• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    宗地花豬GDF9基因多態(tài)性與繁殖性狀關(guān)聯(lián)性分析

    2017-11-22 23:37:24林鵬飛任麗群李平顧麗菊吳光松燕志宏張蕓
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年19期

    林鵬飛+任麗群+李平+顧麗菊+吳光松+燕志宏+張蕓

    摘要:為驗證GDF9基因SNP位點與宗地花豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性,從而為提高宗地花豬繁殖性能提供有價值的分子輔助標(biāo)記,推進選育進程進行試驗。以貴州宗地花豬經(jīng)產(chǎn)母豬為試驗素材,利用DNA池和DNA直接測序方法檢測GDF9基因的多態(tài)性,對各突變位點不同基因型個體與總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、仔豬平均初生質(zhì)量和母豬泌乳力性狀進行關(guān)聯(lián)性分析。在受試群體中,發(fā)現(xiàn)基因GDF9有2個突變位點,C1009T和T1014C均位于exon2;且都與經(jīng)產(chǎn)母豬總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)差異顯著(P<0.05);基因型分別為BB>AB>AA、DD>CD>CC,母豬泌乳力基因型個體之間差異不顯著(P>0.05)。仔豬平均初生質(zhì)量的基因型表現(xiàn)為BB>AB>AA、DD>CD>CC,差異顯著(P<0.05);母豬總產(chǎn)仔數(shù)DD基因型多于DC與CC基因型,DD基因型為優(yōu)勢基因型,D為優(yōu)勢等位基因;BB基因型在總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)的繁殖性狀中多于基因型AB、AA,BB為優(yōu)勢基因型,B為優(yōu)勢等位基因。因此,研究結(jié)果表明推測等位基因D和等位基因B可能為宗地花豬總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)的有利等位基因,且DD基因型和BB基因型為有利基因型。

    關(guān)鍵詞:宗地花豬;GDF9基因;SNP位點;繁殖性狀;關(guān)聯(lián)性分析

    中圖分類號: S828.3 文獻標(biāo)志碼: A 文章編號:1002-1302(2017)19-0224-04

    收稿日期:2017-07-10

    基金項目:貴州省農(nóng)業(yè)動植物育種專項資金(編號:黔農(nóng)育專字[2016]009號)。

    作者簡介:林鵬飛(1991—),男,山東乳山人,碩士研究生,研究方向為動物種質(zhì)資源創(chuàng)新。E-mail:1124800190@qq.com。

    通信作者:燕志宏,教授,研究方向為動物遺傳育種與種質(zhì)資源創(chuàng)新。E-mail:yzh611127@sina.com。 生長分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)超家族中的成員。卵母細胞是GDF9的最初來源,在大部分動物中,僅在動物卵巢的卵母細胞中檢測到GDF9 mRNA和蛋白質(zhì)[1-4]。在一些靈長類動物中,GDF9 mRNA和蛋白質(zhì)在卵母細胞及其鄰近的顆粒細胞中也有發(fā)現(xiàn)[5]。但研究發(fā)現(xiàn)GDF9可通過自分泌和旁分泌的方式,參與調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育和衰退,進而對優(yōu)勢卵泡的選擇及閉鎖卵泡的形成產(chǎn)生影響[6]。GDF9特殊性在于GDF9僅有6個Cys,而一般的TGF-β家族成員具有7個或者9個[7],GDF9基因位于常染色體上,人的GDF9基因在5號常染色體上,而豬的GDF9基因則定位于2號染色體上[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)在羊的原始卵泡中有GDF9基因的mRNA表達,一旦原始卵泡的卵母細胞產(chǎn)生GDF9,卵泡就開始發(fā)育[10]。Li等通過觀察豬卵母細胞不同時間GDF9基因的表達時發(fā)現(xiàn),GDF9在不成熟的卵母細胞中高度表達,在成熟的卵母細胞中逐漸減少[11]。于佐卿等以陶灘寒雜種羊和德灘寒雜種羊為研究對象,發(fā)現(xiàn)GDF9基因多態(tài)性對羊羔初生質(zhì)量無顯著影響[12]。由此可推測,GDF9基因?qū)游锏纳彻δ芫哂兄匾恼{(diào)節(jié)作用。

    宗地花豬是貴州省優(yōu)良地方豬種之一,皮厚而糯、肉嫩味香,為人們所喜愛。但飼養(yǎng)周期長、產(chǎn)仔數(shù)少、生產(chǎn)效率低、成本高、養(yǎng)殖投入高、收益低等原因使得宗地花豬養(yǎng)殖群體規(guī)模發(fā)展緩慢。針對宗地花豬的保種選育,相關(guān)機構(gòu)和學(xué)者做了很多研究,推進了宗地花豬的開發(fā)利用。馮文豪等對宗地花豬的胴體肉質(zhì)性狀進行測定,結(jié)果顯示雖然宗地花豬瘦肉率明顯低于大白豬,但是肉質(zhì)性狀優(yōu)于大白豬[13]。隨后,張蕓等分別研究了不同飼養(yǎng)方式對宗地花豬的胴體和肉質(zhì)性狀影響和不同飼養(yǎng)方式下宗地花豬肌肉營養(yǎng)成分及品質(zhì)的影響[14]。燕志宏等研究宗地花豬1世代的生長發(fā)育情況,隨后在2011年研究了宗地花豬及其與長白豬和大白豬的雜種一代豬哺乳期和保育期的生長性能[15]。毛同輝等對對產(chǎn)區(qū)保種選育基礎(chǔ)群進行了繁殖性能測定,隨后開始對宗地花豬繁殖性能進行了研究[16]。隨著分子生物學(xué)的蓬勃發(fā)展,燕志宏等[17-20]、魏小紅等[21]、李平等[22]、顧麗菊等[23]、任麗群等[24]和閆雷等[25]分別對影響宗地花豬肉質(zhì)和繁殖性狀的一些相關(guān)基因進行了研究,取得了一定的研究成果。本試驗旨在驗證GDF9基因SNP位點與宗地花豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性分析,從而為提高宗地花豬繁殖性能提供有價值的分子輔助標(biāo)記,推進選育進程進行試驗。

    1 材料與方法

    1.1 試驗動物樣本

    66頭宗地花豬經(jīng)產(chǎn)母豬來自貴州紫薇畜牧業(yè)開發(fā)有限公司宗地花豬飼養(yǎng)場,各頭母豬均健康,在相同的飼養(yǎng)環(huán)境和管理條件下進行飼養(yǎng),用耳缺鉗采取每頭母豬耳根邊緣耳組織,放入裝有濃度為70%乙醇的1.5 mL離心管中,冰盒帶回實驗室,于-20 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 主要試劑和儀器

    Ezup柱式動物基因組DNA提取試劑盒、核酸染料、 DL2000 DNA Marker、 2×Taq Master Mix 、瓊脂糖等均來自上海生工生物工程有限公司;去離子水、 無水乙醇、TAE緩沖液等試劑為實驗室自備。PCR擴增儀(PTC200,美國Bio-rad公司),凝膠成像系統(tǒng)(BioSens SC 710,美國Bio-rad公司),微量移液器(ACURA825,SOCOREX公司)。

    1.3 DNA提取

    用基因組DNA提取試劑盒提取母豬耳根邊緣耳組織DNA,含有核酸染料1%瓊脂糖凝膠電泳檢測檢測純度,并用紫外分光光度計測量每個樣品DNA濃度3次,取其平均值,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 引物設(shè)計及PCR擴增

    參照 NCBI(登錄號為NC-010444.1)提供的豬GDF9基因序列,利用Primer Premier 5.0軟件結(jié)合Oligo 6.0軟件設(shè)計引物(表1),應(yīng)用NCBI Blast軟件檢測所設(shè)計引物的特異性。引物送往英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。endprint

    1.5 統(tǒng)計分析

    經(jīng)檢測濃度及純度后,為使樣品DNA濃度接近,稀釋至相同濃度后,抽取5 μL充分振蕩混勻構(gòu)建貴州宗地花豬品種DNA池。將所構(gòu)建的宗地花豬DNA池作為模板,根據(jù)20 μL PCR反應(yīng)體系和擴增條件進行擴增,擴增產(chǎn)物由1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,檢測合格后直接將產(chǎn)物送往北京諾賽基因公司進行雙向測序。根據(jù)DNA池篩選各基因的SNPs位點,選擇具有多態(tài)位點的片段,利用DNAStar等軟件分析測序結(jié)果,篩選SNPs位點,分析不同位點在受試群體中的基因型頻率和遺傳特異性,并進行哈迪-溫伯格平衡檢測;根據(jù)最小二乘線性模型,分析不同基因型與樣本母豬繁殖性能(在相同飼養(yǎng)條件下,測定記錄健康狀況良好的經(jīng)產(chǎn)母豬總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、仔豬初生窩質(zhì)量和20日齡窩質(zhì)量以計算經(jīng)產(chǎn)母豬泌乳力)的關(guān)聯(lián)效應(yīng)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 DNA提取結(jié)果

    根據(jù)全基因組DNA提取試劑盒提取豬的全基因組DNA,用含核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的全基因組DNA。由圖1可知,條帶明亮清晰、整齊無拖尾,可直接用于接下來的試驗。

    2.2 PCR擴增

    對66頭宗地花豬經(jīng)產(chǎn)母豬進行PCR擴增,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,均顯示為1條特異性條帶,其片段長度P1、P2分別為533、910 bp,與預(yù)期目標(biāo)片段相符,條帶清晰、整齊無拖尾(圖2),可用于測序。

    2.3 GDF9基因DNA池PCR測序結(jié)果與測序結(jié)果分析

    將所得PCR產(chǎn)物送往北京諾賽基因組研究中心有限公司進行純化切膠回收測序,對所得序列運用SeqMan和BioXM等軟件進行分析比對,在GDF9基因發(fā)現(xiàn)2個SNPs位點,分別在1 009 bp與1 014 bp處,均位于第2外顯子上(圖3)。

    運用SeqMan軟件對所有樣品的測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),第2外顯子C1009T位點處發(fā)生堿基突變,發(fā)現(xiàn)3種基因型,分別命名為AA、AB和BB基因型。T1014C位點處發(fā)生堿基突變,發(fā)現(xiàn)3種基因型,分別命名為CC、CD和DD基因型,有2個等位基因C和D。通過序列對比發(fā)現(xiàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)AA和CC基因型個體序列與GenBank上所提交的豬的基因序列一致,定義為野生型,BB型和DD型則定義為突變型,AB基因型和CD基因型定義為雜合型。

    2.4 GDF9基因不同SNPs位點基因與基因型頻率

    由表2可知,在宗地花豬母豬群中3種基因型頻率分布為AA>AB>BB,其基因型頻率分別為0.393 9、0.318 2和0.287 9。等位基因A和B的基因頻率分別為0.553 0和0447 0。由表3可知,在宗地花豬母豬群中3種基因型頻率分布為CC>CD>DD,其基因型頻率分別為0.378 8、0.348 5和0.2727,等位基因C和D的基因頻率分別為0.553 0和0447 0。

    2.5 GDF9基因不同SNPs位點χ2檢驗及群體遺傳學(xué)參數(shù)

    由表4可知,GDF9基因C1009T位點由χ2適應(yīng)性檢驗顯示,χ2<χ20.05(2)=5.99,說明該位點群體遺傳變異處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。該位點雜合度為0.494 4,多態(tài)信息含量PIC=0.3722,0.25

    由表5可知,GDF9基因T1014C位點χ2適應(yīng)性檢驗顯示,χ2<χ20.05(2)=5.99,說明該位點群體遺傳變異處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。該位點雜合度為0.494 4,多態(tài)信息含量PIC=0.3834,0.25

    2.6 GDF9基因不同SNPs位點關(guān)聯(lián)性分析

    由表6可知,在宗地花豬母豬群中,總產(chǎn)仔數(shù)表現(xiàn)為基因型BB>AB>AA,B為優(yōu)勢等位基因,BB基因型為優(yōu)勢基因型,總產(chǎn)仔數(shù)最高,方差分析顯示,其中BB基因型個體與AA基因型個體間差異極顯著(P<0.01),AB基因型個體與AA基因型個體差異顯著(P<0.05);產(chǎn)活仔數(shù)表現(xiàn)為基因型BB>AB>AA,BB產(chǎn)活仔數(shù)最高,方差分析顯示,BB基因型和AB基因型均顯著高于AA基因型(P<0.05);仔豬平均初生質(zhì)量BB基因型最高,為優(yōu)勢基因型,BB基因型個體比AA基因型個體間平均初生質(zhì)量高80 g,差異顯著(P<0.05);母豬泌乳力是基因型AA>BB>AB,3種基因型個體之間差異不顯著(P>0.05)。

    由表7可知,在宗地花豬母豬群中,總產(chǎn)仔數(shù)純合子高于雜合子,表現(xiàn)為基因型DD>CD>CC,DD基因型為優(yōu)勢基因型,總產(chǎn)仔數(shù)最高,D為優(yōu)勢等位基因。方差分析顯示,其中DD、CD基因型個體與CC基因型個體差異均顯著(P<005),產(chǎn)活仔數(shù)表現(xiàn)為基因型DD>CD>CC,DD產(chǎn)活仔數(shù)最高,DD基因型個體與CC、CD基因型個體差異均顯著(P<005);仔豬平均初生質(zhì)量DD基因型最高,為優(yōu)勢基因型,DD基因型個體與CC基因型個體間平均初生質(zhì)量差異顯著(P<0.05),DD基因型比CC基因型高77 g;母豬泌乳力是基因型CC>DD>CD,3種基因型個體之間差異不顯著(P>0.05)。

    3 結(jié)論

    張璐等研究表明,遼寧黑豬和長白豬的產(chǎn)仔數(shù)在不同基因型之間差異顯著,而在大白豬、丹麥豬和杜洛克豬的不同基因型間差異不顯著(P>0.05)[26]。孟洪莉等研究了豬繁殖相關(guān)基因多態(tài)性及其關(guān)聯(lián)性,結(jié)果表明,大白豬和長白豬的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均表現(xiàn)出AA>GG>AG的趨勢,其中長白經(jīng)產(chǎn)母豬的AA和GG型個體的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均顯著高于AG型(P<0.05)[27]。本研究結(jié)果表明:(1)在GDF9基因第2外顯子上發(fā)現(xiàn)2個SNPs位點,分別是C1009T和T1014C。(2)綜合本試驗中的產(chǎn)仔數(shù)指標(biāo),在C1009T和T1014C表現(xiàn)出顯著影響,說明GDF9基因?qū)ψ诘鼗ㄘi產(chǎn)仔數(shù)有顯著影響(P<0.05)。GDF9基因在C1009T和T1014C位點的多態(tài)性均對宗地花豬的仔豬平均初生質(zhì)量有顯著影響。(3)母豬總產(chǎn)仔數(shù)DD基因型多于DC與CC基因型,DD基因型為優(yōu)勢基因型,D為優(yōu)勢等位基因;BB基因型在總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)的繁殖性狀中多于基因型AB、AA,BB為優(yōu)勢基因型,B為優(yōu)勢等位基因。因此,研究結(jié)果表明推測等位基因D和等位基因B可能為宗地花豬總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)的有利等位基因,且DD基因型和BB基因型為有利基因型。

    參考文獻:

    [1]Yoshida M,Cran D G,Pursel V G. Confocal and fluorescence microscopic study using lectins of the distribution of cortical granules during the maturation and fertilization of pig oocytes[J]. Molecular Reproduction and Development,1993,36(4):462-468.

    [2]Vitt U A,Hsueh A J. Stage-dependent role of growth differentiation factor-9 in ovarian follicle development[J]. Molecular and Cellular Endocrinology,2001,183(1/2):171-177.

    [3]Clelland E S,Kelly S P. Exogenous GDF9 but not Activin A,BMP15 or TGFβ alters tight junction protein transcript abundance in zebrafish ovarian follicles[J]. General and Comparative Endocrinology,2011,171(2):211-217.

    [4]彭中友,孫俊銘,李 燕,等. GDF9 和 FST調(diào)控豬卵母細胞成熟和胚胎早期發(fā)育[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2015,31(3):583-589.

    [5]Dey S R,Deb G K,Ha A N,et al. Coculturing denuded oocytes during the in vitro maturation of bovine cumulus oocyte complexes exerts a synergistic effect on embryo development[J]. Theriogenology,2012,77(6):1064-1077.

    [6]Elvin J A,Yan C,Matzuk M M. Oocyte-expressed TGF-β superfamily members in female fertility[J]. Molecular and Cellular Endocrinology,2000,159(1):1-5.

    [7]Incerti B,Dong J,Borsani G,et al. Sturcutre of the mouse growth/differentiation factor 9 gene[J]. Biochimica et Biophysica Acta,1994,1222(1):125-128.

    [8]Sadighi M,Bodensteiner K J,Beattie A E,et al. Mapping of ovine growth differentiation factor-9(GDF9)to sheep chromosome 5[J]. Animal Genetics,2002,33(3):244-245.

    [9]Cepica S,Procházka R,Civánová K,et al. Partial molecular characterization and mapping of the GDF9 gene to porcine chromosome 2[J]. Animal Genetics,2004,35(3):261-262.

    [10]Solovyeva E V,Hayashi M,Margi K,et al. Growth differentiation factor-9 stimulates rat theca-interstitial cell androgen biosynthesis[J]. Biology of Reproduction,2000,63(4):1214-1218.

    [11]Li H K,Kuo T Y,Yang H S,et al. Differential gene expression of bone morphogenetic protein 15 and growth differentiation factor 9 during in vitro maturation of porcine oocytes and early embryos[J]. Animal Reproduction Science,2008,103(3):312-322.

    [12]于佐卿,楊博輝,郭 健,等. 兩種綿羊雜種GDF9 基因和 FecB 基因的多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)和體重關(guān)系的研究[J]. 中國草食動物,2008,28(2):5-8.

    [13]馮文豪,燕志宏,毛同輝. 貴州宗地花豬胴體肉質(zhì)性狀測定初報[J]. 貴州畜牧獸醫(yī),2008,32(2):9-10.

    [14]張 蕓,陳 偉,李 平,等. 不同飼養(yǎng)方式宗地花豬的胴體和肉質(zhì)性狀[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2014(9):164-166.

    [15]燕志宏,毛同輝,馮文豪. 宗地花豬ESR、FSHβ基因的多態(tài)性及其對繁殖性能的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(7):134-137.

    [16]燕志宏,田松軍,申紅艷,等. 宗地花豬1世代的生長發(fā)育研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(24):13107-13108.endprint

    [17]燕志宏,田松軍,韋玉美. 貴州宗地花豬最佳屠宰體重的研究[J]. 豬業(yè)科學(xué),2010,27(7):102-104.

    [18]宗秋芳,戴開宇,劉穎,等. 豬氨肽酶N(APN)基因密碼子偏好性分析[J]. 揚州大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版),2016,37(2):45-50,73.

    [19]楊開典,陳偶,齊傳翔,等. 豬STC-1 siRNA設(shè)計及其基因沉默效率檢測[J]. 揚州大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版),2017,38(1):16-19.

    [20]燕志宏,張 蕓,田松軍. 宗地花豬及其雜種1代豬哺乳期和保育期生長性能的研究初報[J]. 養(yǎng)豬,2011(3):47-48.

    [21]魏小紅,田松軍,燕志宏,等. 紫云縣宗地花豬發(fā)展現(xiàn)狀及展望[J]. 貴州畜牧獸醫(yī),2014,38(2):25-27.

    [22]李 平,燕志宏,陳 偉,等. 宗地花豬H-FABP基因mRNA的表達與肉質(zhì)性狀的相關(guān)研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī),2015,42(3):644-649.

    [23]顧麗菊,任麗群,燕志宏,等. 宗地花豬和從江香豬ADRP基因多態(tài)性及生物信息學(xué)分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2015,34(11):2395-2401.

    [24]任麗群,燕志宏,顧麗菊,等. 貴州宗地花豬的GDF9基因多態(tài)性及生物信息學(xué)分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2015,34(11):2402-2407.

    [25]閆 雷,林家棟,燕志宏,等. 宗地花豬生長激素基因TaqⅠ多態(tài)性及其對屠宰性狀的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(5):170-172.

    [26]張 璐. 豬BMP15、GDF9和FSHβ基因的遺傳多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性研究[D]. 保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.

    [27]孟洪莉. 豬繁殖相關(guān)基因多態(tài)性檢測及其關(guān)聯(lián)分析[D]. 福州:福建農(nóng)林大學(xué),2012. 更正 茲有沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)郭偉等作者發(fā)表于《江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)》2017年第45卷第11期73-76頁的論文《施硅對稻田稗草光合及生理特性的影響》,由于失誤,原作者排序“楊顏熙,耿珍珍,郭 偉,李 晴,李亮亮”存在順序錯誤,其中“郭偉”應(yīng)為第一作者,正確作者排序為“郭 偉,楊顏熙,耿珍珍,李 晴,李亮亮”。特此更正,并向作者和讀者致歉。

    《江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)》編輯部

    2017年10月 丁立云,饒 毅,陳文靜,等. 投喂頻率對彭澤鯽幼魚生長性能、形體指標(biāo)和肌肉品質(zhì)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,45(19):228-231.endprint

    国产成人精品久久二区二区91| 国产一区二区三区视频了| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲,欧美精品.| 一夜夜www| 国产成人av教育| 黄色丝袜av网址大全| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 18禁国产床啪视频网站| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 精品久久蜜臀av无| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 九色国产91popny在线| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲五月色婷婷综合| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 搡老岳熟女国产| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产精品一区二区在线不卡| 免费看美女性在线毛片视频| 99国产精品99久久久久| 久久九九热精品免费| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 老司机午夜福利在线观看视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 精品福利观看| xxx96com| bbb黄色大片| 一进一出抽搐动态| 国产av又大| 一级,二级,三级黄色视频| 一夜夜www| 日本免费a在线| 中文字幕人妻熟女乱码| 日韩高清综合在线| 国产成人影院久久av| 制服丝袜大香蕉在线| 久久中文看片网| 在线播放国产精品三级| 久9热在线精品视频| 久久久久久久精品吃奶| 日韩有码中文字幕| 看免费av毛片| 免费在线观看影片大全网站| 日本精品一区二区三区蜜桃| 成年人黄色毛片网站| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产视频一区二区在线看| 久久亚洲精品不卡| 1024视频免费在线观看| 正在播放国产对白刺激| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品,欧美在线| 1024视频免费在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产私拍福利视频在线观看| 久久久久国内视频| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲一区中文字幕在线| 一区福利在线观看| 麻豆av在线久日| 多毛熟女@视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产不卡一卡二| 国产成人精品无人区| 夜夜夜夜夜久久久久| 久久精品国产综合久久久| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲人成77777在线视频| 热99re8久久精品国产| 看免费av毛片| 此物有八面人人有两片| 国产成人精品在线电影| 99久久精品国产亚洲精品| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 一级a爱视频在线免费观看| 国产一区在线观看成人免费| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 免费无遮挡裸体视频| 男女午夜视频在线观看| 黄频高清免费视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产免费男女视频| 午夜影院日韩av| 免费高清在线观看日韩| 亚洲免费av在线视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 美女午夜性视频免费| 啪啪无遮挡十八禁网站| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产主播在线观看一区二区| 99riav亚洲国产免费| 黑人欧美特级aaaaaa片| 午夜视频精品福利| 国产精品av久久久久免费| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲最大成人中文| 黄色女人牲交| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲人成电影免费在线| 精品国产国语对白av| 国产成人系列免费观看| 亚洲av熟女| 欧美国产日韩亚洲一区| 动漫黄色视频在线观看| 久久久国产精品麻豆| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产伦一二天堂av在线观看| 欧美在线黄色| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲精品av麻豆狂野| 波多野结衣高清无吗| 国产av精品麻豆| 99久久综合精品五月天人人| 激情在线观看视频在线高清| 国产精品久久久人人做人人爽| 十八禁人妻一区二区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久国产亚洲av麻豆专区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产一区在线观看成人免费| 国产成人影院久久av| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品影院久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 午夜福利在线观看吧| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲精品在线美女| 免费高清在线观看日韩| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲五月色婷婷综合| 变态另类丝袜制服| 亚洲免费av在线视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 婷婷六月久久综合丁香| 久久九九热精品免费| 久久久久久久久中文| 亚洲成人精品中文字幕电影| 最近最新免费中文字幕在线| 一级毛片女人18水好多| 免费看a级黄色片| 亚洲av熟女| 亚洲情色 制服丝袜| 色哟哟哟哟哟哟| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产麻豆69| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 一级毛片精品| 欧美在线黄色| 久久九九热精品免费| 精品卡一卡二卡四卡免费| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 亚洲五月婷婷丁香| 国产成人精品久久二区二区免费| 欧美在线黄色| 成人手机av| 看黄色毛片网站| 国产在线观看jvid| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 免费观看精品视频网站| 黄色成人免费大全| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲成av人片免费观看| 国产精品 欧美亚洲| 国产午夜福利久久久久久| 日韩视频一区二区在线观看| 日本三级黄在线观看| 999久久久精品免费观看国产| 90打野战视频偷拍视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 午夜视频精品福利| 亚洲国产精品成人综合色| 国产在线精品亚洲第一网站| av中文乱码字幕在线| 免费搜索国产男女视频| 91在线观看av| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲欧美激情综合另类| 中文亚洲av片在线观看爽| 淫秽高清视频在线观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 12—13女人毛片做爰片一| 黑丝袜美女国产一区| 国产激情久久老熟女| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 级片在线观看| 免费看a级黄色片| 一边摸一边抽搐一进一小说| 久久精品国产综合久久久| av视频免费观看在线观看| 99香蕉大伊视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 日韩视频一区二区在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲少妇的诱惑av| a在线观看视频网站| 精品国产国语对白av| 国产欧美日韩一区二区三| bbb黄色大片| 欧美精品亚洲一区二区| 久久久久久大精品| 正在播放国产对白刺激| 久久国产乱子伦精品免费另类| 在线观看午夜福利视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲av美国av| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美日韩黄片免| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产成人系列免费观看| 欧美色视频一区免费| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产99白浆流出| 一夜夜www| 看免费av毛片| 久久亚洲精品不卡| 两人在一起打扑克的视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 日韩欧美国产在线观看| 丁香欧美五月| 好男人在线观看高清免费视频 | 国产xxxxx性猛交| 制服诱惑二区| 成人国产综合亚洲| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 亚洲av片天天在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 中文字幕色久视频| 一本大道久久a久久精品| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 制服人妻中文乱码| 免费无遮挡裸体视频| 免费看a级黄色片| av有码第一页| 日韩欧美免费精品| 亚洲久久久国产精品| 亚洲成人国产一区在线观看| 69av精品久久久久久| 欧美丝袜亚洲另类 | 日本 欧美在线| 涩涩av久久男人的天堂| 精品久久蜜臀av无| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产亚洲欧美98| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 中文字幕最新亚洲高清| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产免费男女视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品第一国产精品| x7x7x7水蜜桃| 窝窝影院91人妻| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 午夜久久久在线观看| 麻豆成人av在线观看| 久久中文看片网| av福利片在线| 久久精品国产综合久久久| 亚洲国产精品999在线| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美国产日韩亚洲一区| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲人成77777在线视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 大型av网站在线播放| 日韩欧美在线二视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 久久精品人人爽人人爽视色| 黄频高清免费视频| 欧美成人午夜精品| 波多野结衣av一区二区av| 日本五十路高清| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 国产成人精品无人区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 一级黄色大片毛片| 美女大奶头视频| 亚洲av电影在线进入| 中文字幕人妻熟女乱码| 精品无人区乱码1区二区| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲avbb在线观看| 一级毛片高清免费大全| 欧美日韩精品网址| 亚洲片人在线观看| 色播亚洲综合网| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产黄a三级三级三级人| 视频在线观看一区二区三区| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久午夜综合久久蜜桃| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 国产免费男女视频| 男女下面进入的视频免费午夜 | 美女高潮到喷水免费观看| 一区二区三区精品91| 亚洲国产欧美网| 无遮挡黄片免费观看| 色播亚洲综合网| 黄片播放在线免费| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲avbb在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 在线十欧美十亚洲十日本专区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 91麻豆av在线| 国产xxxxx性猛交| 欧美黄色淫秽网站| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲免费av在线视频| 神马国产精品三级电影在线观看 | 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 亚洲全国av大片| 久久久国产成人免费| 欧美成人午夜精品| 十八禁人妻一区二区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 午夜福利影视在线免费观看| 免费观看人在逋| 精品国产国语对白av| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产黄a三级三级三级人| 一级毛片女人18水好多| 在线天堂中文资源库| 中文字幕久久专区| 1024香蕉在线观看| 久久热在线av| 十八禁网站免费在线| 午夜久久久久精精品| 国产精品久久久久久精品电影 | 亚洲专区国产一区二区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 午夜两性在线视频| 欧美乱妇无乱码| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久九九热精品免费| 在线观看www视频免费| 国产精华一区二区三区| 亚洲熟女毛片儿| 国产精品久久视频播放| 亚洲熟女毛片儿| a在线观看视频网站| 久久香蕉精品热| 十八禁人妻一区二区| 午夜两性在线视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲成人免费电影在线观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲色图av天堂| 亚洲九九香蕉| 欧美乱色亚洲激情| 大型av网站在线播放| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 成人永久免费在线观看视频| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 色婷婷久久久亚洲欧美| 免费观看人在逋| 不卡av一区二区三区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 又大又爽又粗| 999精品在线视频| 麻豆国产av国片精品| 身体一侧抽搐| 精品国产一区二区久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 精品久久久久久成人av| 一a级毛片在线观看| 欧美中文综合在线视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 日韩欧美国产在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 国产精品电影一区二区三区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 久久国产精品影院| 一本久久中文字幕| 欧美一区二区精品小视频在线| 后天国语完整版免费观看| 久久久久久人人人人人| 国产精华一区二区三区| 精品电影一区二区在线| 亚洲人成电影免费在线| 久久人人精品亚洲av| 最新在线观看一区二区三区| 午夜a级毛片| 精品久久久久久成人av| 亚洲第一青青草原| 久久 成人 亚洲| 18禁国产床啪视频网站| 成人欧美大片| 日韩欧美免费精品| 九色亚洲精品在线播放| 国产av又大| 大型黄色视频在线免费观看| av片东京热男人的天堂| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲avbb在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 中文字幕高清在线视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 欧美日韩精品网址| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 欧美一区二区精品小视频在线| 极品人妻少妇av视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 日韩欧美在线二视频| 18禁国产床啪视频网站| 看片在线看免费视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 91九色精品人成在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 十八禁人妻一区二区| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 十分钟在线观看高清视频www| 国产不卡一卡二| 级片在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看 | 在线观看午夜福利视频| 少妇粗大呻吟视频| 欧美中文日本在线观看视频| 免费av毛片视频| 正在播放国产对白刺激| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 日日爽夜夜爽网站| 日韩三级视频一区二区三区| 中文字幕高清在线视频| 久久久久久久精品吃奶| 妹子高潮喷水视频| 无人区码免费观看不卡| 亚洲精品一区av在线观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久精品国产清高在天天线| 99国产精品99久久久久| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产成人av教育| 一级a爱片免费观看的视频| 丝袜美腿诱惑在线| 国产精品国产高清国产av| 69av精品久久久久久| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 男人操女人黄网站| 成人国产一区最新在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 黄色a级毛片大全视频| 日韩视频一区二区在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美日韩一级在线毛片| 婷婷精品国产亚洲av在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 天堂√8在线中文| 美国免费a级毛片| 日本 欧美在线| 亚洲成人久久性| aaaaa片日本免费| 一区福利在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 18禁美女被吸乳视频| 久久香蕉精品热| 三级毛片av免费| 亚洲国产精品999在线| 中文字幕最新亚洲高清| 淫秽高清视频在线观看| 国产乱人伦免费视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲欧美精品综合久久99| 日韩欧美三级三区| 在线国产一区二区在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 午夜两性在线视频| 很黄的视频免费| 国产高清激情床上av| 国产99久久九九免费精品| 日本免费a在线| 久热爱精品视频在线9| 操出白浆在线播放| 日韩精品免费视频一区二区三区| 脱女人内裤的视频| 国产亚洲精品久久久久5区| av免费在线观看网站| 欧美日韩福利视频一区二区| 男人舔女人下体高潮全视频| 91老司机精品| 大陆偷拍与自拍| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产国语露脸激情在线看| avwww免费| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 男女之事视频高清在线观看| 欧美日韩黄片免| 欧美中文日本在线观看视频| 88av欧美| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 青草久久国产| 亚洲精品一区av在线观看| 级片在线观看| 国产精品av久久久久免费| 久久香蕉精品热| 亚洲成a人片在线一区二区| 免费少妇av软件| 校园春色视频在线观看| 美女高潮到喷水免费观看| 9热在线视频观看99| 免费在线观看黄色视频的| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲精品av麻豆狂野| 人成视频在线观看免费观看| 18禁观看日本| 成人18禁在线播放| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 九色亚洲精品在线播放| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 黄色女人牲交| 男男h啪啪无遮挡| 日韩av在线大香蕉| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久伊人香网站| 国产成人精品在线电影| 一边摸一边做爽爽视频免费| 最新在线观看一区二区三区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产欧美日韩一区二区精品| av在线播放免费不卡| 久久国产亚洲av麻豆专区| av超薄肉色丝袜交足视频| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产三级黄色录像| 欧美性长视频在线观看| 久久性视频一级片| 国产真人三级小视频在线观看| 窝窝影院91人妻| 母亲3免费完整高清在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产人伦9x9x在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 一二三四在线观看免费中文在| 极品人妻少妇av视频| 在线免费观看的www视频| 超碰成人久久| 在线观看免费午夜福利视频| 一区福利在线观看| 精品国产国语对白av| 在线观看免费日韩欧美大片| 日本欧美视频一区| 看片在线看免费视频| 又大又爽又粗| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 搞女人的毛片| 99香蕉大伊视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 搡老熟女国产l中国老女人| 午夜精品在线福利| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美大码av| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 一级a爱视频在线免费观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 十八禁网站免费在线| 97人妻天天添夜夜摸| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 深夜精品福利| 欧美乱色亚洲激情| 在线观看日韩欧美| 久久天堂一区二区三区四区| 老司机深夜福利视频在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲视频免费观看视频| 天天一区二区日本电影三级 | 一区福利在线观看| 韩国av一区二区三区四区| 后天国语完整版免费观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲一区二区三区不卡视频| www.www免费av| 国产真人三级小视频在线观看| 看黄色毛片网站| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲五月色婷婷综合| 精品久久蜜臀av无| 久久久久久大精品| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久久久久大精品| 999久久久精品免费观看国产| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 精品国产乱码久久久久久男人| ponron亚洲|