19種常見中藥材醇提物的體外抗菌活性篩選

張鐵煥 吳玉霞 奠佐紅 左國營

摘?要：為考察19種中藥材乙醇提取物的體外抗臨床常見致病菌的活性，該文將中藥粗粉用80%乙醇浸泡提取， 提取液減壓濃縮制備成浸膏，采用瓊脂打孔法測定提取物抑菌圈， 通過微量倍比稀釋法測定最低抑菌濃度（MIC） 和最低殺菌濃度（MBC/MFC）。結果表明：所篩選的19種中藥材乙醇提取物對不同的菌株具有不同程度的抑制作用， 14種中藥材乙醇提取物抗SA、EC、PA和CA的抑菌圈范圍在8～27 mm之間， 其中地錦草、四塊瓦、三顆針、馬尾黃連和土大黃的提取物抗SA、EC的抑菌圈范圍在10.3～26.6 mm之間。馬尾黃連、孜然、地錦草、廣西莪術、穿心蓮、益母草、吳茱萸、土大黃、葉上花、土連翹、鳳尾草和三顆針的醇提物對MRSA和銅綠假單胞菌耐藥菌均具有顯著的抗微生物活性， 其MIC/MBC值在391～6 250 μg·mL-1之間;地錦草、三顆針抗MRSA的最低MIC值分別為391、781 μg·mL-1， 抗PA耐藥菌的最低MIC值均為1 562.5 μg·mL-1;馬尾黃連、孜然和三顆針的醇提物對白色念珠菌耐藥菌有中等抑制作用， 殺菌效果不明顯。該研究結果為后續(xù)相關植物作為潛在抗菌化合物及其抗菌藥物佐劑的研究提供了參考。

關鍵詞：中藥材， 病原菌， 抗菌活性， 最低抑菌濃度， 最低殺菌濃度

中圖分類號：Q946

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）12-1712-09

Abstract：In order to determine the antimicrobial activities of ethanol extracts from 19 Chinese herbal medicines in vitro against common clinical pathogenic bacteria.?The dried powder of the collected 19 Chinese herbal medicine samples were extracted with 80% ethanol at room temperature and the solvent was evaporated under reduced pressure to get the ethanol extracts. In this study， each extract was screened for antimicrobial activity using the agar diffusion method， and minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal/fungicidal concentration （MBC/MFC） were determined by serial microdilution method. The results were as follows：Ethanol extracts of 19 Chinese herbal medicine had different degrees of antimicrobial activities. Inhibition zones of 14 ethanol extracts against SA， EC， PA and CA were between 8-27 mm， inhibition zones of the extracts from Euphorbia humifusa， Chloranthus japonicas， Berberis sargentiana， Thalictrum petaloideum and Rumex madaio were between 10.3-26.6 mm against SA and EC. The ethanol extracts from Thalictrum petaloideum， Cuminum cyminum， Euphorbia humifusa， Curcuma kwangsiensis， Andrographis paniculata， Leonurus artemisia， Evodia rutaecarpa， Rumex madaio， Helwingia japonica， Hymenodictyon flaccidum， Pteris multifida and Berberis sargentiana had significant antimicrobial activities against pathogens（MRSA and Pseudomonas aeruginosa resistant strain）， the ranges of MICs/MBCs were between 391 and 6 250 μg·mL-1; the lowest MIC values for Euphorbia humifusa and Berberis sargentiana against MRSA were obtained （respectively， 391 μg·mL-1/781 μg·mL-1）， the lowest MIC value for Euphorbia humifusa and Berberis sargentiana was 1 562.5 μg·mL-1against Pseudomonas aeruginosa resistant strain; the ethanol extracts from Thalictrum petaloideum， Cuminum cyminum， Berberis sargentiana were moderately inhibitory to the test Candida albicans resistant strain， and the sterilization effect was not obvious. These results provide the reference for selecting plant species as potential antibacterial compounds and antibacterial adjuvants of antibacterial and antifungal drugs.

Key words：Chinese herbal medicines， pathogens， antibacterial activity， minimum inhibitory concentration （MIC）， minimum bactericidal/fungicidal concentration （MBC/MFC）

1929年Alexander Fleming 發(fā)現(xiàn)青霉素， 人類進入了抗生素的輝煌時代， 但抗生素創(chuàng)造的輝煌僅僅持續(xù)了40年。導致感染疾病卷土重來的主要原因是抗菌藥的不合理使用急劇增加了微生物對現(xiàn)有抗菌藥的多藥耐藥。病原微生物對抗生素的耐藥性問題可導致臨床抗感染治療的失敗， 進而導致死亡人數增加。利用新的抗菌藥物及其抗菌增效劑來切斷或逆轉病原微生物對抗生素的耐藥是國內外針對耐藥問題興起的研究熱點， 有望成為解決耐藥性問題的新途徑（Pages et al.， 2011; Reens， 2018; Mouwakeh et al.， 2019）。長期以來， 中草藥一直被用于治療感染性疾?。∕ohanta et al.， 2012; 李延鴻和朱懷軍， 2013; Mohanta et al.， 2014; 張馳等， 2017;Jiang et al.， 2019）。與合成抗生素相比， 從不同植物中提取的活性成分治療潛力較大而副作用較小。開發(fā)有效、安全的天然產物來控制多重耐藥性（MDR）病原體迫在眉睫。

中草藥在體外抗菌活性方面的篩選， 國內外文獻均有相關報道。Panda et al. （ 2016）篩選了222種植物不同部位提取物的抗菌活性，結果顯示篩選物種對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌都具有抑菌活性。Pauw & Eloff （2014）為了尋求具有強抑制活性的物質， 隨機篩選了南非數百種樹種葉提取物的抗病原微生物的活性。李鶴（2017）篩選了地錦草不同部位對紅色毛癬菌的抗菌活性并進行其物質基礎研究，研究結果表明地錦草醇提物的抑菌效果總體優(yōu)于各分段部位。張丹媚等（2008）通過抑菌實驗和電鏡技術等方法測定研究了廣西莪術油對6種植物病原真菌的抑制作用， 結果表明廣西莪術油具有較強的抑菌活性。大部分植物的抗菌研究程度不明確， 且其對耐藥菌株抗菌活性的報道少見?；谡n題組前期工作及其我國物種優(yōu)勢， 結合植物化學分類學考察， 本研究通過研究19種中藥材對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， SA）、大腸埃希菌 （Escherichia coli， EC）、白色念珠菌（Candida albicans， CA）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa， PA）四種標準菌以及MRSA、銅綠假單胞菌耐藥菌、白色念珠菌耐藥菌的體外抑制作用， 以篩選出抑菌活性較好的中草藥品種， 為這些植物的化學成分的進一步研究提供依據， 通過活性成分追蹤、分離， 鑒定先導化合物的結構為進一步研究提供科學依據， 進而為緩解細菌耐藥性問題提供一定的參考。

1?材料與試劑

1.1 藥材

大百部（Radix stemona）、小百部（Asparagus officinalis）、馬尾黃連（Thalictrum petaloideum）、孜然（Cuminum cyminum）、地錦草（Euphorbia humifusa）、穿心蓮（Andrographis paniculata）、廣西莪術（Curcuma kwangsiensis）、益母草（Leonurus artemisia）、四塊瓦（Chloranthus japonicus）、吳茱萸（Evodia rutaecarpa）、蒲公英（Taraxacum mongolicum）、土大黃（Rumex madaio）、紫菀（Aster tataricus）、大戟（Euphorbia pekinensis）、白術（Atractylodes macrocephala）、葉上花（Helwingia japonica）、土連翹（Hymenodictyon flaccidum）、鳳尾草（Pteris multifida）、三顆針（Berberis sargentiana），這些受試中藥材均購買于云南省昆明市螺螄灣中藥材市場，由中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二○醫(yī)院藥學部植物化學研究中心鑒定并進行樣本保存。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 （ nutrient agar， 北京三藥科技開發(fā)公司， 批號為 180503）， 沙氏瓊脂培養(yǎng)基（sabourauds， agar， 青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司， 批號為 20180515）， 液體沙氏培養(yǎng)基 （ liquid sabourand medium， 青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司， 批號為 20160822）， 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（nutrient broth， 北京三藥科技開發(fā)公司， 批號為 171110）。試劑：NaCl （四川西隴化工有限公司， 批號為 20151219）， 二甲基亞砜[dimethyl sulfoxide， DMSO， 利安隆博華（天津） 醫(yī)藥化學有限公司， 批號為 20151009]， 乙醇均為工業(yè)級（ 重新蒸餾后使用），均購自昆明福海達化玻儀器有限公司。

1.3 實驗菌株

實驗菌株：金黃色葡萄球菌[ATCC 29213、CMCC（B） 26003]、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、大腸埃希菌[CMCC（B） 44102]、白色念珠菌（ATCC Y0109、ATCC SC5314）均由中國藥品生物制品檢定所、廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。耐藥菌株：銅綠假單胞菌耐藥株（PA 135、PA 204、PA 216、PA 238、PA 244、PA 276、PA 283、PA 294、PA 314、PA 319）;耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA 8、MRSA 23、MRSA 40、MRSA 82、MRSA 98、MRSA 115、MRSA 128、MRSA 166、MRSA 187、MRSA 331）;白色念珠菌耐藥菌（CA 100、 CA 152、 CA 632、 CA 649、CA 819、 CA 953、 CA 956）均由中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二○醫(yī)院藥學部臨床微生物實驗室從本院臨床重癥感染患者標本中分離得到，經過形態(tài)學和生化學鑒定。

2?實驗方法

2.1 中藥浸膏的制備

將19種中藥材打成粗粉， 用80%的乙醇室溫下共浸泡6次：第1次浸泡7 d; 第2、第3次浸泡5 d; 第4、第5 次浸泡3 d; 第6次浸泡1 d。每次浸泡液經8層紗布過濾，合并濾液， 減壓濃縮（溫度控制在40 ℃以下） 制備為浸膏， 用結晶刀轉移至無菌玻璃瓶中， 4 ℃下封口保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 藥液和菌液的制備

藥液：稱取50 mg藥物浸膏于（2 mL）EP管中， 加入10%DMSO 作為助溶劑，超聲震蕩使藥物溶解， 在超凈工作臺里加入滅菌生理鹽水， 配成濃度為50 mg·mL-1 的藥液。菌液：將菌株接種于瓊脂培養(yǎng)基上， 細菌用 M-H 瓊脂培養(yǎng)基，真菌用沙保羅氏瓊脂， 置于35 ℃恒溫箱中培養(yǎng)20 h，采用 0.5號麥氏比濁管將細菌濃度配置為 1.5×108CFU·mL -1， 真菌用細胞計數板配成 1.0×106 CFU·mL -1， 用于做藥物敏感性和瓊脂擴散法測量抑菌圈。細菌300倍稀釋成 5×105 CFU·mL -1， 真菌100倍稀釋成1.0×104 CFU·mL -1， 用于最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC/MFC）的測定。

2.3 體外抑菌活性的測定

2.3.1 瓊脂擴散法測定抑菌圈?先用打孔器將瓊脂平板均勻打上5個直徑為6 mm 的孔備用;再用棉簽沾取細菌濃度為1.5×108 CFU·mL-1 的菌液均勻涂布于 M-H 瓊脂平板， 真菌菌液濃度為 1.0×106 CFU·mL-1， 涂布于沙保羅氏瓊脂平板上; 最后于每孔加入50 μL濃度 50 mg·mL-1藥液，藥液不得溢出孔外。 瓊脂平板放入35 ℃ 恒溫箱中培養(yǎng)20 h， 用卡尺測量抑菌圈的直徑， 做3次平行實驗， 取平均值。 根據藥理學試驗方法判斷：抑菌圈<10 mm為耐藥和無抑菌作用;10 mm為輕度敏感;11～15 mm為中度敏感;≥16 mm為高度敏感?？股氐囊志σ耘R床和實驗室標準（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）作為標準。

2.3.2 MIC和MBC/MFC的測定?采用微量液體培養(yǎng)基倍比稀釋法（胡歡等， 2018）， 具體實驗步驟見參照文獻。

3?結果與分析

3.1 中藥材醇提物抑菌圈測定結果

通過瓊脂打孔法測定各藥材的抑菌圈， 結果見表1。 對照標準SA， 19種藥材中馬尾黃連、地錦草、三顆針抑菌圈直徑均大于16 mm具有高度敏感強抑制作用;穿心蓮、益母草、土大黃、葉上花、土連翹、鳳尾草抑菌圈直徑在 10～16 mm 之間表現(xiàn)為中輕度敏感。對于標準EC， 地錦草、四塊瓦、三顆針、土大黃抑菌圈直徑在 10～16 mm 之間表現(xiàn)為中輕度敏感。對于標準PA， 四塊瓦、紫菀、孜然、益母草、鳳尾草、馬尾黃連抑菌圈直徑均為10 mm表現(xiàn)為輕度敏感。對于標準CA， 三顆針抑菌圈直徑≥16 mm表現(xiàn)為高度敏感強抑制作用;四塊瓦、馬尾黃連抑菌圈直徑在 10～16 mm 之間表現(xiàn)為中輕度敏感。

3.2 MIC和MBC/MFC測定結果

根據抑菌圈篩選結果選定部分中藥材，通過微量倍比稀釋法分別測定了藥物提取物對各標準菌及其各耐藥菌的抗菌活性。各組實驗中，陰性對照顯示細菌長勢良好，排除10%DMSO對實驗的干擾; 空白對照顯示無菌生長，表明該實驗操作規(guī)范、無污染。表2結果表明，各中藥材的乙醇提取物對4株細菌標準菌具有不同程度的抑制作用，其MIC/MBC值主要集中在3 125 ～12 500 μg·mL-1之間，其中孜然對兩株標準CA具有抑制作用，其MIC/ MFC值在3 125 ～12 500 μg·mL-1之間。表3、表4結果表明馬尾黃連、孜然、地錦草、廣西莪術、穿心蓮、益母草、吳茱萸、土大黃、葉上花、土連翹、鳳尾草和三顆針的醇提物對MRSA和銅綠假單胞菌耐藥菌均具有顯著的抗微生物活性，其MIC/MBC值在391～6 250 μg·mL-1之間。表5結果表明馬尾黃連、孜然和三顆針的醇提物對白色念珠菌耐藥菌有中等抑制作用，殺菌效果不明顯。

4?討論

本研究結果顯示，馬尾黃連、地錦草、穿心蓮、益母草、土大黃、土連翹、鳳尾草和三顆針提取物濃度≤50 mg·mL-1時對測試的標準菌具有抑菌圈， 所篩選植物對測試菌株的MIC值在391 ～ 6 250 μg·mL-1之間;馬尾黃連、地錦草、三顆針等一半的植物提取物在MIC≤6 250 μg·mL-1時顯示出抗菌活性。其中地錦草抗MRSA的最低MIC值為391 μg·mL-1， 抗PA耐藥菌的最低MIC值為1 562.5 μg·mL-1;三顆針MIC值在781～3 125 μg·mL-1時抗MRSA和銅綠假單胞菌耐藥菌顯示出較強的抗菌活性， 且MIC值在3 125 μg·mL-1時對白色念珠菌耐藥菌株也有一定抑制作用。根據相關研究報道馬尾黃連、孜然、地錦草、廣西莪術、穿心蓮、益母草、吳茱萸、土大黃、葉上花、土連翹、鳳尾草和三顆針等所含主要成分為萜類、酚類、生物堿等， 且本文研究結果顯示抗菌活性較強， 與Zacchino et al.（2017） 報道的天然低分子化合物增強抗菌劑抗菌能力的物質主要集中在酚類和萜類物質的結果相近。此外， 觀察到紫菀、白術、蒲公英等植物提取物在瓊脂打孔法中未顯示出抑菌圈，但在肉湯稀釋法中MIC≥3 125 μg·mL-1時敏感， 此現(xiàn)象表明中草藥提取物的抑菌圈大小與其相應的MIC值不一定成平行關系， 可能是由于中草藥提取物含有多種成分而各成分溶解的分散性不同;各類物質作用方式不同， 如酚類具有很強的結合不同大分子的能力， 萜類物質其親脂性強且具有穿透細胞壁的巨大潛力等。本研究中觀察到同種菌不同菌株之間對不同藥物的敏感性差異， 其主要原因可能在于每種植物所含成分及其含量不同所致;同種植物對不同菌株的抗菌差異可能在于菌株耐藥機制的不同。中草藥與化學藥相比， 中草藥大多為復方組分群， 各成分之間具有一定相互聯(lián)系， 且藥物進入細胞可發(fā)生極其復雜的生化變化， 通常表現(xiàn)為整體量效作用， 并非簡單作用于某一單一靶點（韓飛等， 2016）;測試菌株對抗微生物劑具有不同水平的內在耐受性。在細菌及真菌耐藥性的研究中天然產物與抗菌劑的聯(lián)合也為新的抗菌藥物組合開辟了極具希望的前景（Zacchino et al.， 2017）。隨著“中藥綠色抗生素”邁入一個嶄新時代的同時， 由于中藥抗菌耐藥性的機制尚未明確， 物質基礎研究不夠充分， 分子水平的基礎研究相對較少， 作用靶點仍舊模糊， 中草藥在進一步開發(fā)和商業(yè)化之前， 基礎篩選研究中評估植物提取物的安全性至關重要， 其主要包括進行動物和人體研究以確定其在整個有機體系中的有效性。中草藥抗細菌及真菌耐藥性的研究仍然處在初級階段， 還有更多的問題等待我們去研究和探討。

參考文獻：

HAN F， XING RH， CHEN LQ， et al.， 2016. Research progress of anti-drug resistance in traditional Chinese medicine[J]. Chin J Chin Mat Med， 41（ 5） ：813-817.[韓飛， 幸仁匯， 陳琳琦， 等， 2016. 中藥抗細菌耐藥性的研究進展[J]. 中國中藥雜志，41（5）：813-817.]

HU H， ZUO GY， ZHANG ZP， 2018. Screening of antimicrobial activities of 36 Chinese herbal medicines in vitro[J]. Guihaia， 38（4） ：428-440.[胡歡， 左國營， 張澤萍 2018. 36種中藥材體外抗菌活性篩選研究[J]. 廣西植物， 38（4）：428-440.]

JIANG S， WAN K， LOU HY， et al.， 2019. Antibacterial bibenzyl?derivatives from the tubers of Bletilla striata[J]. Phytochemistry， 162：216-223.

LI H， 2017. Study on the material basis of anti-dermatophytes of Euphorbiae humifusae herba[D]. Beijing：Peking Union Medical College.[李鶴， 2017. 地錦草抗皮膚癬菌物質基礎研究[D]. 北京：北京協(xié)和醫(yī)學院.]

LI YH， ZHU HJ， 2013. Study on eliminating effect of traditional Chinese medicine of unilateral or compound on Escherichia coli R plasmids[J]. Prac Pharm Clini Remed， 16（12）：1147-1150.[李延鴻， 朱懷軍， 2013. 中藥單方或復方對大腸埃希菌R質粒消除作用的研究[J]. 實用藥物與臨床，16（12）：1147-1150.]

MOHANTA TK， OCCHIPINTI A， ZEBELO SA， et al.， 2012. Ginkgo biloba responds to herbivory by activating early signaling and direct defenses[J]. PLoS ONE， 7（3）： e32822.

MOHANTA TK， TAMBOLI Y， ZUBAIDHA PK， 2014. Phytochemical and medicinal importance of Ginkgo biloba L.[J]. Nat Prod Res， 28（10）：746-752.

MOUWAKEH A， KINCSES A， NOVE M， et al.， 2019. Nigella sativa essential oil and its bioactive compounds as resistance modifiers against Staphylococcus aureus[J]. Phytotherapy Research：1-9. https：//doi.org/10.1002/ptr.6294.

PAGES JM， AMARAL L， FANNING S， 2011. An original deal for new molecule：Reversal of efflux pump activity， a rational strategy to combat gram-negative resistant bacteria[J]. Phytother Res， 18（19）：2969-2980.

PANDA SK， MOHANTA YK， PADHI L， et al.， 2016. Large scale screening of ethnomedicinal plants for identification of potential antibacterial compounds[J]. Molecules，21（3）： 293.

PAUW E， ELOFF JN， 2014. Which tree orders in southern Africa have the highest antimicrobial activity and selectivity against bacterial and fungal pathogens of animals？[J].?BMC Compl Altern Med， 14：317.

REENS AL， 2018. A cell-based infection assay identifies efflux pump modulators that reduce bacterial intracellular load[J]. BMC Compl Altern Med， 14（6）： e1007115.

ZACCHINO SA， BUTASSI E， LIBERTO MD， et al.， 2017. Plant phenolics and terpenoids as adjuvants of antibacterial and antifungal drugs[J]. Phytomedicine，?37：27-48.

ZHANG C， JIA X， YANG L， et al.， 2017. A study on the antibacterial effect of Chinese medicine plumbagin on tigecycline-resistant Acinetobacter baumannii[J]. J Chengdu Med Coll， 12（2）：117-121.[張馳， 賈旭， 楊羚， 等， 2017. 中藥單體白花丹醌對替加環(huán)素耐藥鮑曼不動桿菌的抗菌作用研究[J]. 成都醫(yī)學院學報， 12（2）：117-121.]

ZHANG DM， LI Q， MA DW， et al.， 2008. Study on antifungal activity of oil from Curcuma kwangsiensis S.G.Lee.et C.F.Liang[J].

J Anhui Univ （Nat Sci Ed）， 32（1）：81-84.[張丹媚， 李群， 馬丹煒， 等， 2008. 廣西莪術油抑制植物病原真菌活性的研究[J]. 安徽大學學報（自然科學版）， 32（1）：81-84.]

（責任編輯?李?莉）