臭氧水對(duì)草莓及擬盤多毛孢影響的研究

文婷 李凌云 李娜 郭正紅 王全喜

摘? 要： 通過組織分離純化和分子生物學(xué)鑒定，明確了引起草莓葉部新病的致病菌為擬盤多毛孢。以噴灑清水為空白對(duì)照，利用不同質(zhì)量濃度的臭氧水直接噴灑致病菌和生長(zhǎng)期的草莓植株，研究臭氧水對(duì)致病菌和草莓植株的濃度效應(yīng)，結(jié)果顯示：低濃度臭氧水（0.5～0.8 mg?L-1）對(duì)草莓植株的生理生態(tài)變化和致病菌的生長(zhǎng)影響較小;中濃度臭氧水（2.2～2.5 mg?L-1）可以顯著抑制致病菌的生長(zhǎng)，并促進(jìn)草莓植株的生長(zhǎng);高濃度臭氧水（4.0～4.3 mg?L-1）可以很好地抑制致病菌的生長(zhǎng)，但對(duì)草莓葉片有較嚴(yán)重的腐蝕作用。因此，中濃度（2.2～2.5 mg?L-1）是噴灑草莓的最適臭氧水濃度。

關(guān)鍵詞： 草莓（Fragaria ananassa）; 擬盤多毛孢; 分子鑒定; 臭氧水; 濃度效應(yīng)

中圖分類號(hào)： S 154.36? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? ? 文章編號(hào)： 1000-5137（2020）06-0663-08

Abstract： Through the tissue separation，purification and molecular biological identification technologies，it was confirmed that the pathogenic fungus which caused a new disease of strawberry leaves is Pestalotiopsis.Using pure water as a blank control，ozone waters of different concentrations were sprayed to pathogenic fungus directly and to strawberry leaf surface in its growing period.The concentration effects of ozone water on pathogenic fungus and strawberry leaves were studied respectively.The results showed that：lower concentration ozone water（0.5-0.8 mg?L-1） has little effect on the physiological and ecological changes of strawberry plants and on the growth of pathogenic fungus;medium concentration ozone water（2.2-2.5 mg?L-1） can significantly inhibit the growth of pathogenic fungus and promote the growth of strawberry;higher concentration ozone water（4.0-4.3 mg?L-1） can well inhibit the growth of pathogenic fungus.However，it has a serious corrosion effect on strawberry leaves.Therefore，the medium concentration（2.2-2.5 mg?L-1） is the most suitable ozone water concentration for spraying on strawberry，which can be used in practical production to effectively prevent and control strawberry fungal diseases.

Key words： strawberry（Fragaria ananassa）; Pestalotiopsis; molecular identification; ozone water; concentration effect

0? 引? 言

草莓（Fragaria ananassa）是薔薇科草莓屬的多年生草本植物[1]。作為可食用水果，其味甘酸、性涼、無(wú)毒，熱量極低，能潤(rùn)肺、健脾、補(bǔ)血;富含纖維素、維生素及果膠物質(zhì)，能預(yù)防冠心病及腦溢血;特別是草莓含有的鞣花酸，能有效避免致癌物將健康的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞，從而預(yù)防結(jié)腸癌和直腸癌的發(fā)生[2]。因此，草莓作為一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的漿果，深受廣大消費(fèi)者的青睞。

近幾年，我國(guó)草莓種植面積不斷擴(kuò)大，草莓栽培已遍及全國(guó)各地，年平均產(chǎn)量高于世界平均水平。我國(guó)的草莓種植主要以溫室或大棚栽培為主，露地栽培相對(duì)較少。采用溫室或大棚栽培草莓雖然有很多優(yōu)點(diǎn)，但其具有的高濕、連作等特點(diǎn)，也為病蟲害的發(fā)生創(chuàng)造了極有利的環(huán)境條件。其中病害問題是影響草莓產(chǎn)量的最主要限制因素，多種病害的發(fā)生對(duì)草莓生產(chǎn)造成了極大的破壞與影響[3]。目前，國(guó)內(nèi)已經(jīng)報(bào)道的溫室或大棚栽培草莓的病害主要有葉斑病、白粉病、灰霉病和根腐病等[4]。

防蟲網(wǎng)可以抵御蟲害的入侵，卻不能有效地防治病害，目前人們主要依靠噴灑化學(xué)農(nóng)藥的方法來控制草莓病害。然而農(nóng)藥中存在的有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類等化學(xué)成分，極容易殘留在草莓上危害人體健康，并造成環(huán)境污染等問題[5]。因此，尋求農(nóng)藥的替代品以降低農(nóng)藥的使用量已經(jīng)迫在眉睫。

臭氧作為一種強(qiáng)氧化劑，可以有效地殺滅細(xì)菌芽孢、病原體、真菌及病毒，可溶于水，易分解為氧氣，比較環(huán)保，且成本較低，可應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、餐飲業(yè)等[6]。1997年，美國(guó)食品藥品管理局（FDA）認(rèn)同臭氧完全符合美國(guó)FDA評(píng)價(jià)食品添加劑安全性指標(biāo)（GRAS）標(biāo)準(zhǔn)，并正式批準(zhǔn)臭氧作為一種消毒劑廣泛應(yīng)用于食品加工生產(chǎn)領(lǐng)域中[7]。國(guó)內(nèi)對(duì)臭氧的應(yīng)用相對(duì)較少，目前在蔬菜防治方面已有相關(guān)研究，但水果方面的研究相對(duì)缺乏。

2.2 致病菌的分子鑒定分析

分離純化出的病原菌由華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)BLAST結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育分析，所提取的病原菌樣品與擬盤多毛孢（Pestalotiopsis）親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)100%（圖2～4）。

擬盤多毛孢屬是黑盤孢科（Amphisphaeriaceae）中的無(wú)性形真菌類群[19]。2016年趙景楠等[20]首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道棒孢擬盤多毛孢（Pestalotiopsis clavispora）能引起草莓葉部新病，危害草莓葉片，進(jìn)而影響植株的正常生長(zhǎng)。該病發(fā)病初期葉上產(chǎn)生褐色斑點(diǎn)，病斑周圍褪綠，具有黃色暈圈;發(fā)病后期整個(gè)葉片呈黃褐色干枯死亡。

2.3 臭氧水對(duì)草莓致病菌的生長(zhǎng)濃度效應(yīng)

為了探究臭氧水對(duì)擬盤多毛孢的作用效果，本研究采用牛津杯十字交叉抑菌法分別用不同質(zhì)量濃度的臭氧水與該菌作用。從左到右依次往每個(gè)培養(yǎng)皿的牛津杯中注入了200 μL的無(wú)菌水，以及低濃度、中濃度和高濃度的臭氧水，每種濃度進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，正置培養(yǎng)3 d后觀察，致病菌生長(zhǎng)情況如圖5所示。低濃度臭氧水（0.5～0.8 mg?L-1）對(duì)致病菌的作用不明顯，真菌在培養(yǎng)基上的長(zhǎng)勢(shì)與無(wú)菌水對(duì)照無(wú)明顯差異，該濃度的臭氧水不能抑制致病菌生長(zhǎng)，可能是病害的影響導(dǎo)致臭氧水沒有發(fā)揮作用。中濃度臭氧水（2.2～2.5 mg?L-1）和高濃度臭氧水（4.0～4.3 mg?L-1）與致病菌作用后，致病菌的生長(zhǎng)明顯得到抑制，且臭氧水濃度越高，抑制效果越明顯?？赡苁浅粞跛膹?qiáng)氧化性使其可以穿透致病菌細(xì)胞壁，破壞致病菌的蛋白質(zhì)、多糖和氨基酸等物質(zhì)，從而導(dǎo)致致病菌無(wú)法正常生長(zhǎng)[21]。

2.4 臭氧水對(duì)草莓植株的生長(zhǎng)濃度效應(yīng)

在染菌草莓植株葉片表面噴灑不同質(zhì)量濃度的臭氧水，連續(xù)噴灑3 d后檢測(cè)其生長(zhǎng)情況，如圖6所示。噴灑無(wú)菌水后的對(duì)照組草莓植株呈現(xiàn)青枯狀，從下部葉開始，逐漸向上凋萎、枯死，為典型的擬盤多毛孢葉斑病癥狀[22]，如圖6（a），6（e）所示。與對(duì)照組相比，低濃度臭氧水作用后，草莓植株上的病菌擴(kuò)散范圍較大，對(duì)致病菌感染的抑制效果不顯著，如圖6（b），6（f）所示。中濃度臭氧水作用后，草莓植株基本未出現(xiàn)致病菌毒害現(xiàn)象，植株生長(zhǎng)狀態(tài)良好，含水量、鮮重、株高等各項(xiàng)指標(biāo)都呈上升趨勢(shì)，如圖6（c），6（g）所示。高濃度臭氧水作用后，草莓植株受到腐蝕，地上葉部分變黃或萎蔫，如圖6（d），6（h）所示，表明臭氧水濃度過高會(huì)影響草莓植株的正常生長(zhǎng)。因此，中濃度（2.2～2.5 mg?L-1）的臭氧水既能抑制致病菌，又能促進(jìn)草莓生長(zhǎng)，最適合用于噴灑草莓植株。

3? 結(jié)? 論

經(jīng)過分離純化和分子鑒定分析，得到引起大棚草莓葉部新病的致病菌為擬盤多毛孢（Pestalotiopsis neglecta）。以噴灑無(wú)菌水為空白對(duì)照，將低濃度（0.5～0.8 mg?L-1）、中濃度（2.2～2.5 mg?L-1）和高濃度（4.0～4.3 mg?L-1）3個(gè)質(zhì)量濃度的臭氧水分別作用于草莓致病菌——擬盤多毛孢和生長(zhǎng)期的草莓植株上，研究結(jié)果表明：低濃度的臭氧水對(duì)致病菌的生長(zhǎng)基本無(wú)抑制作用，中濃度的臭氧水對(duì)致病菌的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。但臭氧水質(zhì)量濃度超過4.0 mg?L-1時(shí)，對(duì)草莓植株有較嚴(yán)重的腐蝕作用，而質(zhì)量濃度為2.2～2.5 mg?L-1的臭氧水既能有效殺滅致病菌又不影響草莓的正常生長(zhǎng)，且在一定程度上提高了草莓植株的各項(xiàng)生理指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)：

[1] KIM D R，JEON C W，SHIN J H，et al.Function and distribution of a lantipeptide in strawberry Fusarium wilt disease-suppressive soils [J].Molecular Plant Microbe Interactions，2019，32（3）：306-312.

[2] 趙建軍，鄒繼生，陳建德.上海地區(qū)草莓真菌病害的發(fā)生與防治 [J].上海農(nóng)業(yè)科技， 2014（5）：146-148.

ZHAO J J，ZOU J S，CHEN J D.Occurrence and control of strawberry fungal diseases in Shanghai [J].Shanghai Agricultural Science and Technology，2014（5）：146-148.

[3] 于飛.無(wú)公害草莓病害的綜合防治措施 [J].吉林蔬菜，2017（8）：19-20.

YU F.Comprehensive control measures for pollution-free strawberry diseases [J].Jilin Vegetables，2017（8）：19-20.

[4] 范麗娟.草莓病害的發(fā)生與防治 [J].種子科技，2019，37（10）：116-120.

FAN L J.Occurrence and control of strawberry diseases [J].Seed Science and Technology，2019，37（10）：116-120.

[5] ZHANG P W，WANG S Y，HUANG J T，et al.Dissipation and residue of clothianidin in granules and pesticide fertilizers used in cabbage and soil under field conditions [J].Environmental Science and Pollution Research International，2016，19（2）：1-7.

[6] PERRY J J，YOUSEF A E.Decontamination of raw foods using ozone-based sanitization techniques [J].Annual Review of Food Science and Technology，2011，2（1）：281-289.

[7] USDA.Code of Federal Regulations，Title 9，Part 381.66-Poultry Products;Temperatures and Chilling and Frreezing Procedures [R].Washington D C：Office of the Federal Register National Archives and Records Administration，1997.

[8] 郭正紅，王作銘，殷莉珺，等.臭氧水對(duì)紫葉生菜及胡蘿卜軟腐歐氏桿菌的影響 [J].上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，46（5）：625-631.

GUO Z H，WANG Z M，YIN L J，et al.Effects of ozone water on growth of Lactuca sativa var. romosa Hort and Erwinia carotovora subsp.carotovora [J].Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences），2017，46（5）：625-631.

[9] 郭正紅.臭氧水對(duì)設(shè)施蔬菜病害的防治及其生理機(jī)制的研究 [D].上海：上海師范大學(xué)，2017.

GUO Z H.Prevention and treatment of vegetable diseases by ozone water and its physiological mechanism [D].Shanghai：Shanghai Normal University，2017.

[10] 楊葉，周琴，嵇豪，等. 苦瓜枯萎病病菌的分離與鑒定 [J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，22（3）：354-357. YANG Y，ZHOU Q，JI H，et al.Isolation and identification of Fusarium species from wilted bitter gourd [J].Journal of Zhejiang Agriculture， 2010，22（3）：354-357.

[11] ZHAO J N，MA Z，LIU Z P，et al.Pathogenic bacteria of the leaf spot of Neopestalotiopsis clavispora in strawberry [J].Journal of Fungus，2016，35（1）：114-120.

[12] 張穎慧，魏東盛，邢來君，等.一種改進(jìn)的絲狀真菌DNA提取方法 [J].微生物學(xué)通報(bào)，2008（3）：466-469.

ZHANG Y H，WEI D S，XING L J，et al.An improved method of DNA extraction filamentous fungus [J].Microbiology Bulletin，2008（3）：466-469.

[13] 王世強(qiáng).打孔法測(cè)定抗生素的效價(jià) [J].生物學(xué)通報(bào)，2005（3）：2.

WANG S Q.The punch method to determine the potency of antibiotics [J].Bulletin of Biology，2005（3）：2.

[14] 王孟，李昂，趙震宇，等.裸花紫珠葉抑菌性物質(zhì)的ASE聯(lián)合牛津杯和微孔刃天青法篩選 [J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2017，28（1）：43-45.WANG M，LI A，ZHAO Z Y，et al.Screening of bacteriostasis substances of naked flower purple pearl leaves with Oxford cup and microporous blade tianqing method [J].Lishizhen Medicine and Materia Medica Research，2017，28（1）：43-45.

[15] 林月莉，黃麗麗，索朗拉姆，等.蘋果輪紋病室內(nèi)快速評(píng)價(jià)體系的建立 [J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2011，38（1）：37-41.

LIN Y L，HUANG L L，SOLANGE R，et al.Establishment of apple rapid evaluation system for ring rot disease [J].Journal of Plant Protection，2011，38（1）：37-41.

[16] 石凌波，李媛，費(fèi)諾亞，等.藍(lán)莓?dāng)M盤多毛孢葉斑病病原菌鑒定 [J].中國(guó)南方果樹，2017，46（1）：24-28.

SHI L B，LI Y，F(xiàn)EI N Y，et al.Identification of the pathogen of P.hirsutum leaf spot of blueberry [J].South China Fruits，2017，46（1）：24-28.

[17] 趙洪海，岳清華，梁晨.藍(lán)莓?dāng)M盤多毛孢枝枯病的病原菌 [J].菌物學(xué)報(bào)，2014，33（3）：577-583.

ZHAO H H，YUE Q H，LIANG C.The pathogen causing Pestalotiopsis twig dieback of blueberry [J].Journal of Fungi，2014，33（3）：577-583.

[18] 溫浩，魏佳爽，張桂軍，等.九種殺菌劑對(duì)新擬盤多毛孢病菌的室內(nèi)毒力作用 [J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2019，21（4）：437-443.

WEN H，WEI J S，ZHANG G J，et al.Laboratory toxicity of nine fungicides against Neopestalotiopsis clavispora [J].Chinese Journal of Pesticide Science，2019，21（4）：437-443.

[19] MAHARACHCHIKUMBURA S S N，HYDE K D，GROENEWALD J Z，et al.Pestalotiopsis revisited [J].Studies in Mycology，2014，79（11）：121-186.

[20] 趙景楠，馬喆，劉正坪，等.草莓?dāng)M盤多毛孢葉斑病的病原 [J].菌物學(xué)報(bào)，2016，35（1）：114-120.

ZHAO J N，MA Z，LIU Z P，et al.Pestalotiopsis clavispora causing leaf spot on strawberry [J].Journal of Fungi，2016，35（1）：114-120.

[21] ALEXOPOULOS A，PLESSAS S，CECIU S，et al.Evaluation of ozone efficacy on the reduction of microbial population of fresh cut lettuce（Lactuca sativa） and green bell pepper（Capsicum annuum） [J].Food Control，2013，30（2）：491-496.

[22] 孟婷婷，齊鷹博，劉闖，等.樹莓類擬盤多毛孢葉斑病病原菌的鑒定 [J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，51（1）：111-116.

MENG T T，QI Y B，LIU C，et al.Identification of the pathogen causing raspberry leaf spot [J].Journal of Shenyang Agricultural University，2020，51（1）：111-116.

（責(zé)任編輯：顧浩然，郁慧）