèi)蛋白質(zhì)的必經(jīng)流程,但現(xiàn)有的細(xì)胞破碎工藝仍有較多不足,影響了基因工程及生物工程的發(fā)展。為了便于后續(xù)分離及獲取有生物活性的重組蛋白,目前常用共表達(dá)分子伴侶蛋白質(zhì)、二硫鍵異構(gòu)酶或脯氨酸異構(gòu)酶,或構(gòu)建帶金黃色葡萄球菌蛋白A、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白malE、大腸桿菌硫氧還蛋白的融合蛋白以提高重組蛋白質(zhì)的可溶性[18-21]。本研究結(jié)果表明,即使有可溶性蛋白表達(dá)出來(lái),超聲破碎法也可能導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)被變性沉淀, 從而使后續(xù)分離復(fù)雜化并

    需要額外的復(fù)性環(huán)節(jié)。

    本研究建立的化學(xué)-滲透壓法具有簡(jiǎn)便高效、成本低廉、易于操作及放大的優(yōu)點(diǎn),可以完全破碎重組PK2β工程菌細(xì)胞,并且獲得70.5%的可溶性重組PK2β,為后續(xù)大量制備該蛋白提供了便利。同時(shí)該法也可用于破碎其他工程菌細(xì)胞,有利于保持其他可溶性重組蛋白質(zhì)的活性,因此在基因工程及生物工程中具有良好的應(yīng)用前景。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Peternel S. Bacterial cell disruption:a crucial step in protein production[J]. New Biotechnology,2013,30(2):250-254.

    [2]吳 蕾,洪建輝,甘一如,等. 高壓勻漿破碎釋放重組大腸桿菌提取包含體過(guò)程的研究[J]. 高校化學(xué)工程學(xué)報(bào),2001,15(2):191-194.

    [3]Feliu J X,Cubarsi R,Villaverde A. Optimized release of recombinant proteins by ultrasonication of E. coli cells[J]. Biotechnology and Bioengineering,1998,58(5):536-540.

    [4]劉建榮,王 慧,趙曉瑜,等. 化學(xué)滲透法破碎基因重組E.coli提取重組人SOD包含體和復(fù)性[J]. 高校化學(xué)工程學(xué)報(bào),2011,25(1):96-102.

    [5]沈徐凱,周 斌,王云艷,等. 丙酮破碎法提取重組大腸桿菌表達(dá)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原[J]. 生物技術(shù)通報(bào),2011(5):223-226.

    [6]劉 冬,吳亞麗,張麗君,等. 重組降血壓肽基因工程菌破碎方法研究[J]. 河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2006,27(3):53-56.

    [7]郭芳芳,應(yīng) 琦,張 充,等. 重組脂肪氧合酶基因工程菌破碎條件優(yōu)化及其酶活力測(cè)定方法研究[J]. 食品科學(xué),2012,33(23):160-165.

    [8]孫 健,楊志建,許國(guó)旺,等. 糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?;傅姆蛛x提取[J]. 工業(yè)微生物,2006,36(1):11-15.

    [9]聞崇煒,劉瑞江,毛春友,等. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化重組原動(dòng)蛋白2β誘導(dǎo)條件的研究[J]. 生物技術(shù)通報(bào),2012(5):173-178.

    [10]吳 蕾,雷 鳴,洪建輝,等. 超聲破碎重組大腸桿菌釋放包含體的過(guò)程研究[J]. 化學(xué)工業(yè)與工程,2002,19(6):422-425.

    [11]林莉萍,董墨思,解婉瑩,等. α-半乳糖苷酶基因工程菌細(xì)胞破碎條件的篩選[J]. 農(nóng)業(yè)科技與裝備,2014,244(10):37-39.

    [12]Laemmli U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature,1970,227(5259):680-685.

    [13]聞崇煒,毛春友,胡萍萍,等. Tricine蛋白質(zhì)電泳定量檢測(cè)溶菌酶方法的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(5):290-292.

    [14]Sahoo M K,Sinha B,Marbaniang M,et al. Transition metal catalyzed mineralization of Calcon and bioassay of the mineralized solutions by Escherichia coli colony forming unit assay[J]. Chemical Engineering Journal,2012,209(41):147-154.

    [15]Zhukova L V,Kiwi J,Nikandrov V V. TiO2 nanoparticles suppress Escherichia coli cell division in the absence of UV irradiation in acidic conditions[J]. Colloids and Surfaces. B,Biointerfaces,2012,97(9):240-247.endprint

    [16]鄒如意,李 妍,鄒珍友,等. 用掃描電鏡觀察不鍍導(dǎo)電膜對(duì)大腸桿菌損傷和圖像的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(32):15692-15693.

    [17]Peternel S,Komel R. Isolation of biologically active nanomaterial (inclusion bodies) from bacterial cells[J]. Microbial Cell Factories,2010,9(1):1-16.

    [18]Srensen H P,Mortensen K K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli[J]. Microbial Cell Factories,2005,4(1):1.

    [19]Martínez-Alonso M,Vera A,Villaverde A. Role of the chaperone DnaK in protein solubility and conformational quality in inclusion body-forming Escherichia coli cells[J]. FEMS Microbiology Letters,2007,273(2):187-195.

    [20]Mentel M,Iancu I,Szabo C Z K,et al. Co-expression of human WDR1 gene with a chaperone increases its protein solubility[J]. Romanian Journal of Biochemistry,2013(1):39-51.

    [21]Sabate R,De Groot N S,Ventura S. Protein folding and aggregation in bacteria[J]. Cellular and Molecular Life Sciences,2010,67(16):2695-2715. 馬 強(qiáng),劉方燕,黨曉群,等. 家蠶微孢子蟲(chóng)類枯草桿菌蛋白酶Nbslp2的保守性及轉(zhuǎn)錄活性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,45(19):150-153.endprint

    猜你喜歡
    可溶性化學(xué)
    鮮地龍可溶性蛋白不同提取方法的比較
    中成藥(2018年8期)2018-08-29 01:28:34
    奇妙的化學(xué)
    奇妙的化學(xué)
    奇妙的化學(xué)
    奇妙的化學(xué)
    奇妙的化學(xué)
    可溶性前驅(qū)體法制備ZrC粉末的研究進(jìn)展
    可溶性Jagged1對(duì)大鼠靜脈橋狹窄的抑制作用
    可溶性ST2及NT-proBNP在心力衰竭中的變化和臨床意義
    血清可溶性ST2與血BNP在心力衰竭患者中的相關(guān)性研究
    亚洲,欧美,日韩| 国产成人精品一,二区| www日本在线高清视频| 久久久国产一区二区| 精品人妻偷拍中文字幕| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久人人爽人人片av| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 日韩av不卡免费在线播放| 国产伦理片在线播放av一区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 成人毛片a级毛片在线播放| 欧美xxⅹ黑人| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 欧美3d第一页| 久久99热6这里只有精品| 国产片特级美女逼逼视频| 欧美精品亚洲一区二区| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲av成人精品一二三区| 久久国产精品大桥未久av| 精品一区二区三卡| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲欧洲日产国产| 国产精品一国产av| 久久国产精品大桥未久av| 成年动漫av网址| 蜜桃国产av成人99| 午夜91福利影院| 国产激情久久老熟女| 在线观看免费日韩欧美大片| 伦理电影大哥的女人| av在线app专区| 欧美精品亚洲一区二区| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 中国国产av一级| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久久精品区二区三区| 热re99久久国产66热| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| av播播在线观看一区| 黄色配什么色好看| av在线老鸭窝| 少妇熟女欧美另类| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 成人毛片a级毛片在线播放| 精品少妇黑人巨大在线播放| 老女人水多毛片| 久久久久国产精品人妻一区二区| 免费观看性生交大片5| 亚洲精品乱久久久久久| 免费高清在线观看视频在线观看| 看十八女毛片水多多多| 欧美97在线视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 大片免费播放器 马上看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 99国产精品免费福利视频| 高清在线视频一区二区三区| 国产黄色视频一区二区在线观看| av国产精品久久久久影院| 午夜激情久久久久久久| 免费观看a级毛片全部| 永久网站在线| 亚洲在久久综合| 精品一区二区三卡| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 男人爽女人下面视频在线观看| xxxhd国产人妻xxx| xxx大片免费视频| 69精品国产乱码久久久| 日本黄大片高清| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 午夜精品国产一区二区电影| 9热在线视频观看99| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 最近最新中文字幕免费大全7| 只有这里有精品99| 满18在线观看网站| 久久久国产精品麻豆| 热99久久久久精品小说推荐| 日日啪夜夜爽| 欧美3d第一页| 丝袜脚勾引网站| 国产免费一区二区三区四区乱码| av天堂久久9| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 成人国产麻豆网| 1024视频免费在线观看| 在线天堂最新版资源| 亚洲久久久国产精品| 秋霞伦理黄片| 精品亚洲成国产av| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲四区av| 在线观看国产h片| 一级片'在线观看视频| 久久这里只有精品19| 国产黄频视频在线观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲国产日韩一区二区| av视频免费观看在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 纯流量卡能插随身wifi吗| 秋霞在线观看毛片| 老司机亚洲免费影院| 丰满少妇做爰视频| 免费观看性生交大片5| 中国国产av一级| 男女边吃奶边做爰视频| 日韩大片免费观看网站| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 欧美国产精品一级二级三级| 国产成人91sexporn| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 曰老女人黄片| 一本大道久久a久久精品| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 午夜福利视频精品| 国产精品女同一区二区软件| 午夜久久久在线观看| 大码成人一级视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 午夜av观看不卡| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产欧美亚洲国产| 国产不卡av网站在线观看| 天天影视国产精品| 久久久a久久爽久久v久久| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 精品一区二区三区视频在线| 一级毛片我不卡| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 视频中文字幕在线观看| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲精品视频女| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲国产日韩一区二区| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产毛片在线视频| 色5月婷婷丁香| 国产精品人妻久久久久久| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 国产在线免费精品| 久久鲁丝午夜福利片| 国产探花极品一区二区| 亚洲精品一二三| kizo精华| 免费在线观看完整版高清| 国产午夜精品一二区理论片| 久久久精品免费免费高清| 午夜免费观看性视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 好男人视频免费观看在线| 美女内射精品一级片tv| 国产精品久久久久久av不卡| 久久久久久久久久人人人人人人| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲在久久综合| 成年人免费黄色播放视频| 国产探花极品一区二区| 亚洲精品美女久久av网站| 尾随美女入室| 亚洲国产精品999| a级片在线免费高清观看视频| 97超碰精品成人国产| 久久亚洲国产成人精品v| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲精品一二三| 伦精品一区二区三区| 色5月婷婷丁香| 91精品三级在线观看| 久久久久久久久久成人| 人妻一区二区av| 尾随美女入室| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产片特级美女逼逼视频| 人妻少妇偷人精品九色| 一二三四在线观看免费中文在 | 男女无遮挡免费网站观看| 午夜福利乱码中文字幕| 成年女人在线观看亚洲视频| 久久狼人影院| 两个人免费观看高清视频| 亚洲精品一二三| 国产探花极品一区二区| 女人久久www免费人成看片| 亚洲中文av在线| 夫妻性生交免费视频一级片| 全区人妻精品视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲天堂av无毛| 草草在线视频免费看| 一级毛片 在线播放| 久久久久视频综合| 欧美精品国产亚洲| 男女国产视频网站| 国产成人av激情在线播放| 黄色毛片三级朝国网站| 精品久久久精品久久久| 2021少妇久久久久久久久久久| 丝袜脚勾引网站| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲美女搞黄在线观看| 精品亚洲成国产av| 美女中出高潮动态图| 国产av一区二区精品久久| 久久亚洲国产成人精品v| 不卡视频在线观看欧美| 久久久国产精品麻豆| 国产精品久久久久久久电影| 在线看a的网站| 成人毛片a级毛片在线播放| av在线观看视频网站免费| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产一区二区在线观看av| 欧美精品国产亚洲| 制服人妻中文乱码| 一二三四中文在线观看免费高清| 99九九在线精品视频| 亚洲国产色片| 欧美3d第一页| 97在线人人人人妻| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲,欧美,日韩| 欧美日韩综合久久久久久| av网站免费在线观看视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 又大又黄又爽视频免费| 爱豆传媒免费全集在线观看| 成人影院久久| 亚洲高清免费不卡视频| 女性被躁到高潮视频| 热re99久久精品国产66热6| 国产色婷婷99| 深夜精品福利| 黑丝袜美女国产一区| 久久久亚洲精品成人影院| 男人操女人黄网站| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲精品国产色婷婷电影| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久精品国产a三级三级三级| 精品国产一区二区三区四区第35| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲人成77777在线视频| a级毛片在线看网站| 精品国产乱码久久久久久小说| 欧美精品国产亚洲| 久久精品久久精品一区二区三区| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 丰满饥渴人妻一区二区三| av线在线观看网站| 赤兔流量卡办理| 国产成人精品在线电影| 国产免费一级a男人的天堂| 街头女战士在线观看网站| av免费在线看不卡| 中国国产av一级| 春色校园在线视频观看| 性色av一级| 一级爰片在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 2018国产大陆天天弄谢| 久久青草综合色| 在现免费观看毛片| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产淫语在线视频| 黄色配什么色好看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 人人妻人人澡人人看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 精品久久久精品久久久| 性色av一级| 久久狼人影院| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 一二三四中文在线观看免费高清| videossex国产| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 中文字幕亚洲精品专区| 国产淫语在线视频| 久久鲁丝午夜福利片| 国产免费福利视频在线观看| 国产精品一国产av| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久热在线av| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲精品456在线播放app| 成人综合一区亚洲| 五月开心婷婷网| 亚洲精品视频女| 我的女老师完整版在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 人妻人人澡人人爽人人| 欧美日韩av久久| 亚洲伊人色综图| 国产精品人妻久久久久久| 不卡视频在线观看欧美| 99视频精品全部免费 在线| 成人国语在线视频| 男女边吃奶边做爰视频| 免费大片18禁| 老司机亚洲免费影院| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲国产看品久久| 精品酒店卫生间| 2022亚洲国产成人精品| www.色视频.com| 天美传媒精品一区二区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 乱人伦中国视频| 日韩成人伦理影院| 亚洲第一区二区三区不卡| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 伦理电影免费视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产成人精品在线电影| 91aial.com中文字幕在线观看| 免费av中文字幕在线| 国产亚洲精品久久久com| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 国产精品欧美亚洲77777| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲精品国产av蜜桃| 成人午夜精彩视频在线观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 日韩伦理黄色片| 日本爱情动作片www.在线观看| 人妻系列 视频| 精品人妻在线不人妻| 最近中文字幕2019免费版| 国产国语露脸激情在线看| 久久99热这里只频精品6学生| 国产精品国产三级国产专区5o| 成人午夜精彩视频在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 18在线观看网站| 多毛熟女@视频| 亚洲国产精品成人久久小说| av黄色大香蕉| 亚洲av电影在线进入| 日韩中字成人| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 97精品久久久久久久久久精品| 国产又爽黄色视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| www.色视频.com| 91精品伊人久久大香线蕉| 在线观看www视频免费| 国产av一区二区精品久久| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲精品色激情综合| 久久国内精品自在自线图片| 国产乱人偷精品视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日韩伦理黄色片| 黄色毛片三级朝国网站| 18禁动态无遮挡网站| 久久鲁丝午夜福利片| 观看av在线不卡| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美亚洲日本最大视频资源| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产一区二区三区av在线| 亚洲国产精品一区三区| 青春草国产在线视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 1024视频免费在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产高清国产精品国产三级| 人妻系列 视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产精品一区二区在线观看99| 成人国产麻豆网| 久久午夜福利片| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| av免费在线看不卡| 国内精品宾馆在线| 免费人成在线观看视频色| 一级片免费观看大全| 国产精品一区二区在线不卡| 国产精品国产三级国产专区5o| 伦精品一区二区三区| av福利片在线| videossex国产| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲国产色片| 18+在线观看网站| 国产精品偷伦视频观看了| 天美传媒精品一区二区| 午夜视频国产福利| 777米奇影视久久| 亚洲少妇的诱惑av| 观看av在线不卡| 狂野欧美激情性bbbbbb| 热99久久久久精品小说推荐| 日韩av不卡免费在线播放| 2018国产大陆天天弄谢| 精品一区二区三区视频在线| 国产又爽黄色视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产国拍精品亚洲av在线观看| av女优亚洲男人天堂| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 中文字幕最新亚洲高清| 人妻系列 视频| 亚洲性久久影院| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久人人爽人人片av| 国产精品不卡视频一区二区| av播播在线观看一区| 久久99热这里只频精品6学生| 欧美日韩亚洲高清精品| 女人久久www免费人成看片| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲成人手机| 精品亚洲成a人片在线观看| 全区人妻精品视频| 在线观看三级黄色| 国产精品一区www在线观看| 蜜桃在线观看..| 91aial.com中文字幕在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 少妇高潮的动态图| 少妇人妻久久综合中文| 99久久精品国产国产毛片| 免费人成在线观看视频色| av网站免费在线观看视频| 免费av中文字幕在线| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产在线视频一区二区| 日本色播在线视频| 免费观看无遮挡的男女| 高清在线视频一区二区三区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产成人91sexporn| 国内精品宾馆在线| 国产av一区二区精品久久| 国产精品成人在线| 国产av国产精品国产| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲av中文av极速乱| 丝袜美足系列| 青春草视频在线免费观看| 久久99蜜桃精品久久| 性色avwww在线观看| 18+在线观看网站| 国产麻豆69| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产精品.久久久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 飞空精品影院首页| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲精品国产色婷婷电影| 欧美成人午夜免费资源| 22中文网久久字幕| 亚洲精品av麻豆狂野| 成年女人在线观看亚洲视频| 日韩伦理黄色片| 97人妻天天添夜夜摸| 少妇高潮的动态图| 有码 亚洲区| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 观看美女的网站| 久久久a久久爽久久v久久| 中文欧美无线码| 色婷婷久久久亚洲欧美| 欧美日本中文国产一区发布| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 美女视频免费永久观看网站| 国产成人精品无人区| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 成人国产麻豆网| 韩国av在线不卡| 国产熟女欧美一区二区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 免费少妇av软件| 国产一区二区在线观看日韩| 国产精品99久久99久久久不卡 | 99久久综合免费| 国产成人午夜福利电影在线观看| 99热网站在线观看| 蜜桃国产av成人99| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 精品卡一卡二卡四卡免费| www.av在线官网国产| 国产男女内射视频| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲av国产av综合av卡| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲精品一二三| 国产成人精品婷婷| 乱人伦中国视频| 欧美日韩视频精品一区| 九色亚洲精品在线播放| 国产有黄有色有爽视频| 国产av国产精品国产| 日韩在线高清观看一区二区三区| 少妇的丰满在线观看| 成年av动漫网址| 91国产中文字幕| 成年人午夜在线观看视频| 国产成人精品在线电影| 天堂8中文在线网| av视频免费观看在线观看| 久久久久视频综合| 熟妇人妻不卡中文字幕| 中文欧美无线码| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 日本黄大片高清| 久久精品国产综合久久久 | 精品一区在线观看国产| 国产成人精品一,二区| 久久久久久人人人人人| freevideosex欧美| 成年人午夜在线观看视频| 国产av码专区亚洲av| 久久 成人 亚洲| 亚洲久久久国产精品| 国产精品三级大全| 国产日韩欧美在线精品| 久久久久久伊人网av| 中文字幕免费在线视频6| 黄片无遮挡物在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 日本黄大片高清| 一区二区三区乱码不卡18| 久久久久国产网址| 国产综合精华液| 日韩在线高清观看一区二区三区| 午夜久久久在线观看| tube8黄色片| 国产成人免费观看mmmm| 内地一区二区视频在线| 哪个播放器可以免费观看大片| a级毛色黄片| 亚洲精品视频女| 黄色视频在线播放观看不卡| 免费观看在线日韩| 性色avwww在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 免费观看无遮挡的男女| 99国产精品免费福利视频| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲欧洲日产国产| 男人添女人高潮全过程视频| 日韩中文字幕视频在线看片| 丁香六月天网| 色吧在线观看| 91成人精品电影| 日日撸夜夜添| av在线app专区| 桃花免费在线播放| 国产在线一区二区三区精| 精品国产一区二区久久| 九九爱精品视频在线观看| 又大又黄又爽视频免费| 18禁观看日本| 少妇人妻 视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 视频区图区小说| 九九爱精品视频在线观看| 观看av在线不卡| 亚洲国产成人一精品久久久| 最黄视频免费看| 中文字幕免费在线视频6| 最新中文字幕久久久久| 男人舔女人的私密视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲精品国产av蜜桃| 人人妻人人澡人人看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产成人91sexporn| videos熟女内射| 色吧在线观看| 亚洲第一av免费看| 久久久国产一区二区| 日韩一区二区视频免费看| 一级片'在线观看视频| 精品视频人人做人人爽| 97在线视频观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产伦理片在线播放av一区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产在线视频一区二区| 国产成人免费无遮挡视频|