三氧化二砷聯(lián)合丹參酮對肝癌的作用效果與機制研究

廖廣輝張廣順樓招歡程汝濱張光霽

1.浙江中醫(yī)藥大學藥學院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院

原發(fā)性肝癌位居全球常見惡性腫瘤發(fā)病第5位，占惡性腫瘤相關死因的第2位[1]。2015年中國癌癥統(tǒng)計數據顯示，我國新發(fā)腫瘤病例為429.2萬例，死亡病例為281.4萬例，其中肝癌新發(fā)46.61萬例（列第4位），死亡42.21萬例（列第3位），因此，肝癌已成為當前我國面臨的一個嚴峻的公共健康問題[2]。

化療是中晚期肝癌的主要治療手段，但現(xiàn)有化療方案存在療效差、不良反應重等問題。 三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）是中藥砒霜的主要成分，臨床已用于復發(fā)急性早幼粒細胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）的治療。盡管低劑量的As2O3已在2004年被國家藥品監(jiān)督管理局批準用于治療中晚期肝癌，但單獨使用低劑量As2O3治療肝癌效果有限[3]。一些學者將低劑量的As2O3與冬凌草素、染料木素等藥物聯(lián)合使用，顯示出了一定的抗肝癌效果[4-5]。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的As2O3可以抑制肝癌移植瘤的生長，但對血液系統(tǒng)的影響較大，As2O3與丹參的有效成分隱丹參酮配伍后，在降低As2O3使用劑量的同時，同樣可以顯著抑制肝癌裸鼠移植瘤的生長，而且能夠減輕對血液系統(tǒng)的影響[6]。進一步探討As2O3-丹參酮體外抗腫瘤的作用機制發(fā)現(xiàn)，As2O3-丹參酮作用于肝癌bel-7404細胞具有協(xié)同增效作用，其協(xié)同機制可能與線粒體途徑和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路有關。本文擬重點研究As2O3-丹參酮抗肝癌裸鼠移植瘤的作用效果，以期為As2O3-丹參酮抗肝癌的臨床應用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 As2O3注射液購于北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司（規(guī)格：10mg/支，批號：20130503）；丹參酮膠囊購于河北興隆希力藥業(yè)有限公司（規(guī)格：0.25g/粒，批號：20130610），使用時將丹參酮膠囊粉末進一步研磨，以0.9%氯化鈉溶液溶解，加少許吐溫80助溶，終濃度為50mg·mL-1，臨用前充分混懸。靶向聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）、Bax、X 連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）抗體均購于 Cell Signaling Technology 公司（批號：9532、2774、2042）；β-肌動蛋白（β-actin）抗體購于Sigma-Aldrich公司（批號：A1978）。

1.2 細胞株與實驗動物 人Bel-7404肝癌細胞由浙江省中醫(yī)院中心實驗室提供。5周齡SPF級雄性BALB/C-nu裸鼠40只，體質量18～20g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司 [實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2008-0016]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級小鼠飼養(yǎng)室 [實驗動物使用許可證：SYXK（浙）2008-0115]。

1.3 實驗設備 全自動血液細胞分析儀購于拜耳醫(yī)藥保健公司；7020全自動生化分析儀為日立公司產品；STP120脫水機、AP280-2包埋機、HM335E切片機均購于德國Microm公司；Nikon eclipse 80i顯微鏡購于日本Nikon公司；DRP-9052型電熱恒溫箱為上海森信實驗儀器有限公司產品。

1.4 方法

1.4.1 裸鼠人肝癌細胞移植瘤模型的建立及分組人肝癌細胞Bel-7404常規(guī)培養(yǎng)至對數生長期，消化制成5×106個/mL的細胞懸液，將0.2mL細胞懸液皮下注射接種于BALB/C-nu裸鼠右側背部近前腋處皮下。待移植瘤生長至體積100mm3左右，將裸鼠隨機分為5組，模型對照組、As2O3單用組（As2O3低劑量組，2.5mg/kg）、陽性對照組（As2O3高劑量組，5.0mg/kg）、丹參酮單用組 （500mg/kg）、As2O3-丹參酮組（As2O32.5mg/kg+丹參酮500mg/kg），每組8只。各組腹腔注射給藥，1次/d，共19d，藥物劑量依據前期實驗確定。實驗期間密切觀察和記錄各組動物體質量、攝食量、活動和精神狀態(tài)的變化情況。每隔3d測量瘤體體積，并繪制腫瘤生長曲線，腫瘤體積計算公式如下：V=a×b2×π/6（V：腫瘤近似體積；a：瘤體長徑；b：瘤體短徑）。最后1次給藥后1d，各組裸鼠摘眼球處死，收集外周血標本，分離瘤塊，稱量質量并計算腫瘤抑制率，計算公式如下：腫瘤抑制率（%）=（模型對照組平均瘤塊質量-各治療組平均瘤塊質量）/模型對照組平均瘤塊質量×100%。將腫瘤組織分為兩部分，一部分以10%甲醛溶液固定，一部分液氮保存。

1.4.2 原位末端轉移酶標記（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）法檢測瘤體組織細胞凋亡10%甲醛溶液固定的瘤體標本經脫水、石蠟包埋并切片，玻片經預處理后，各組中加入TUNEL反應混合液50μL，陰性對照加入熒光素標記的dUTP液50μL，37℃濕盒中避光反應1h，PBS漂洗3次；待玻片干燥后再加入過氧化物酶（peroxidase，POD）轉化劑 50μL，蘇木素復染，顯微鏡下觀察，每張切片隨機選擇3～5個高倍視野拍照。應用Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖像，分析細胞凋亡情況并計算每張照片細胞凋亡率，細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.4.3 免疫組化檢測凋亡相關蛋白表達 切片置60℃烤箱烘烤2h，脫蠟至水，蒸餾水洗2min，高壓熱修復2min，自來水冷卻，3%H2O2溶液阻斷10min；PBS洗滌3次后分別滴加一抗，模型對照組以PBS代替，37℃孵育60min后以PBS洗滌并滴加二抗，37℃孵育 60min，洗滌后 DAB 顯色 5～10min，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡拍照。鏡下每張切片隨機選擇3～5個高倍視野拍照，應用Carl Zeiss Imaging Systems圖像分析軟件分析圖像，計算各切片的光密度值并取平均值，以此評價凋亡相關蛋白的表達水平。

1.4.4 Wester blot檢測凋亡相關蛋白表達 取少許腫瘤組織在液氮環(huán)境下充分碾磨，加入100μL細胞裂解液，冰上裂解30min。4℃下12 000r/min離心15min，收集上清液。蛋白定量后各組取總蛋白50mg，電泳后轉膜，脫脂牛奶封閉1h，1:1 000一抗稀釋液孵育，4℃過夜。TBST洗膜3次，再與相應的辣根過氧化物酶標記的二抗（稀釋比例1:1 000）室溫孵育2h，TBST洗膜3次，過氧化物酶法顯色，凝膠纖維攝像系統(tǒng)拍照并處理圖像。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組裸鼠移植瘤生長情況比較 生長曲線表明，隨著給藥時間延長，As2O3單用組、丹參酮單用組、As2O3-丹參酮組以及陽性對照組均表現(xiàn)出明顯的抑瘤作用。與模型對照組比較，給藥19d后As2O3單用組、丹參酮單用組、As2O3-丹參酮組以及陽性對照組瘤體體積明顯縮小（P＜0.01）；與陽性對照組比較，As2O3-丹參酮組的抑瘤效果更顯著（P＜0.05）。見圖1、2。與模型對照組比較，給藥19d后As2O3單用組、陽性對照組、丹參酮單用組及As2O3-丹參酮組平均瘤塊質量顯著降低（P＜0.01）。見圖3。

圖1 各組裸鼠移植瘤生長曲線比較Fig.1 Comparison of growth curves of transplanted tumors in each group

圖2 各組裸鼠移植瘤體體積比較Fig.2 Comparison of the size of transplanted tumors in each group

2.2 各組裸鼠血常規(guī)指標比較 與模型對照組比較，As2O3單用組、陽性對照組、As2O3-丹參酮組白細胞（white blood cell，WBC）計數均上調，其中 As2O3單用組WBC計數差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與陽性對照組比較，As2O3-丹參酮組WBC計數上調，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型對照組比較，As2O3單用組、陽性對照組紅細胞（red blood cell，RBC）計數顯著下調（P＜0.05，P＜0.01）；與陽性對照組比較，As2O3-丹參酮組RBC計數上調，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型對照組比較，各治療組血紅蛋白（hemoglobin，HGB）水平均下調，其中陽性對照組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與陽性對照組比較，As2O3-丹參酮組HGB水平上調，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型對照組比較，As2O3單用組、陽性對照組、As2O3-丹參酮組血小板（platelet，PLT）計數均上調，其中As2O3單用組和陽性對照組PLT計數差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與陽性對照組比較，As2O3-丹參酮組PLT計數下調，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 1。

圖3 各組裸鼠移植瘤瘤塊質量比較Fig.3 Comparison of the mass of transplanted tumors in each group

表1 各組裸鼠血常規(guī)指標比較（±s）Tab.1 Comparison of blood routine indexes in each group(±s)

表1 各組裸鼠血常規(guī)指標比較（±s）Tab.1 Comparison of blood routine indexes in each group(±s)

注：與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01Note:Compared with model control group,*P＜0.05,**P＜0.01

組別 WBC（×109/L） RBC（×1012/L） HGB（g·L-1） PLT（×109/L）模型對照組As2O3單用組陽性對照組丹參酮單用組As2O3-丹參酮組4.26±0.72 5.60±0.73*4.48±0.96 4.12±0.77 5.12±0.96 9.69±0.51 8.83±0.67*8.49±0.61**9.66±0.55 9.20±0.75 146.50±7.04 131.50±10.52 129.00±8.63**142.20±7.74 134.67±11.37 1 185.40±197.62 1 636.40±206.00**1 645.80±212.74**1 173.20±196.03 1 559.30±222.27

2.3 各組裸鼠肝腎功能比較 與模型對照組比較，As2O3單用組、陽性對照組與As2O3-丹參酮組丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）水平上調，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與陽性對照組比較，丹參酮單用組ALT水平下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型對照組比較，各治療組中天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平均下調，其中丹參酮單用組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與陽性對照組比較，As2O3-丹參酮組AST水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型對照組比較，各治療組中尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平下調，其中丹參酮單用組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與陽性對照組比較，As2O3-丹參酮組BUN水平上調，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型對照組比較，各治療組肌酐（creatinine，CREA）水平均下調，其中陽性對照組、丹參酮單用組和As2O3-丹參酮組CREA水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；與陽性對照組比較，As2O3-丹參酮組CREA水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 2。

2.4 各組裸鼠腫瘤組織細胞凋亡情況比較 與模型對照組比較，各治療組凋亡率均明顯上調，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）；與陽性對照組比較，As2O3-丹參酮組凋亡率顯著上調（P＜0.01）。見表3、圖4。

表2 各組裸鼠肝腎功能比較（±s）Tab.2 Comparison of liver and kidney function in each group(±s)

表2 各組裸鼠肝腎功能比較（±s）Tab.2 Comparison of liver and kidney function in each group(±s)

注：與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性對照組比較，#P＜0.05Note:Compared with model control group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with positive control group,#P＜0.05

組別 ALT（U·L-1） AST（U·L-1） BUN（mmol·L-1） CREA（μmol·L-1）模型對照組As2O3單用組陽性對照組丹參酮單用組As2O3-丹參酮組48.00±5.60 54.50±13.70 62.30±9.90 45.00±10.30#60.10±9.10 186.90±36.20 163.50±22.60 157.30±23.90 132.00±21.30**158.40±29.00 9.70±0.90 8.70±1.10 8.50±0.70 8.10±1.30*9.50±0.90 38.70±1.60 36.10±2.10 34.90±1.80*34.30±3.10**35.10±2.40*

2.5 各組裸鼠腫瘤組織凋亡相關蛋白表達比較 與模型對照組比較，各治療組Bax表達明顯上調（P＜0.05，P＜0.01）；與陽性對照組比較，As2O3-丹參酮組Bax表達顯著上調（P＜0.01）。與模型對照組比較，各治療組XIAP表達均明顯下調（P＜0.01）；與陽性對照組比較，As2O3-丹參酮組XIAP表達下調，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型對照組比較，各治療組PARP表達均明顯上調（P＜0.01）；與陽性對照組比較，As2O3-丹參酮組表達上調，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 4、圖 4。

表3 各組腫瘤組織細胞凋亡率比較（±s，%）Tab.3 Comparison of apoptotic rate of tumor tissue in each group(±s，%)

表3 各組腫瘤組織細胞凋亡率比較（±s，%）Tab.3 Comparison of apoptotic rate of tumor tissue in each group(±s，%)

注：與模型對照組比較，**P＜0.01；與陽性對照組比較，##P＜0.01Note:Compared with model control group,**P＜0.01;compared with positive control group,##P＜0.01

組別細胞凋亡率模型對照組As2O3單用組陽性對照組丹參酮單用組As2O3-丹參酮組6.20±1.43 9.70±1.37**20.96±2.29**15.90±1.60**28.99±2.70**##

2.6 各組裸鼠腫瘤組織凋亡相關蛋白表達比較 與模型對照組比較，陽性對照組、丹參酮單用組、As2O3-丹參酮組Bax表達顯著上調（P＜0.01）；與陽性對照組比較，As2O3-丹參酮組Bax表達顯著上調（P＜0.01）。與模型對照組比較，丹參酮單用組、As2O3-丹參酮組PARP 表達顯著上調（P＜0.01）,As2O3單用組、陽性對照組的表達顯著下調（P＜0.01）；與陽性對照組比較，As2O3-丹參酮組PARP表達顯著上調（P＜0.01）。與模型對照組比較，陽性對照組、丹參酮單用組、As2O3-丹參酮組XIAP表達顯著下調（P＜0.01）；與陽性對照組比較，As2O3-丹參酮組XIAP表達略上調，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖 5、6。

表4 各組荷瘤裸鼠凋亡相關蛋白平均光密度比較（±s）Tab.4 Comparison of the average light density of apoptosis related proteins in each group(±s)

表4 各組荷瘤裸鼠凋亡相關蛋白平均光密度比較（±s）Tab.4 Comparison of the average light density of apoptosis related proteins in each group(±s)

注：與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性對照組比較，##P＜0.01Note:Compared with model control group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with positive control group,##P＜0.01

組別 Bax XIAP PARP模型對照組As2O3單用組陽性對照組丹參酮單用組As2O3-丹參酮組10 166.74±825.25 12 534.34±908.08*22 352.32±4 455.98**13 197.63±1 306.98**56 327.49±7 421.58**##94 168.29±9 725.90 34 876.81±3 573.01**19 489.98±1 770.76**27 166.1±2 475.08**16 902.18±3 357.86**11 151.59±5 654.98 21 622.82±1 580.706**39 165.82±6 423.24**29 750.98±2 826.14**52 586.68±7 209.59**

圖5 Western blot檢測各組腫瘤組織中Bax、PARP、XIAP的表達Fig.5 Expression of Bax,PARP,XIAP in tumor tissue detected by Western blot in each group

圖6 各組腫瘤組織中Bax、PARP、XIAP表達比較Fig.6 Comparison of expression of Bax,PARP and XIAP in each group

3 討論

中醫(yī)藥在肝癌治療中有其獨特的優(yōu)勢，臨床實踐證明，中醫(yī)藥治療可延長肝癌患者的生存期，改善患者的生存質量，中藥與放、化療聯(lián)合應用可發(fā)揮增效減毒的作用[7]。在臨床上，順鉑和5-氟尿嘧啶等作為一線化療藥物被廣泛用于肝癌、卵巢癌和非小細胞肺癌等惡性腫瘤的治療，然而其發(fā)揮治療作用的同時，也會損傷正常組織，最常見的不良反應為骨髓抑制、胃腸道反應，還有部分化療藥物可導致神經毒性、肝腎功能損傷等[8-9]。

As2O3是中藥砒霜的主要有效成分，在2004年已被批準用于中晚期肝癌的治療，但是其治療劑量要求較高，不良反應亦明顯增加[10]。丹參味苦，性微寒，歸心、肝經，具有活血化瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰等功效，作為活血化瘀中藥常用于腫瘤轉移的臨床治療[11-12]。丹參酮為丹參的乙醇提取物，包括隱丹參酮、異隱丹參酮等成分，具有抗菌消炎等功效。研究發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮聯(lián)合腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、順鉑、依托泊苷等能夠增強抗癌效果[13]。本研究構建了裸鼠肝癌移植瘤模型，將高劑量的As2O3設置為陽性對照組，考察As2O3聯(lián)合丹參酮抗裸鼠移植瘤的效果，以期能夠降低As2O3的使用劑量并提高其臨床療效。結果發(fā)現(xiàn)隨著給藥時間的延長，As2O3單用組、丹參酮單用組、As2O3-丹參酮組以及陽性對照組均具有抑瘤作用，且與兩個單藥組比較，As2O3-丹參酮組的抑瘤效果更顯著，證實As2O3-丹參酮聯(lián)用較As2O3或丹參酮單用具有更好的抗肝癌效果。

As2O3的毒性作用主要由環(huán)境中慢性暴露或臨床應用引起，可累及全身各個臟器，主要表現(xiàn)為心臟毒性、肝腎損傷、高白細胞血癥、分化綜合征等[14]。本研究初步檢測了As2O3-丹參酮對血常規(guī)相關指標的影響，發(fā)現(xiàn)As2O3能夠上調 WBC、PLT計數，下調RBC計數和HGB水平，但量效關系尚不確切，證實As2O3對血液系統(tǒng)具有一定的損傷作用，而丹參酮單用對相關的血常規(guī)指標沒有明顯影響，丹參酮聯(lián)合As2O3則可以一定程度緩解As2O3對血液系統(tǒng)的損傷，表現(xiàn)出了一定的保護作用。

ALT、AST是反映肝臟功能的血清酶學相關指標。目前研究顯示，ALT主要存在于細胞質內，當肝損傷較輕僅使細胞膜的通透性增加時，就會導致ALT大量釋放入血中，此時以ALT升高為主，因此ALT是肝臟損傷的最敏感指標[15]；而AST同時存在于肝細胞細胞質和線粒體中，并以線粒體中為主，當肝損傷較重，傷及線粒體時則血清中AST水平明顯升高[16]。本研究表明，As2O3能夠上調ALT的水平，下調AST的水平，但與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義，提示As2O3對荷瘤裸鼠肝功能造成了一定的影響，但程度并不嚴重。與As2O3單獨使用比較，丹參酮聯(lián)合As2O3能夠一定程度上減輕肝損傷。

血清中BUN和CREA的水平反映了腎小球的濾過功能，是腎臟生理功能的重要反映指標。若血清中BUN和CREA水平增高，則表明腎功能可能受損[17]。本研究中，與模型對照組比較，各治療組的BUN、CREA水平均偏低，其中丹參酮-As2O3組BUN、CREA水平略低于模型對照組，提示丹參酮聯(lián)合As2O3并未對腎臟造成明顯的不良反應。遺憾的是，在本研究設計時并未設置空白對照組，因此缺少模型對照組及各治療組與正常小鼠比較的相關數據，有待于在以后的研究中進一步完善實驗設計，使研究結果更加充實。

目前研究發(fā)現(xiàn)，As2O3抗肝癌的主要機制有誘導肝癌細胞凋亡、抑制肝癌細胞增殖和侵襲、抑制血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的生成等[18]。細胞凋亡為細胞的程序性死亡方式，TUNEL法是廣泛應用于石蠟組織切片細胞凋亡的檢測方法之一[19]。本研究采用TUNEL法檢測各組腫瘤組織的凋亡情況，結果提示As2O3或丹參酮均能夠誘導肝癌細胞凋亡，且As2O3-丹參酮組凋亡率顯著高于As2O3或丹參酮單用組。

細胞凋亡的發(fā)生發(fā)展受多種基因調控，其中Bcl-2基因家族在細胞凋亡調節(jié)過程中起著重要作用，Bax則是細胞凋亡的促進基因，當Bax表達水平較高時，形成Bax-Bax同源二聚體，轉位到線粒體膜，改變線粒體膜的通透性，促使細胞色素C釋放入細胞質，啟動含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）級聯(lián)反應，從而導致細胞凋亡[20]。caspase-3最主要的底物是PARP，該酶與DNA修復、基因完整性保護有關[21]。XIAP作為凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein,IAP）家族中作用最強的蛋白，通過干擾caspase的活性，從而抑制細胞凋亡[22]。免疫組化和Western blot檢測凋亡相關蛋白Bax、PARP、XIAP的表達均發(fā)現(xiàn)，As2O3-丹參酮聯(lián)用能夠下調抗凋亡蛋白XIAP的表達，上調促凋亡蛋白Bax、PARP的表達。這些結果初步表明，As2O3-丹參酮聯(lián)用能通過調控凋亡相關蛋白誘導肝癌細胞凋亡，進而發(fā)揮抗癌作用。然而，細胞凋亡的調控機制錯綜復雜，影響凋亡的信號通路亦有很多，As2O3-丹參酮聯(lián)用誘導肝癌細胞凋亡的具體靶點值得進一步探索。

總之，本研究首次在裸鼠體內證明了As2O3-丹參酮聯(lián)用具有協(xié)同增效、減毒的抗肝癌效果，誘導肝癌細胞凋亡并減低對血常規(guī)和肝腎功能的影響是其作用機制之一。本研究的結果為建立As2O3-丹參酮聯(lián)用治療肝癌的臨床方案提供了實驗依據。