脂多糖誘導肺炎動物模型的研究進展

唐思璇，肖芳

(中南大學湘雅公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生毒理學系，長沙 410078)

肺炎(pneumonia)是指終末氣道、肺泡和肺間質(zhì)的炎癥，可由病原微生物、免疫損傷、理化因素、過敏及藥物等因素所致，主要臨床癥狀為發(fā)熱、咳嗽、咳痰，部分可發(fā)展為重型肺炎出現(xiàn)循環(huán)、呼吸衰竭而危及生命。細菌性肺炎是最常見的肺炎，也是最常見的感染性疾病之一。在抗菌藥物應(yīng)用之前，肺炎對健康的危害極大，抗菌藥物的普遍應(yīng)用后肺炎的病死率一度呈下降趨勢。但近年來，盡管強力抗菌藥物不斷被研發(fā)并應(yīng)用于臨床，肺炎的病死率非但無明顯下降反而有所上升，目前其發(fā)病率、病死率及疾病負擔仍保持在較高水平[1]。目前在老齡、幼齡和免疫力低下的人群中肺炎仍有很高的發(fā)病率和病死率，給社會及家庭帶來沉重的疾病負擔[2]。因此肺炎的發(fā)病機制、影響因素、預防措施及治療方案一直是醫(yī)學研究領(lǐng)域的熱點問題。為了更好的了解肺炎發(fā)病機制、全面了解疾病全過程、考察藥物的預防和治療效果，在實驗研究過程中建立穩(wěn)定、便捷、重復性強、接近人類臨床感染情況的肺炎動物模型則至關(guān)重要。

肺炎動物模型根據(jù)肺炎病原學可分為細菌性、真菌性、病毒性、衣原體支原體性、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導性、化學誘導性等多種類型，其中使用細菌建模的方法較常用。通常將細菌懸液使用不同的途徑感染肺部，其與細菌感染所致肺炎相似，但操作較復雜，配置懸液時易引入雜菌影響實驗結(jié)果。LPS是革蘭氏陰性(G-)細菌細胞壁中的一種成分，是G-細菌的主要致病因子之一，由Q-抗原、核心多糖、類脂A構(gòu)成，其中類脂A是LPS主要的毒性中心和生物活性部分，高度保守且無種屬特異性，故不同菌種感染后產(chǎn)生的LPS毒性作用大致相同[3]。LPS在機體內(nèi)可誘發(fā)炎癥細胞浸潤、炎癥因子釋放[4]，引起的炎癥損傷與G-菌真實感染相似，最初用于構(gòu)建急性肺損傷的動物模型[5]，后逐漸用于建立肺炎動物模型。然而，在建立肺炎模型過程中，LPS的誘導劑量和給藥途徑通常差異較大。故本文作者從CNKI、Web of Science及PubMed檢索近年來利用LPS誘導肺炎模型的相關(guān)文獻，從動物品種選擇、造模方法及劑量、評價指標等多種角度進行比較，以期找到穩(wěn)定、高效、易操作的脂多糖肺炎模型，為肺炎發(fā)病機制的研究提供可靠的實驗依據(jù)和理論參考。

1 動物品系及性別選擇

LPS誘導的肺炎模型常選用嚙齒動物，其中大鼠常用的品系有Sprague Dawley和Wistar，小鼠常用的品系有C57BL/6和BALB/c。需要注意的是，人與大鼠、小鼠的巨噬細胞的分布有所不同，大鼠、小鼠缺少肺泡巨噬細胞，其巨噬細胞主要存在于肝和脾，故全身給藥后，血液中的LPS多在肝、脾中沉積[6]；而有肺泡巨噬細胞的物種(如人)，較少量LPS即可引起明顯的肺部炎癥反應(yīng)和肺損傷[7]。除此之外，選擇動物時還應(yīng)考慮其體型的大小，小鼠體型過小，測量一些生理參數(shù)(如動脈分壓)受到限制，采集到的標本量也遠不及大鼠，可能無法滿足較多的研究指標檢測。在性別選擇方面大多數(shù)研究選擇雄性動物作為實驗對象，分析其原因可能為雄性動物較雌性動物體內(nèi)激素水平更為穩(wěn)定，對實驗干擾更小。袁偉鋒等[8]在研究中使用了雌雄各半的BALB/c小鼠，但結(jié)果中未比較雌雄動物間的炎癥反應(yīng)是否存在差異。有研究指出，同物種不同品系間的動物對于LPS的敏感性也有差異，BALB/c小鼠對LPS較C57BL/6小鼠更敏感[6]，但目前尚無LPS所致肺炎模型在不同品系或不同性別動物間的比較研究，故何種動物最適合用于構(gòu)建LPS所致的肺炎模型還需要進一步證實。

2 造模方法的選擇

使用LPS建立肺炎動物模型，常見的給藥途徑有：全身給藥法[9-11]、氣管內(nèi)給藥法[11-14]、吸入法[15-19]以及霧化法[20-22]等。

2.1 全身給藥法

全身給藥法包括腹腔注射法和尾靜脈注射法。腹腔注射法[8，10-11]是將LPS溶液注射進腹膜內(nèi)；尾靜脈注射法[9]是將LPS溶液注射進尾靜脈，尾靜脈注射建模多使用大鼠。兩種方法均是通過LPS作用于免疫系統(tǒng)引起全身免疫反應(yīng)，而肺易受炎癥損傷從而達到建模的目的。全身給藥法在早期的肺炎建模中常用，但由于其誘發(fā)全身免疫反應(yīng)較重，現(xiàn)也常用于建立急性呼吸窘迫綜合癥及膿毒癥模型。

2.2 氣管內(nèi)給藥法

氣管內(nèi)給藥法又分為頸部皮膚切開后氣管注射法和經(jīng)口氣管內(nèi)給藥法。Conti等[13]用異氟醚麻醉小鼠后固定，頸部備皮后切開皮膚暴露氣管，使用1 mL注射器向管腔內(nèi)注射LPS溶液，術(shù)后消毒并縫合傷口。Brown等[12]使用經(jīng)口可視化氣管滴注法，將小鼠用氯胺酮麻醉后，用線將門齒固定在一傾斜60°的木板上，打開口腔并拉出舌頭，將LPS溶液通過插管滴入氣道。大鼠經(jīng)口氣管滴注較好操作，小鼠較難操作，操作不當易導致實驗失敗，在Su等[23]的文章中使用一種透射冷光源照射聲門后直視氣管的灌注方法，并研究了插管深度與溶液進入肺部部位的關(guān)系，導管插入深度為12～14 mm液體分布至雙肺，插入深度為15～17 mm時，則多數(shù)分布在單肺；楊彪等[24]將此方法進行了優(yōu)化，并在文章中對操作過程進行了詳細描述。

2.3 吸入法

吸入法主要包括口咽吸入法和經(jīng)鼻吸入法(滴鼻法)?？谘饰敕╗15-16]是將動物麻醉后置于傾斜的平板上打開口腔并牽拉舌，將LPS溶液滴于咽后壁并馬上捏住鼻子，待動物將藥物吸入肺部后松開鼻子。滴鼻法[17-19]是將動物麻醉后，吸取LPS溶液滴入2個鼻腔中，并迅速捏住鼻孔，維持20～30 s，待液體全部吸入鼻腔即可。

2.4 霧化法

霧化法需使用專用的暴露塔給藥，動物不需進行麻醉，直接放入暴露塔中在清醒平靜狀態(tài)下吸入含有LPS的空氣[20-22]。不同于其他方法，霧化法通常需要多次給藥。由于需要專用的設(shè)備，使用該方法的研究較少。

2.5 不同方法間的優(yōu)缺點比較

袁偉鋒等[8]研究發(fā)現(xiàn)，氣管滴入LPS后以肺組織破壞為主，表現(xiàn)為病理損傷顯著而腫水腫相對較輕；腹腔注射LPS引起肺局部組織破壞較輕，腫水腫程度則比較顯著。有研究認為腹腔注射法和尾靜脈注射法不能很好的模擬肺炎發(fā)病過程，與肺部局部用藥相比同樣劑量下引起的肺部炎癥反應(yīng)較輕[11]，且容易引起全身炎癥反應(yīng)，若劑量過大易發(fā)生實驗動物的死亡，因此研究人員多選擇肺部局部給予LPS建立模型。張亞平等[20]在研究中比較發(fā)現(xiàn)滴鼻法大鼠肺組織炎癥較輕，肺部病理變化組內(nèi)差異較大，氣管滴入法和口咽吸入法肺組織炎癥較重；霧化吸入法大鼠炎癥表現(xiàn)為中度，組內(nèi)各實驗動物肺部炎癥損傷程度一致，病理變化表現(xiàn)穩(wěn)定，組內(nèi)差異小。在Su等[23]研究中發(fā)現(xiàn)，比起氣管內(nèi)滴注，滴鼻法進入肺部的溶液明顯較少，溶液同樣分布在鼻、氣管、食管和胃中，分析可能與動物的吞咽反射有關(guān)。

因此，以上幾種給藥方式各有優(yōu)缺點：全身給藥方式早期應(yīng)用較多，操作方法較為簡單，但相同劑量下引起的肺部炎癥反應(yīng)較輕，由于引起全身炎癥反應(yīng)易出現(xiàn)中毒性休克，且血中炎癥細胞及炎癥因子不能很好地反映肺部受損的嚴重程度；頸部皮膚切開氣管內(nèi)注射法可精確的控制給藥劑量，但其切口可能會被微生物感染而出現(xiàn)炎癥，影響實驗結(jié)果；經(jīng)口氣管內(nèi)給藥法無傷口，但對操作要求較高，需準確找到聲門，否則易將LPS灌入食管，使造模失敗，同時可能藥物會僅作用在某一葉肺葉，不能造成全肺感染[25]；口咽吸入法和滴鼻法操作較簡單，但進入下呼吸道的LPS溶液量不可控，可能使實驗結(jié)果產(chǎn)生較大變異[23]，同時由于藥物可能在上呼吸道截留，達到相同的肺部炎癥反應(yīng)需要較多藥物；霧化吸入法是通過自主呼吸給藥，最接近肺炎發(fā)病的過程，但其對實驗室設(shè)備要求較高，同時吸入動物肺部的藥物量無法估算，也可能會因為不同個體的呼吸深度不同而產(chǎn)生個體差異。

3 藥物誘導劑量的選擇

LPS一般以動物體重給藥，常見劑量為1～10 mg/kg，需用生理鹽水或PBS配成適宜的濃度，同時肺部局部給藥的溶液不宜過多，如滴鼻法一般為5～50 μL[25]，過多可能引起動物窒息。 張亞平等[20]以1 mg/kg的劑量處理大鼠后可觀察到口咽吸入法和滴鼻法引起的肺部炎癥與氣管滴入法相比明顯較輕；Chen等[26]也提出，腹腔給藥或靜脈給藥相同量的LPS溶液在肺部造成的組織損傷遠不及經(jīng)氣管或氣管內(nèi)給藥，故若選擇以上兩種方法應(yīng)適當加大劑量，以確保建模的成功。LPS 5 mg/kg是相關(guān)文獻中出現(xiàn)頻率最高的劑量，觀察這些文獻中肺組織病理切片可以發(fā)現(xiàn)，其肺部炎癥反應(yīng)嚴重，出現(xiàn)彌漫性的炎癥細胞浸潤，肺泡壁明顯增厚，幾乎無可辨認的肺泡結(jié)構(gòu)，說明該劑量已導致重癥肺炎，甚至可能已經(jīng)出現(xiàn)了急性呼吸窘迫。D′Almeida等[19]使用的劑量為每只25 μg，換算成單位體重劑量僅約為1.25～1.38 mg/kg，肺部切片也觀察到了較明顯的炎癥反應(yīng)。楊東等[16]使用口咽吸入法誘導小鼠急性肺炎模型時，使用劑量為每只10 μg，按照小鼠體重換算后僅約為0.5 mg/kg，已可以觀察到明顯的肺部炎癥反應(yīng)；焦光宇等[27]使用氣管滴注法建立輕型肺炎模型時，使用的劑量僅為0.1 mg/kg，處理后4 h可觀察到肺組織有較多炎性細胞浸潤，肺間隙水腫，但肺泡結(jié)構(gòu)仍完好，結(jié)合血象結(jié)果后分析此劑量已成功建立肺炎模型。故在建立模型時，應(yīng)充分考慮到動物體重、給藥方式、研究目的，綜合考慮后選擇合適的誘導劑量。

4 評價指標

人類肺炎的診斷多依賴體查和X光檢查，輔以血細胞計數(shù)、動脈血氧分數(shù)等實驗室檢查結(jié)果，但對于實驗動物而言，界定其肺炎尚無統(tǒng)一的標準，雖然動脈血氧、影像檢查等可在部分實驗動物身上進行，但對實驗室條件要求較高，大多數(shù)實驗室并不具備完成此種檢查的設(shè)備條件，故這些診斷標準并不能直接類推至實驗動物。LPS誘導的肺部炎癥反應(yīng)的特征為肺水腫、肺泡-毛細血管屏障的完整性的破壞以及廣泛的中性粒細胞浸潤和炎癥介質(zhì)的釋放[28]，血漿蛋白和中性粒細胞滲漏到肺泡腔，并伴有細胞因子的升高，故相關(guān)評價指標主要有以下幾類。

4.1 肺組織病理學檢查

病理學的變化是急性肺炎模型最直觀的指標之一，可直接反映肺組織炎癥反應(yīng)的程度。正常肺組織的特征是肺泡壁薄，偶見肺泡內(nèi)巨噬細胞，中性粒細胞也較少；當肺組織受外源性LPS刺激出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)時，病理學表現(xiàn)為肺泡腔變小、肺泡壁充血水腫、炎性細胞尤其是中性粒細胞的浸潤，嚴重時幾乎無法辨認肺泡結(jié)構(gòu)。病理學形態(tài)學檢查的結(jié)果可以通過肺組織病理學半定量評分進行量化比較。Mikawa等[29]經(jīng)典的肺組織病理半定量評分方法評分標準：對肺泡充血、出血、肺泡腔或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集、肺泡壁增厚和(或)透明膜形成等4項指標，分別依病變輕重評為0～4分(0分指無病變或非常輕微病變；1分為輕度病變；2分為中度病變；3分為重度病變；4分為極重度病變)，總分16分，4項評定分數(shù)總和為肺損傷的總評分。

4.2 肺泡-毛細血管屏障的改變

肺泡-毛細血管屏障的完整性的破壞，表現(xiàn)為血液中的蛋白質(zhì)及體液滲漏至肺泡腔，出現(xiàn)肺水腫，常通過肺組織濕/干重比值(W/D)、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage liquid，BALF)中蛋白總量進行衡量。相比對照組，LPS處理組肺組織濕/干重比值明顯升高，說明出現(xiàn)了肺水腫；肺泡灌洗液中蛋白含量明顯升高，說明屏障受損后，血漿蛋白向肺泡腔漏出。

4.3 炎癥反應(yīng)的測量

與肺部炎癥反應(yīng)程度相關(guān)度最高的有三個指標：BALF中中性粒細胞數(shù)量、BALF中促炎細胞因子的濃度、肺組織中過氧化物酶的活性或濃度，其中前兩者是研究LPS所致肺炎中較為多見的檢測指標[30]。

在LPS誘導的肺部炎癥反應(yīng)中，中性粒細胞是誘導免疫反應(yīng)的最重要的細胞之一，在炎癥早期即可觀察到其顯著的升高。故炎癥反應(yīng)的程度可以通過血液中或BALF中中性粒細胞的數(shù)量進行評價，但測量血液指標時多代表全身炎癥反應(yīng)的嚴重程度，尤其是建模方式為腹腔注射或尾靜脈注射時，血液中中性粒細胞的數(shù)量可能不能完全代表局部炎癥反應(yīng)的嚴重程度。

在LPS誘導的肺部炎癥反應(yīng)中，白介素-1β(IL-1β)是最早釋放的主要前炎性細胞因子之一，與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)協(xié)同促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生，白介素-6(IL-6)也在LPS誘導的肺部炎癥反應(yīng)中起重要作用[31]。故在使用LPS建模的肺炎相關(guān)研究中，這三種炎癥因子是測量頻率最高的炎癥因子。值得一提的是，焦光宇等[27]研究中雖然觀察到了經(jīng)氣管注射LPS后，肺組織炎癥反應(yīng)較經(jīng)腹腔注射法更為嚴重，但血清和BALF中的TNF-α水平在兩種方法間卻無明顯差異，表明肺部炎癥反應(yīng)與細胞因子水平可能不是平行關(guān)系。

4.4 指標測量時間

指標測量時間也是實驗成功的關(guān)鍵，過早或過晚都可能得不到較好的實驗結(jié)果。美國胸科協(xié)會認為觀察肺部急性炎癥損傷應(yīng)在給予刺激后24 h內(nèi)進行，以區(qū)別肺部慢性及亞慢性損傷[30]。楊東等[18]在經(jīng)口咽吸入 LPS 后的 3、6、12、24、48 h 分別處死小鼠，比較其病理學改變，發(fā)現(xiàn)3 h時僅出現(xiàn)輕微炎癥細胞浸潤，6 h時炎性細胞浸潤明顯，12 h時已無正常的肺泡壁結(jié)構(gòu)，24 h時已出現(xiàn)明顯肺實變；宣國平等[32]在比較尾靜脈給予 LPS后1、3、6、12 h大鼠肺部組織切片、W/D值、肺組織炎癥因子水平后，認為處理后6 h炎癥反應(yīng)達峰值，為觀察到的最佳測量時間，處理后12 h肺組織炎癥反應(yīng)已較前減輕；分析兩個研究在12 h炎癥反應(yīng)程度出現(xiàn)差異可能由于藥物給予方式不同。有研究指出，BALF中炎性因子在4 h時已有明顯升高，但24 h時已經(jīng)開始下降[11]；在焦光宇等[27]研究中也觀察到了相同的趨勢，說明若是將24 h作為測量點，可能觀察時間已經(jīng)較晚。

5 小結(jié)

早期肺炎研究中，常使用菌懸液建模，但研究發(fā)現(xiàn)此種方法建模穩(wěn)定性不強，重復性不高，影響因素較多；后期作為G-菌主要毒力成分的LPS逐漸用于建立肺炎模型、研究肺炎發(fā)病機制及預防治療藥物的研發(fā)；但由于LPS僅為G-菌主要致病成分，與G+菌所致肺炎的機制有所不同，而肺炎致病菌中G+菌也不容忽視，故LPS用于構(gòu)建細菌性肺炎模型可能存在一定的局限性。LPS用于建立肺炎模型時，給藥途徑較多，各方法有各自的優(yōu)缺點，應(yīng)根據(jù)研究的特點和實驗室的條件綜合考慮后進行選擇。給藥劑量方面目前尚無研究比較不同誘導劑量所致的炎癥反應(yīng)的強弱，且受給藥方式影響較大，而不同研究間由于操作過程、實驗研究條件等因素的不同，無法進行橫向比較，故仍需進一步的探索。動物實驗中建立肺炎模型，通常由于給藥劑量較大，引起肺部較重的炎癥反應(yīng)，但實際上人群中輕型肺炎發(fā)生率較高，多少劑量可以達到模擬輕型肺炎的發(fā)生，以及動物的輕型肺炎與重型肺炎如何界定，仍需進行更多的研究。只有動物模型更加地接近臨床疾病發(fā)生發(fā)展情況，才能為藥物研發(fā)、疾病預防、臨床指導用藥等方面提供更多的證據(jù)支持。