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    化學(xué)—滲透壓法溫和破碎處理下大腸桿菌細(xì)胞胞內(nèi)蛋白質(zhì)的釋放率

    2017-11-22 09:09:47趙燁清石莉歐陽(yáng)臻聞崇煒
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年19期
    關(guān)鍵詞:可溶性化學(xué)

    趙燁清+石莉+歐陽(yáng)臻+聞崇煒

    摘要:恰當(dāng)?shù)募?xì)胞破碎工藝是獲取胞內(nèi)蛋白質(zhì)的必需環(huán)節(jié),然而現(xiàn)有細(xì)胞破碎技術(shù)仍有較多不足。為了研究合適的細(xì)胞破碎方法,擬通過(guò)化學(xué)法與滲透壓法的聯(lián)用,建立化學(xué)-滲透壓法溫和高效破碎大腸桿菌細(xì)胞的新工藝。結(jié)果表明:(1)單用化學(xué)法處理大腸桿菌細(xì)胞,最高僅能釋放37.3%的胞內(nèi)蛋白質(zhì),而化學(xué)-滲透壓法最高可以釋放842%的胞內(nèi)蛋白質(zhì);對(duì)滲透壓處理環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化后,胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率提高至93.1%及以上;(2)以優(yōu)化的化學(xué)-滲透壓法釋放重組原動(dòng)蛋白2β(PK2β)工程菌細(xì)胞的胞內(nèi)蛋白質(zhì),其中70.5%~80.2%重組PK2β呈可溶性,而超聲法處理的樣品中不含有可溶性重組PK2β,表明化學(xué)-滲透壓法不僅簡(jiǎn)便高效、成本低廉,而且有利于保留可溶性重組蛋白質(zhì),而超聲破碎法會(huì)導(dǎo)致可溶性蛋白發(fā)生變性沉淀而增加蛋白質(zhì)分離的難度。綜合分析可知,化學(xué)-滲透壓法在基因工程及生物工程中具有良好的應(yīng)用前景。

    關(guān)鍵詞:化學(xué)-滲透壓法;細(xì)胞破碎;溫和高效;胞內(nèi)蛋白質(zhì);可溶性

    中圖分類號(hào): Q939.97 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2017)19-0146-04

    收稿日期:2016-05-04

    基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):81573529);江蘇大學(xué)高級(jí)人才啟動(dòng)基金(編號(hào):1281370001);江蘇省2015年度普通高校研究生實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃(編號(hào):SJLX15_0512);江蘇大學(xué)第14批大學(xué)生科研立項(xiàng)項(xiàng)目(編號(hào):14A441)。

    作者簡(jiǎn)介:趙燁清(1992—),女,江蘇南通人,碩士研究生,主要從事食源性功能肽的研發(fā)工作。E-mail:18796020517@163.com。

    通信作者:聞崇煒,博士,副教授,主要從事食源性功能肽的研發(fā)工作。E-mail:wenchw@ujs.edu.cn。 大腸桿菌(Escherichia coli,簡(jiǎn)稱E. coli)是基因工程與生物工程中表達(dá)重組蛋白質(zhì)最常用的宿主菌。重組蛋白質(zhì)通常被表達(dá)在E.coli胞內(nèi),必須進(jìn)行細(xì)胞破碎后才能進(jìn)行相應(yīng)的分離純化[1]?,F(xiàn)有的細(xì)胞破碎方法分為機(jī)械法、化學(xué)法、物理法及生物酶法四大類,在實(shí)際應(yīng)用中這些方法仍有較多不足。例如,機(jī)械法破碎效率高,但是需要高速珠磨機(jī)、高壓勻漿機(jī)等貴重設(shè)備,同時(shí)由于發(fā)熱大,可能重組蛋白質(zhì)的生物活性[2-3];化學(xué)法簡(jiǎn)便,但所用有機(jī)溶劑及變性劑也可能影響重組蛋白質(zhì)的生物活性[4-5];物理法條件溫和,但破碎效率較低[6];生物酶法條件溫和、破碎效率較高,但碎菌成本較高[7]。因此可見(jiàn),開(kāi)發(fā)溫和且具有高破碎效率的簡(jiǎn)便工藝在基因工程及生物工程中有較高的應(yīng)用價(jià)值。

    形態(tài)結(jié)構(gòu)學(xué)研究表明,E. coli細(xì)胞壁是由脂多糖層、磷脂層與肽聚糖層組成的復(fù)合結(jié)構(gòu),具備較強(qiáng)的抗拉伸與抗剪切能力。滲透壓法利用滲透壓差破碎細(xì)胞,條件溫和,可以很好地保留蛋白質(zhì)的生物活性,但是作用力較弱,不足以完全破碎E. coli細(xì)胞壁,目前僅用于釋放出周質(zhì)空間的蛋白質(zhì)[8]。本試驗(yàn)擬研究將化學(xué)法與滲透壓法聯(lián)用(本研究均簡(jiǎn)稱為化學(xué)-滲透壓法),從而實(shí)現(xiàn)既高效徹底破壞E. coli細(xì)胞壁,又完全釋放胞內(nèi)蛋白質(zhì),同時(shí)能保留蛋白質(zhì)生物活性的可能性。本研究為該法處理E. coli BL21(DE3)、重組原動(dòng)蛋白2β(PK2β)工程菌的試驗(yàn)結(jié)果。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    E. coli BL21(DE3)為筆者所在研究室保存,重組質(zhì)粒pET-28-PK2β為筆者所在研究室構(gòu)建,按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化獲得相應(yīng)重組工程菌[9]。

    蛋白胨、酵母膏,購(gòu)自O(shè)xoid公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、考馬斯亮藍(lán)、卡那霉素、二硫蘇糖醇(DTT),購(gòu)自BBI公司(Bio Basic Inc.);溴酚藍(lán),購(gòu)自AMRESCO公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)(生物技術(shù)級(jí)),購(gòu)自Merck公司;丙烯酰胺(超級(jí)純)、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(超級(jí)純)、乙二胺四乙酸(EDTA,分析純),購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;Triton X-100(化學(xué)純),購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、過(guò)硫酸銨、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺、乙醇、冰醋酸等其他試劑均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;瓊脂粉(進(jìn)口分裝),購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司;蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)SpectraTM Multicolor Broad Range Protein Ladder,購(gòu)自MBI公司,含有10、15、25、35、40、50、70、100、140、260 ku的條帶。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 大腸桿菌培養(yǎng)和收集 E. coli BL21(DE3)采用一步法培養(yǎng):將E. coli BL21(DE3)甘油菌凍存液按1‰比例接種到新鮮LB培養(yǎng)基(含1%蛋白胨、0.5%酵母膏、1% NaCl)中,37 ℃、250 r/min過(guò)夜培養(yǎng)15 h。培養(yǎng)液于10 000 r/min離心5 min,棄上清,菌體保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    重組PK 2β的E. coli BL21(DE3)工程菌采用兩步法培養(yǎng):取3 μL重組工程菌凍存液接種到3 mL新鮮LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)中,37 ℃、250 r/min過(guò)夜培養(yǎng)15 h獲得種子。隨后將種子液按照1%比例接種到新鮮LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)中,37 ℃、250 r/min繼續(xù)培養(yǎng)至D600 nm達(dá)到0.6左右,加誘導(dǎo)劑后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)液于10 000 r/min離心5 min,棄上清,菌體保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 常規(guī)化學(xué)-滲透壓法 包括化學(xué)法預(yù)處理、滲透壓法2個(gè)環(huán)節(jié),具體操作如下:(1)稱取適量?jī)龃鍱. coli菌體,按每30 mg菌體分別加入1 mL EDTA碎菌液或2.5 mL Triton X-100 碎菌液,4 ℃混勻過(guò)夜,然后于10 000 r/min離心 5 min,收集菌體備用;(2)取上述化學(xué)法預(yù)處理所得菌體,按每30 mg菌體加1 mL高滲液的比例重懸,室溫放置20 min,8 000 r/min 離心10 min,再按每30 mg菌體加1 mL低滲液的比例重懸,室溫放置20 min,8 000 r/min離心10 min;(3)繼續(xù)按步驟(2)重復(fù)處理殘留菌體2~4次。分別收集所得上清與沉淀菌體,待分析。endprint

    化學(xué)預(yù)處理液含適量EDTA或Triton X-100,0.05 mol/L Tris·HCl(pH值8.0)及0.10 mol/L NaCl。低滲液含0.02 mol/L Tris·HCl(pH值 8.0)、0.002 5 mol/L EDTA(pH值8.0)。在低滲液中加20%蔗糖作為滲透壓穩(wěn)定劑,即得高滲液。

    1.2.3 改進(jìn)化學(xué)-滲透壓法 具體操作流程同“1.2.2”節(jié);化學(xué)預(yù)處理液成分同“1.2.2”節(jié);低滲液成分同“1.2.2”節(jié);高滲液中改用35%蔗糖或20%PEG 8000為滲透壓穩(wěn)定劑。

    1.2.4 超聲破碎法 按吳蕾等所述流程[10-11]并略作修改:取50 mg菌體重懸于預(yù)冷的低滲液中,冰浴中用超聲破碎儀(購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司)處理(功率300 W,每次超聲破碎25 s,暫停25 s,超聲20次)。取適量樣品于 13 000 r/min 離心10 min,分出上清與沉淀,待分析。

    1.2.5 蛋白質(zhì)電泳 按常規(guī)方法[12]進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析,其中濃縮膠濃度為5%,分離膠濃度為10%。電泳結(jié)束后凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色,脫色后的凝膠用成像系統(tǒng)拍照保存待分析。

    1.2.6 胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率計(jì)算 樣品中蛋白質(zhì)含量與電泳對(duì)應(yīng)條帶及染色后條帶深淺呈線性關(guān)系,因此可通過(guò)分析染色后條帶的灰度值計(jì)算蛋白質(zhì)含量[13]。SDS-PAGE凝膠圖像用Quantity OneTM v 4.5軟件(購(gòu)自Bio-Rad Laboratories Inc.)進(jìn)行各條帶的灰度值分析定量,按照以下公式計(jì)算胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率:胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率=上清蛋白灰度值×上清稀釋倍數(shù)上清蛋白灰度值×上清稀釋倍數(shù)+沉淀蛋白灰度值×沉淀稀釋倍數(shù)×100%。

    1.2.7 大腸桿菌菌落形成單位(colony forming unit assay,簡(jiǎn)稱CFU)檢測(cè) 參照Sahoo等所述流程并略作修改:用含有1.5%瓊脂粉的新鮮LB固體培養(yǎng)基(含 50 μg/mL 卡那霉素)制備平板,將對(duì)照菌液與化學(xué)-滲透壓法處理所得菌液適當(dāng)稀釋后涂平板,于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng) 16 h,取出平板,計(jì)算所得菌落數(shù)量[14-15]。

    1.2.8 大腸桿菌形態(tài)觀察 E. coli細(xì)胞按鄒如意等所述方法[16]進(jìn)行固定,用掃描電鏡技術(shù)(scanning electron microscope,簡(jiǎn)稱SEM)直接觀察E. coli細(xì)胞處理前后的形態(tài),所用儀器為日立公司的S-4800型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡,放大倍數(shù)為2 000倍。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 化學(xué)法預(yù)處理E. coli菌體

    按“1.2.2”節(jié)所述,用10~30 mmol/L EDTA與0.25%~1.25% Triton X-100預(yù)處理E. coli菌體,結(jié)果表明,以上2種試劑分別可以釋放出2.42%~11.8%與12.5%~37.3%的胞內(nèi)蛋白質(zhì),25 mmol/L EDTA與1.00% Triton X-100為各組的較優(yōu)處理(圖1)。EDTA與Triton X-100分別為溫和的螯合劑與表面活性劑,分別作用于細(xì)胞壁中的脂多糖層與磷脂層。由圖1還可以看出,Triton X-100的釋放率高于EDTA,可能因?yàn)镋DTA除去脂多糖層后,磷脂層仍保持完整,胞內(nèi)蛋白質(zhì)不易透過(guò);而Triton X-100除去磷脂層后,脂多糖層有較多間隙,胞內(nèi)蛋白質(zhì)較易透過(guò)。

    2.2 常規(guī)化學(xué)-滲透壓法破碎E. coli菌體

    為了提高胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率,將化學(xué)法預(yù)處理法與常規(guī)滲透壓法聯(lián)用,以20%蔗糖為滲透壓穩(wěn)定劑,進(jìn)行3次滲透壓法處理。結(jié)果表明,化學(xué)法預(yù)處理提高了后續(xù)滲透壓法的破碎效率,不僅釋放出E. coli周質(zhì)空間的蛋白質(zhì),而且釋放出大量胞內(nèi)蛋白質(zhì)。其中,EDTA+20%蔗糖處理可釋放出 16.9%~35.7%的胞內(nèi)蛋白質(zhì);Triton X-100+20%蔗糖處理可釋放出37.6%~84.2%的胞內(nèi)蛋白質(zhì);25 mmol/L EDTA與1.00% Triton X-100分別為各組的較優(yōu)處理(圖2)。形態(tài)結(jié)構(gòu)學(xué)研究表明, E. coli 細(xì)胞具有外膜、 內(nèi)膜的雙層膜結(jié)構(gòu),影響了高滲液與低滲液進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,因此單用滲透壓法不能完全破碎細(xì)胞。而化學(xué)法預(yù)處理可以使外膜與內(nèi)膜產(chǎn)生缺陷,有利于隨后的高滲液、低滲液迅速進(jìn)入細(xì)胞,細(xì)胞來(lái)不及發(fā)生相應(yīng)形變而被完全破碎。

    2.3 改進(jìn)的化學(xué)-滲透壓法破碎E. coli菌體

    改進(jìn)滲透壓穩(wěn)定劑與增加處理次數(shù)可以提高滲透壓法碎菌的效率,因此,分別配制含有35%蔗糖、20% PEG 8000、20% PEG 4000的高滲液進(jìn)行細(xì)胞破碎。如圖3所示:各高滲液的碎菌效率排序依次為35%蔗糖、20%PEG 8000>20% PEG 4000>20%蔗糖;5次滲透壓法碎菌效率比3次滲透壓法高6.9%~46.7%。

    綜上所述,化學(xué)-滲透壓法的最優(yōu)條件為25 mmol/L EDTA預(yù)處理E. coli菌體,再以35%蔗糖或20% PEG 8000為滲透壓穩(wěn)定劑進(jìn)行5次滲透壓法處理;或以1%Triton X-100預(yù)處理E. coli菌體,再以35%蔗糖或20%PEG 8000為滲透壓穩(wěn)定劑進(jìn)行3、5次滲透壓法處理,胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率分別可以達(dá)到93.1%、100.0%。

    2.4 改進(jìn)的化學(xué)-滲透壓法破碎重組PK2β工程菌

    以上述改進(jìn)的化學(xué)-滲透壓法處理重組PK2β工程菌,對(duì)SDS-PAGE凝膠進(jìn)行定量分析表明,25 mmol/L EDTA +35%蔗糖、25 mmol/L EDTA +20% PEG 8000處理分別可以釋放96.4%、91.3%的胞內(nèi)蛋白質(zhì);1% Triton X-100 +35%蔗糖、1% Triton X-100+20% PEG 8000處理分別可以釋放99.0%、94.3%的胞內(nèi)蛋白質(zhì);以超聲破碎法處理重組工程菌,胞內(nèi)蛋白質(zhì)釋放率為92.5%。因此可見(jiàn),改進(jìn)的化學(xué)-滲透壓法的破碎效率與目前常用的超聲破碎法相當(dāng)。endprint

    SDS-PAGE結(jié)果還顯示,化學(xué)-滲透壓法破碎工程菌后所得上清及沉淀中均含有重組PK2β,上清中含有的可溶性重組PK2β占總量的70.5%~80.2%;而在超聲破碎法中,處理相同樣品后,重組PK2β均在沉淀中,上清中未見(jiàn)可溶性重組PK2β(圖4)。由此表明,超聲破碎法不僅損傷重組蛋白質(zhì)[17],同時(shí)會(huì)使可溶性重組蛋白質(zhì)變性沉淀,從而增加后續(xù)蛋白質(zhì)分離的難度。

    以菌落形成單位(CFU)檢測(cè)與掃描電子顯微鏡(SEM)觀察化學(xué)-滲透壓法處理對(duì)工程菌細(xì)胞的影響。菌落數(shù)量檢測(cè)結(jié)果表明,化學(xué)-滲透壓法處理后樣品所產(chǎn)生的克隆數(shù)僅為對(duì)照組的1%以下,表明該方法可以完全破碎工程菌細(xì)胞。SEM結(jié)果顯示,破碎前大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)完整,而化學(xué)-滲透壓法處理后大腸桿菌幾乎完全被破碎,留下很多無(wú)定形細(xì)胞殘片;超聲法處理后大腸桿菌發(fā)生斷裂,留下很多短棒狀細(xì)胞殘片(圖5)。由此表明,化學(xué)-滲透壓法與超聲法的碎菌機(jī)制不同,從而產(chǎn)生不同的破碎效果。

    3 討論與結(jié)論

    溫和高效地破碎大腸桿菌細(xì)胞是獲取其胞內(nèi)蛋白質(zhì)的必經(jīng)流程,但現(xiàn)有的細(xì)胞破碎工藝仍有較多不足,影響了基因工程及生物工程的發(fā)展。為了便于后續(xù)分離及獲取有生物活性的重組蛋白,目前常用共表達(dá)分子伴侶蛋白質(zhì)、二硫鍵異構(gòu)酶或脯氨酸異構(gòu)酶,或構(gòu)建帶金黃色葡萄球菌蛋白A、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白malE、大腸桿菌硫氧還蛋白的融合蛋白以提高重組蛋白質(zhì)的可溶性[18-21]。本研究結(jié)果表明,即使有可溶性蛋白表達(dá)出來(lái),超聲破碎法也可能導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)被變性沉淀, 從而使后續(xù)分離復(fù)雜化并

    需要額外的復(fù)性環(huán)節(jié)。

    本研究建立的化學(xué)-滲透壓法具有簡(jiǎn)便高效、成本低廉、易于操作及放大的優(yōu)點(diǎn),可以完全破碎重組PK2β工程菌細(xì)胞,并且獲得70.5%的可溶性重組PK2β,為后續(xù)大量制備該蛋白提供了便利。同時(shí)該法也可用于破碎其他工程菌細(xì)胞,有利于保持其他可溶性重組蛋白質(zhì)的活性,因此在基因工程及生物工程中具有良好的應(yīng)用前景。

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