2 株真菌的鑒定及對禾谷孢囊線蟲的防治效果

陳秀菊，堅晉卓，李惠霞，李瑞，盧智琴

(甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州730070)

禾谷孢囊線蟲Heteroderaavenae是重要的病原線蟲，其寄主包括小麥屬、大麥屬等32個屬60余種禾本科作物和紫羊茅等多種雜草，嚴重影響小麥、燕麥、大麥、裸大麥等作物生產(chǎn)[1]。禾谷孢囊線蟲病在全球多個國家均有發(fā)生和為害[2]，一般患病麥田可減產(chǎn)20%～30%[3]，嚴重時可使小麥減產(chǎn)50%～90%[4]。1989年，該病在我國湖北首次被公開報道，隨后在北京、河南、河北、山西、陜西、內(nèi)蒙古、甘肅等地相繼被發(fā)現(xiàn)[1,5-8]。侵染麥類的孢囊線蟲有禾谷孢囊線蟲H.avenue、菲利普孢囊線蟲H.filipjevi、麥類孢囊線蟲H.latipons、雙膜孔孢囊線蟲H.bifenestra和稀少孢囊線蟲H.mani等。目前，我國報道的種主要為H.avenae和H.filipjevi[9]。作為我國小麥種植大省，甘肅省小麥常年種植面積超過90萬hm2，受到禾谷孢囊線蟲的嚴重侵害。李惠霞等[10]調(diào)查結果顯示，甘肅省禾谷孢囊檢出率超過47.9%，2/3以上的鄉(xiāng)鎮(zhèn)有孢囊線蟲分布，全省約44.2萬hm2小麥受禾谷孢囊線蟲病為害。

禾谷孢囊線蟲病主要通過土壤傳播，可通過農(nóng)事操作、農(nóng)業(yè)機械、人、畜、水流等途徑近距離傳播，也可經(jīng)暴雨、洪水、運輸車輛等途徑遠距離傳播[11-12]。由于線蟲及其寄主地理分布非常廣泛，寄主種類繁多，易于傳播擴散，化學防治存在成本高、毒性大、易殘留、破壞土壤生態(tài)、污染水源、線蟲易產(chǎn)生抗藥性等一系列弊端，生物防治因以下優(yōu)點而備受關注，選擇性強、對人及家畜無毒無害；利用可再生資源，低碳環(huán)保；對環(huán)境友好，對生態(tài)環(huán)境影響較小，易被植物、土壤微生物和陽光降解[13]。

在線蟲病害生物防治方面研究較多的有厚垣普可尼亞菌Pochoniachlamydosporia、少孢節(jié)叢孢Arthrobotrysoligospora[14]、球孢白僵菌Beauveria bassiana[15]和淡紫紫孢菌Purpureocillium lilacinum[16]等真菌，其中淡紫紫孢菌和厚垣普可尼亞菌已經(jīng)商品化，并廣泛使用[17-18]。目前，用于植物線蟲的生防細菌有蘇云金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis[19]、堅強芽孢桿菌Bacillus firmus[20]和枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis[21]等。為了進一步拓展禾谷孢囊線蟲病的生防菌資源，本研究擬對前期篩選得到的2株真菌的殺線蟲活性進行離體活性測定和盆栽試驗，以期為禾谷孢囊線蟲病生防菌的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

禾谷孢囊線蟲采自甘肅省永登縣受禾谷孢囊線蟲侵染的麥田。

供試菌株A 1和B1由甘肅農(nóng)業(yè)大學植物線蟲學實驗室前期分離和保存。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學鑒定挑取待測真菌菌絲于PDA 培養(yǎng)基上，在25℃條件下培養(yǎng)7 d 后，觀察菌株生長速度、菌落顏色及表面特征等，在顯微鏡下觀察菌絲、孢子，記錄菌株的形態(tài)特征。

1.2.2 分子生物學鑒定 按照生工真菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取真菌基因組DNA，?20℃保存?zhèn)溆?。采用通用引物ITS1(5′-CTTGGTCAT TTAGAGGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCT CCUCTTATTUATATUC-3′)進行PCR 擴增。擴增產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測序，在NCBI數(shù)據(jù)庫上通過BLAST 比對分析，用MEGA 6.0中的UPGAM法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 禾谷孢囊線蟲的采集選擇甘肅省永登縣禾谷孢囊線蟲發(fā)生較嚴重的田地，用Z字形取樣法采集土樣，去除表層干土，取0～20 cm 層的土壤，將多點土樣混合后裝入封口塑料袋中，帶回實驗室。用漂浮法分離孢囊，在解剖鏡下觀察，挑取飽滿的棕色孢囊，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 卵和2齡幼蟲懸浮液的制備挑取飽滿的棕色孢囊，加入5 g·L?1NaC lO溶液，表面消毒3m in，滅菌水多次清洗后，用橡皮塞磨破孢囊后，將卵懸浮液倒入200目和500目組合篩，用無菌水沖洗，收集卵懸浮液，將卵懸浮液濃度調(diào)整為1 000mL?1。

4℃冰箱處理6～8周的禾谷孢囊線蟲，用5 g·L?1NaClO溶液表面消毒3 m in，滅菌水清洗3～5次后，置于100目網(wǎng)篩上。將網(wǎng)篩置于滅菌培養(yǎng)皿里，加滅菌水至浸沒孢囊，15℃黑暗條件下孵化。4 d 后開始收集2齡幼蟲，并配置成濃度為1 000 mL?1的線蟲懸浮液。

1.2.5 真菌孢子懸浮液的制備取在PDA 平板上培養(yǎng)7 d 的菌株，加入1滴吐溫80和2.5mL 無菌水沖洗，使其分生孢子脫落，得到分生孢子懸浮液，用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整濃度為1×107CFU·mL?1備用。

1.2.6 發(fā)酵液的制備 將2mL 1×107CFU·mL?1的分生孢子懸浮液接種在100 mL PD 培養(yǎng)液中(150 mL三角瓶)，26℃，150 r·m in?1振蕩培養(yǎng)120 h。10 000 r·m in?110m in，用0.22 μm 細菌過濾器過濾。經(jīng)上述處理后的懸浮液作為發(fā)酵原液，同時用滅菌水制備5倍和10倍發(fā)酵液，并測定發(fā)酵液的pH。

1.2.7 生防菌對禾谷孢囊線蟲孢囊的寄生作用將分離出的生防菌株轉移至PDA 培養(yǎng)基上，等菌落直徑長至培養(yǎng)皿1/2時，將消毒后的孢囊放入菌落邊緣，每皿10個孢囊。培養(yǎng)7 d 后，將孢囊移出培養(yǎng)皿，5 g·L?1NaClO溶液表面消毒3m in，每個孢囊單獨置于經(jīng)滅菌的濾紙片上，加滅菌水保濕培養(yǎng)，6 d 后觀察菌株對孢囊的寄生作用。

1.2.8 真菌發(fā)酵液對卵孵化的影響分別吸取100 μL生防菌原液(1倍)、5倍、10倍發(fā)酵液，加入到滅菌的96孔細胞培養(yǎng)板中，然后向每個孔中分別加入200μL卵懸浮液。每個濃度重復3次，以空白培養(yǎng)基濾液為對照。試驗在15℃條件下，每隔2 d 在顯微鏡下觀察1次。12 d 后鏡檢、記錄各菌株發(fā)酵液對卵孵化的影響，統(tǒng)計相對抑制率。

1.2.9 真菌發(fā)酵液對J2的致死作用分別吸取100μL生防菌1倍、5倍、10倍發(fā)酵液，加入無菌96孔細胞培養(yǎng)板中，每個濃度重復3次，然后向每個孔中分別加入200μL 2齡幼蟲懸浮液。試驗在15℃條件下進行，以培養(yǎng)基濾液為空白對照，每個處理重復3次。分別在24、48和72 h 鏡檢各處理中線蟲的死亡情況，用NaOH 法測定線蟲的死活，并計算死亡率和校正死亡率。

1.2.10 室內(nèi)防效測定從禾谷孢囊線蟲病田采集土樣，過篩使每100 g 土含20個孢囊，然后將病土裝入直徑21 cm 的花盆，每盆約1 500 g 土。

制備麥麩培養(yǎng)基，高溫滅菌(121℃，30m in)，接菌后28℃條件下培養(yǎng)7 d。以1%、2%和3%的比例將其與病土混勻，裝入盆中，挑選飽滿的寧春50號種子播種，每盆13粒，每處理4盆，以不接生防真菌的病土為對照。

播種10 d 后調(diào)查出苗率，90 d 后調(diào)查發(fā)病情況，將植株從盆中取出，盡可能保持根系完整。將植株根系用自來水沖洗干凈，放在盛有清水的塑料盤中調(diào)查病情，記錄土中孢囊量，計算孢囊減少率，并測量小麥的根長和株高。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel2003進行數(shù)據(jù)處理和表格繪制，并采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，用最小顯著差異法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學鑒定

A1菌株在PDA 培養(yǎng)基25℃條件下培養(yǎng)7 d，菌落直徑為3.2～4.5 cm，菌落中央淡黃色至深綠色，邊緣白色，有放射狀溝紋(圖1a)。菌落背面奶油色至淡褐色(圖1b)，產(chǎn)生大量分生孢子。分生孢子球形或近球形，長4.0～6.5μm，寬4.5～6.0μm ，一部分菌絲形成長而粗糙的分生孢子梗，頂端產(chǎn)生燒瓶形頂囊，表面著生許多小梗，小梗上產(chǎn)生成串的分生孢子(圖1c)。初步鑒定為曲霉屬Aspergillus真菌（注：A1的鑒定已發(fā)表于大豆科學）。

圖1 菌株A1(a～c)、B1(d～f)的培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征Fig.1 Cultural characteristics and morphologies of strain A1(a?c)and B1(d?f)

B1菌株在PDA 培養(yǎng)基上，菌落初期白色呈氈狀，后期變?yōu)闇\綠色，致密地平鋪在培養(yǎng)基平板上(圖1d)，背面黃綠色或金黃色(圖1e)，孢子聚生成頭狀。瓶梗細胞單生或2～5個輪生。分生孢子橢球形，長2.0～4.0μm，寬2.5～3.8μm，壁光滑(圖1f)，初步鑒定為木霉屬Trichoderma真菌。

2.2 菌株的分子學鑒定

菌株A 1和B1的ITS片段長度分別為594和652 bp，GenBank 登錄號分別為MH 937578.1和MH 937579.1。序列經(jīng)BLAST比對分析，用MEGA 6.0中的UPGMA 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖2a 可知，在親緣關系上，A1與登錄號為JF 412785.1、HQ 340102.1、AY 373859.1、MG 662404.1的寄生曲霉聚為一支，序列相似性為99%，故將其鑒定為寄生曲霉Aspergillus parasiticus。由圖2b可知，在親緣關系上，B1與登錄號為KU 375460.1的長枝木霉親緣關系最近，序列相似性為99%，故將其鑒定為長枝木霉Trichodermalongilbrachiatum。

圖2 菌株A1和B1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic trees of strain A 1 and B1

2.3 生防菌對孢囊的寄生作用

從圖3可以看出，菌株A1和B1對禾谷孢囊的寄生率隨侵染時間的增加呈直線上升趨勢。在處理后第6天，菌株A 1和B 1的寄生率均在24.00%以上。在處理后第10天，菌株A 1和B1的寄生率均在45.00%以上。菌株A1和B1寄生率上升幅度相近，均在第14天達到80.00%以上，寄生率分別是90.00%和83.33%。菌株A 1在6～14 d，寄生率均略高于B1。

圖3 不同浸染時間A1、B1分生孢子懸浮液對禾谷孢囊線蟲的寄生率Fig.3 Parasitic rates of A1 and B1 conidia suspensions to cereal cyst nematode at different time of infection

2.4 生防菌發(fā)酵液對線蟲卵孵化的抑制作用

A 1、B1真菌1倍、5倍、10倍稀釋發(fā)酵液對卵孵化抑制作用測定結果表明，A1和B1各稀釋倍數(shù)發(fā)酵液對卵孵化抑制率均在45.00%以上。隨著發(fā)酵液稀釋倍數(shù)增加，J2孵化數(shù)量呈逐漸增加的趨勢。從圖4可知，發(fā)酵液濃度對卵孵化有顯著影響(P＜0.01，F(xiàn)=9.71)。發(fā)酵液處理12 d后，A1的1倍發(fā)酵液對卵孵化的抑制率為63.98%，1倍和5倍稀釋液對卵的抑制率差異不顯著(P＞0.05)，但均顯著高于10倍(P＜0.05)(圖4a)。B1的1倍發(fā)酵液對卵孵化的抑制率為67.56%，且顯著高于5倍、10倍稀釋液(P＜0.05)(圖4b)。

2.5 生防菌發(fā)酵液對J2的致死作用

隨著A1、B1真菌發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的增加，2齡幼蟲的死亡率總體呈減小的趨勢。隨著處理時間的延長，同一濃度發(fā)酵液的校正死亡率呈顯著增強趨勢，具體結果見表1。

圖4 真菌發(fā)酵液對禾谷孢囊線蟲卵孵化的影響Fig.4 Effectsof fungal fermentation broth on egg hatching of cereal cyst nematode

表1 真菌發(fā)酵液對禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲的致死作用Table 1 Lethal effectsof fungal fermentation broth on the second-stage juveniles of cereal cyst nematode

經(jīng)菌株A1和B1的發(fā)酵液處理后，死亡線蟲數(shù)顯著多于對照組(P＜0.05)，說明這3種發(fā)酵液均對線蟲有致死作用。菌株A1發(fā)酵液處理24、48、72 h后線蟲校正死亡率為16.00%以上，A1的1倍稀釋液在7 2 h 對2齡幼蟲的校正死亡率較高為68.14%。菌株B1發(fā)酵液處理24、48、72 h 后線蟲校正死亡率為35.00%以上，B1的1倍稀釋液在72 h對2齡幼蟲的校正死亡率最高為92.98%，顯著高于5倍、10倍（P＜0.05）。在相同處理時間和發(fā)酵液稀釋倍數(shù)下，菌株B1 校正死亡率均大幅高于菌株A1。

2.6 生防菌菌肥室內(nèi)防治禾谷孢囊線蟲的效果

室內(nèi)盆栽試驗表明，隨著生防菌菌肥量的增大，孢囊減少率持續(xù)增多。由表2可知，A 1的3%菌肥處理后，孢囊減少率為31.71%，顯著高于1%和2%菌肥處理(P＜0.05)。小麥根長增加28.82%，株高增加20.38%。B1的3%菌肥處理后，孢囊減少率36.04%，顯著高于1%和2%菌肥處理(P＜0.05)。小麥根長增加59.62%，株高增加21.43%。

表2 真菌對禾谷孢囊線蟲病室內(nèi)防治效果測定Table 2 Control efficienciesof the fungi on cereal cyst nematode in indoor pots

3 討論與結論

寄生曲霉屬于半知菌亞門絲孢菌綱絲孢目從梗孢科[22]，其廣泛存在于土壤、灰塵和植物上。目前研究集中于寄生曲霉的種類鑒定和對甘蔗綿蚜、吹綿蚧等害蟲的生物防治方面[23-25]，鮮見寄生曲霉對其他植物寄生線蟲有生防作用的報道。長枝木霉生長速度快、產(chǎn)孢量大、對植物病原菌有一定的拮抗作用，可作為農(nóng)業(yè)上重要的生防菌株[25]，目前研究集中于其對南方根結線蟲的防治及其根際定殖作用[26]、對禾谷孢囊線蟲的寄生和致死作用[27]，但長枝木霉對禾谷孢囊線蟲的盆栽防效試驗的報道甚少。

生物農(nóng)藥源于自然，具有作用譜廣、對生態(tài)環(huán)境影響小、對人畜低毒等特點[28-29]，篩選細菌、真菌等微生物來防治植物病原線蟲，對生態(tài)環(huán)境保護具有重要的意義。本研究篩選的具有殺線蟲活性的菌株A1 和B1，經(jīng)鑒定分別為寄生曲霉Aspergillus parasiticus和長枝木霉Trichodermalongibrachiatum，均對禾谷孢囊具有良好的寄生性，分別在第6天、第10天后，寄生率超過50.00%，侵染2周左右禾谷孢囊寄生率達80.00%以上，這與遲君道等[30]報道的結果基本一致。

卵孵化試驗中，隨著菌株A1和B1發(fā)酵液稀釋濃度的增大，這2 株菌的卵孵化率相應增大。菌株A1和B1的1倍稀釋液pH 分別為4.27和5.72，菌株A1和B1的1倍稀釋液抑制卵孵化效果均好于5倍和10倍稀釋液。這可能與發(fā)酵液pH 有關，pH 可影響發(fā)酵液中殺線蟲物質(zhì)的活性，還可以直接影響卵的孵化[31]。

菌株A 1和B1不同濃度發(fā)酵液對禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲具有一定的毒殺作用，隨著菌株發(fā)酵液濃度的升高，2齡幼蟲死亡率也相應增高，并且隨著處理時間的延長呈上升趨勢。該結果和梁晨等[32]報道的研究結果基本一致。發(fā)酵液對線蟲作用的效果與殺線蟲活性物質(zhì)成分的濃度和線蟲裸露程度有關，呈現(xiàn)出濃度越低、線蟲死亡率越低的規(guī)律[33]。趙迪[34]發(fā)現(xiàn)菌株Snef 5的殺線蟲活性物質(zhì)是一種強極性、弱酸性的水溶性抗生素。李玲玉等[35]發(fā)現(xiàn)放線菌Snea253代謝產(chǎn)物中氨基糖類物質(zhì)對線蟲有毒性。Niu 等[36]從細菌Bacillusnematocidal中分離純化出對線蟲有毒性作用的絲氨酸蛋白酶，能夠很大程度上破壞線蟲表皮并水解膠原蛋白和凝膠，從而使線蟲死亡。劉霆等[37]研究發(fā)現(xiàn)，真菌Snf 907代謝物，在原液、5×、10×、20×稀釋濃度下，對大豆孢囊線蟲2齡幼蟲的校正死亡率分別是96.33%、83.18%、63.15%和47.04%，這與本試驗結果A 1和B1在發(fā)酵液原液處理下，對2齡幼蟲最高的校正死亡率分別為68.14%和92.98%相比存在差異。這可能與菌株種類、產(chǎn)生的活性物質(zhì)類型、作用對象、對線蟲的作用機理有關[37]。各類真菌的代謝產(chǎn)物不同，殺線蟲的活性物質(zhì)也不相同，不同的孢囊線蟲寄生真菌有其獨特作用機理[38]。

盆栽試驗結果表明，菌株A 1、B1的生物菌肥均能顯著減少土壤中的禾谷孢囊線蟲的孢囊數(shù)量，對小麥植株根長和株高有不同程度的影響。2種菌肥可使小麥株高增加、根長增長。適量菌肥處理可顯著促進小麥根的生長，與對照相比，2種真菌3%(w)處理組小麥根長均增加3 cm 以上。除B1 1%(w)菌肥處理除外，不同濃度的2種菌肥均有效促進了小麥株高增加，這與Zhang 等[20]的研究結果一致，但本試驗中2株生防菌3%(w)菌肥處理后的孢囊減少率低于其6%(w)的菌劑處理，可能是由于生物菌肥中加入的生物菌種和劑量不同所致。

本研究表明菌株A1和B1在防治禾谷孢囊線蟲上有較好的應用前景，且B1的生防效果略優(yōu)于A1。對于這2株生防菌的殺線蟲活性物質(zhì)成分、對線蟲的作用機理等有待進一步深入的研究。