南方山葡萄酒的氧化褐變動力學(xué)研究

李維新 蘇 昊 何志剛 * 林曉姿 任香蕓 梁璋成 林曉婕

（1 福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點實驗室 福州 350003

2 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所 福州 350003）

葡萄酒的氧化褐變是其在加工及陳釀期間極易發(fā)生的重要問題之一。葡萄酒被氧化后，酒的顏色變?yōu)楹稚埔河沙吻遄優(yōu)闇啙?，氧化味較重，使葡萄酒的外觀和營養(yǎng)品質(zhì)均下降，甚至失去商品價值[1]。葡萄酒的氧化褐變可以分為非酶氧化褐變及酶促氧化褐變兩種，酶促氧化褐變主要發(fā)生在葡萄酒加工的早期，而非酶促褐變主要發(fā)生在葡萄酒的陳釀期間[2-3]。在實際生產(chǎn)中，由酶促反應(yīng)引起的褐變已經(jīng)得到很好的控制，而葡萄酒非酶褐變的研究越來越受到人們的關(guān)注。葡萄酒氧化褐變的影響因素較多，比如空氣中的氧氣、酒中的酚類、金屬離子、黃酮類物質(zhì)以及添加的SO2等都對氧化褐變起重要作用[4-5]。酚類是葡萄酒中極易被氧化的一類物質(zhì)，葡萄酒中的酚類物質(zhì)尤其是鄰羥基酚受銅、鐵離子催化氧化生成鄰醌或半醌自由基，并很快通過縮聚反應(yīng)形成褐色素，而氧氣被還原成過氧化氫[6-7]。紅葡萄酒中主要的呈色物質(zhì)如花青素、花色苷等，它們既可以影響紅葡萄酒的色澤，也可以在葡萄酒抗氧化方面發(fā)揮重要作用，如它們可以清除自由基以及螯合金屬離子等。另外，葡萄酒中的原花青素、花色苷等黃酮類物質(zhì)在陳釀期間會發(fā)生聚合、氧化、環(huán)加成、輔色等多種復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)而降解[8-9]。因此，花色苷、花青素在有氧和高溫條件下很容易被氧化而損耗。葡萄酒的氧化褐變過程復(fù)雜，涉及的因素和反應(yīng)較多，這給氧化褐變機(jī)制研究帶來很多困難。目前國內(nèi)外已有關(guān)于白葡萄酒氧化褐變動力學(xué)的研究[10-11]，因葡萄酒品種、類別的不同，故其研究結(jié)果不一致，而關(guān)于紅葡萄酒氧化褐變動力學(xué)的研究則極少[12]。

SO2是葡萄酒生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的食品添加劑，具有多重抗氧化活性，它可以加速耗氧量，通過還原減少酚類損失，阻斷過氧化氫，從而防止葡萄酒的過度氧化[13]。有研究表明，葡萄酒中添加SO2的抗氧化作用機(jī)制主要是與葡萄酒的被氧化中間產(chǎn)物雙氧水和鄰醌進(jìn)行反應(yīng)，將氧化產(chǎn)物還原為酚和氧，從而達(dá)到抗氧化的目的[14]。葡萄酒中的SO2主要是以結(jié)合態(tài)和游離態(tài)兩種形式存在，其中只有游離態(tài)的SO2才具有抗氧化作用，結(jié)合態(tài)SO2只有在釋放成游離態(tài)時，才具有抗氧化功能。葡萄酒中游離SO2的變化往往伴隨著氧化還原電位（ORP）的變化。本研究以福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點實驗室研發(fā)的桂葡1號葡萄酒和刺葡萄酒為對象，分析其在加速氧化褐變過程中褐變程度、游離SO2及ORP變化以及對主要品質(zhì)的影響，研究南方山葡萄的氧化褐變動力學(xué)，游離SO2及ORP含量變化及其互作關(guān)系，從而為有效防止葡萄酒在加工過程中的過度氧化褐變，防止葡萄酒在陳釀期間的品質(zhì)劣變等方面提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄酒，福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點實驗室2015年加工的桂葡1號葡萄酒和刺葡萄酒，均為干型紅葡萄酒，試驗樣酒的理化指標(biāo)見表1。

表1 試驗樣酒的主要理化指標(biāo)Table1 Physicochemical indexes of wines

試劑：鹽酸、正丁醇、醋酸、氯化鈉、醋酸鈉、香草醛、二甲基亞砜等試劑均為分析純級。原花青素（純度UV≥95%），四川維克奇生物科技有限公司；蘆?。兌萓V≥95%），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器：UV-1750紫外可見分光光度計，日本島津公司；868型酸度計，ORION公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；FJA-6型去極化自動氧化還原電位測定儀，南京傳滴儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄酒的加速氧化褐變方法 參考Sioumis等[5]的方法，并略微調(diào)整：在250mL的玻璃試劑瓶中，加入100mL試驗葡萄酒樣品，加蓋密閉后放置于（50±1）℃的恒溫箱中，避光處理30 d。每個試驗處理重復(fù)3次，在處理后的第1，2天分別取樣一次，第3天起每7天取樣一次，檢測褐變程度、紅色色調(diào)、游離SO2、氧化還原電位等指標(biāo)。在加速氧化開始前和結(jié)束時取樣檢測葡萄酒的總酸、揮發(fā)酸、原花青素、游離花色苷、總酚等主要理化指標(biāo)。

1.2.2 葡萄酒樣褐變程度的測定方法 葡萄酒樣在測定前用0.45μm有機(jī)相針式過濾，處理后的葡萄酒用檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液10倍稀釋。葡萄酒的褐變程度以波長420 nm下的吸光值來表示，葡萄酒的紅色色調(diào)用波長520 nm下的吸光值來表示。樣品置于石英比色皿（光程1 cm）中，利用紫外-可見光分光光度計測定吸光值。

緩沖溶液的配制：將0.1mol/L的檸檬酸75 mL與0.2mol/L的磷酸鈉25mL進(jìn)行混合，在使用前經(jīng)過0.45μm有機(jī)相針式過濾，且每次現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.3 葡萄酒樣主要理化指標(biāo)的檢測 酒樣中酒度、還原糖、總酸、揮發(fā)酸、游離SO2、總酚、pH值等指標(biāo)的測定，參考的《葡萄酒分析與檢驗》[15]。

酒樣中的游離花色苷測定方法參考陳瓊和霍琳琳等[16-17]的方法，并做以下修改：待測葡萄酒樣分別用 HCl-NaCl緩沖液（pH 1.0）和HAc-NaAc緩沖液（pH 4.5）稀釋50倍后，將稀釋好的酒樣分別在700 nm和最大吸收波長處測定吸光度，檢測以蒸餾水作為對照。樣品吸光值A(chǔ)的計算公式為：

酒樣的游離花色苷以矢車菊素-3-葡萄糖苷（CGE）表示，其計算公式如下：

式中，Mw——矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量（449.6）；DF——稀釋倍數(shù)；ε——摩爾吸光系數(shù)（29 600）。

原花青素含量測定參考吳巍等[18]的方法。

氧化還原電位（ORP）采用去極化氧化還原電位測定儀進(jìn)行測定。

1.3 試驗數(shù)據(jù)的處理

試驗數(shù)據(jù)采用數(shù)據(jù)處理軟件DPS（V 7.05）進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種南方山葡萄酒氧化褐變及其動力學(xué)分析

在加速氧化過程中，2種南方山葡萄酒的褐變程度（A420）一直增強(qiáng)，至加速氧化30 d，桂葡1號葡萄酒的A420自開始的0.2668增加到0.4783，提高了79.27%；刺葡萄酒的褐變程度增強(qiáng)更快，提高了111.97%（圖1）。從葡萄酒氧化過程中紅色色調(diào)的變化來看，在氧化1 d后，2種葡萄酒的紅色色調(diào)略有上升，之后急速下降。至氧化30 d，桂葡1號葡萄酒的紅色色調(diào)下降了52.03%，而刺葡萄酒下降了23.39%（圖2）。氧化1 d后葡萄酒的紅色色調(diào)略微上升，可能是葡萄酒中游離SO2被氧化后，被SO2結(jié)合的花色素釋放出來的結(jié)果。葡萄酒中游離SO2可以和酒中的花色素結(jié)合，生成無色的亞硫酸色素化合物，從而使葡萄酒的色澤變淺，當(dāng)酒體中有乙醛存在或SO2被消耗時，該不穩(wěn)定化合物分解，使葡萄酒的顏色變深[3]。

回歸分析表明，2種葡萄酒的褐變程度隨褐變時間的變化符合0級動力學(xué)模型方程：[A420]=[A420]0+kt，[A420]0表示初始的褐變程度，k為褐變系數(shù)。其中，桂葡1號葡萄酒和刺葡萄酒的動力學(xué)方程分別為：Y1=0.3189+0.0059t1，R2=0.9168（P=0.0037）和Y2=0.2965+0.0093t2，R2=0.9577（P=0.0002）；桂葡1號葡萄酒的褐變系數(shù)（0.0059）比刺葡萄酒（0.0093）小，表明桂葡1號葡萄酒總體的耐氧化能力要高于刺葡萄酒。從紅色色調(diào)的變化上看，刺葡萄酒經(jīng)過30 d的氧化后，其最終的紅色保持能力要高于桂葡1號葡萄酒（圖2）。

圖1 南方山葡萄酒氧化過程中褐變程度的變化Fig.1 Changes of browing degree in southern wild wines during the oxidation

2.2 南方山葡萄酒氧化褐變過程中游離SO2和氧化還原電位的變化

葡萄酒中游離的SO2具有抗氧化和抑菌作用，能夠參與葡萄酒中一些氧化反應(yīng)，例如：SO2可以阻止葡萄酒中乙醛和H2O2參與丹寧和游離花色苷的縮合反應(yīng)，從而抑制葡萄酒的變色[13]。在葡萄酒加速氧化前期，SO2被氧化消耗較快；氧化處理1 d后，2種葡萄酒的游離SO2含量均迅速下降到7mg/L左右的較低水平。在第9天，2種葡萄酒中的游離SO2略有回升，可能是葡萄酒中原先存在的結(jié)合態(tài)SO2在游離硫被消耗的情況下，釋放出少量游離態(tài)SO2導(dǎo)致[19]。到第16天，2種葡萄酒中的游離SO2均下降到3.92mg/L，雖然酒樣中的游離SO2不能夠被全部消耗，但此時其抗氧化能力較弱（圖3）。

同一種葡萄酒在較高游離SO2含量的情況下，游離SO2是影響其氧化還原電位的主要因素。在葡萄酒加速氧化過程中，2種葡萄酒的氧化還原電位在第1天迅速增加，可能有兩個方面的原因：一是葡萄酒中的游離SO2被迅速消耗從而導(dǎo)致氧化還原電位上升，二是葡萄酒中的酚類物質(zhì)如單寧等被氧化為鄰醌，并伴隨著H2O2的生成而使氧化還原電位上升。在第2～9天，2種葡萄酒的氧化還原電位略有下降，隨后上升并保持較為穩(wěn)定的高水平（圖4）。氧化還原電位在氧化中期下降，可能與葡萄酒在游離SO2減少的情況下少量釋放結(jié)合態(tài)的SO2有關(guān)。

桂葡1號葡萄酒和刺葡萄酒在加速氧化過程中的游離 SO2（Y1、Y2）與氧化還原電位（X1、X2）呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系：Y1=141.738-0.3053X1，P=0.0022，相關(guān)系數(shù) R=-0.9571；Y2=454.130-1.092X2，P=0.0001，相關(guān)系數(shù)R=-0.890；此試驗結(jié)果表明葡萄酒中的氧化還原電位能夠間接反映出酒中游離SO2的變化。

圖2 南方山葡萄酒氧化過程中紅色色調(diào)的變化Fig.2 Changes of red hue in southern wild wines during the oxidation

圖3 南方山葡萄酒的氧化褐變過程中游離SO2的變化Fig.3 Changes of free sulfur dioxide content in southern wild wines during the oxidation

2.3 氧化褐變對南方山葡萄酒主要品質(zhì)的影響

圖4 南方山葡萄酒氧化褐變過程中氧化還原電位的變化Fig.4 Changes of redox potential in southern wild wines during the oxidation

南方山葡萄酒在加速氧化30 d后，其主要的理化指標(biāo)變化見表2。2種葡萄酒的pH值均下降，下降幅度在0.13～0.15之間。pH值的下降同葡萄酒中褐色素的分解及揮發(fā)酸、總酸的升高有關(guān)。葡萄酒中酚類是極易被氧化的一類物質(zhì)，在有氧情況下，酚類物質(zhì)可以氧化生成醌和H2O2，進(jìn)而通過縮聚反應(yīng)形成褐色素，使葡萄酒的A420迅速增加。桂葡1號葡萄酒和刺葡萄酒在加速氧化30 d后，總酚含量均顯著下降，桂葡1號的總酚由1.22 g/L減少到1.01 g/L，下降了17.2%，而刺葡萄酒下降了16.3%?；ㄇ嗨?、花色苷是紅葡萄酒中主要的呈色物質(zhì)，它們不但對葡萄酒的顏色和口感產(chǎn)生影響，還具有較強(qiáng)的抗氧化作用。在葡萄酒加速氧化過程中，酒體中的游離花色苷、原花青素下降較多，桂葡1號葡萄酒氧化30 d后，其原花青素自3.06 g/L下降到1.26 g/L，下降了58.82%，刺葡萄酒則下降了44.40%；2種葡萄酒的游離花色苷在氧化30 d后損耗嚴(yán)重，桂葡1號葡萄酒從開始的431.07mg/L下降到31.67 mg/L，刺葡萄酒的從269.61mg/L下降到24.83mg/L，損失率均超過90%。而刺葡萄酒在經(jīng)過30 d的加速氧化后其原花青素含量為1.49 g/L，比南國1號葡萄酒1.26 g/L高出0.23 g/L，這也可能是刺葡萄酒在氧化后其紅色色調(diào)高于桂葡1號葡萄酒的主要原因。

表2 南方山葡萄酒氧化30 d前、后主要指標(biāo)的變化Table2 Changes of the main physicochemical indexes in southern wild wines after 30 days oxidation

3 結(jié)果與討論

桂葡1號葡萄酒和刺葡萄酒是福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點實驗室研發(fā)的2款南方山葡萄酒，它們在營養(yǎng)特征、有機(jī)酸結(jié)構(gòu)、香氣成分等方面均與北方葡萄酒不同。本文對這兩款山葡萄酒的功能性評價、營養(yǎng)分析、品質(zhì)控制技術(shù)等方面分別進(jìn)行了研究[20-21]。結(jié)果表明，2種南方山葡萄酒隨加速氧化時間的延長，其褐變程度一直呈上升趨勢，其氧化褐變規(guī)律均符合0級動力學(xué)模型，這與Sioumis等[5]和Francisco等[11]的研究結(jié)果相似，而與梁莎等[12]在“媚麗”葡萄酒上的研究結(jié)果不一致，可能是葡萄酒品種的差異，以及加速氧化方法中酒樣量和空氣比例略有區(qū)別的緣故。本研究是在250mL玻璃瓶中裝入100mL的葡萄酒樣并密封，在試驗前期，瓶中含有較多氧氣，葡萄酒急速氧化。葡萄酒中的某些酚類物質(zhì)消耗氧的速度比SO2更快，SO2主要是與葡萄酒被氧化的中間產(chǎn)物鄰醌和H2O2進(jìn)行反應(yīng)[13，22]。因此在加速氧化的第1天，桂葡1號葡萄酒（含游離SO221.29mg/L）和刺葡萄酒（含游離SO223.80mg/L）的SO2都被迅速消耗。之后，葡萄酒中游離SO2的含量始終保持較低水平，雖然其不會被徹底消耗完，但抗氧化作用已大大降低甚至失去抗氧化能力。這個結(jié)論表明，葡萄酒中游離SO2雖對其具有一定的抗氧化作用，但如果葡萄酒在高溫和高氧環(huán)境下，仍然不可能避免發(fā)生氧化損失。因此，葡萄酒在加工及貯藏過程中，在保持適宜游離SO2含量的情況下，還必須采取低溫、隔氧的貯藏方法，綜合防治葡萄酒的過度氧化。

葡萄酒中一般存在多種氧化還原電位，從而構(gòu)成復(fù)雜的氧化還原體系，而葡萄酒中的氧化還原電位則是葡萄酒中存在的諸多氧化物質(zhì)和還原物質(zhì)之間，發(fā)生復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)的綜合結(jié)果。葡萄酒中的氧化還原電位能夠反映葡萄酒中氧化還原能力，這有助于了解葡萄酒的電化學(xué)性質(zhì)，進(jìn)而對葡萄酒的氧化進(jìn)程進(jìn)行分析，而葡萄酒的品種、游離SO2、離子、溫度、pH值等均能影響葡萄酒的氧化還原電位[10]。本試驗結(jié)果表明，在南方山葡萄酒的加速氧化過程中，游離SO2的變化與氧化還原電位呈顯著負(fù)相關(guān)。氧化還原電位的檢測方便快捷，而游離SO2的檢測較繁瑣。因此，深入研究葡萄酒中氧化還原電位和游離SO2含量之間的關(guān)系，對于利用葡萄酒中的氧化還原電位快速監(jiān)測游離SO2含量有著重要的研究意義。

與葡萄酒的質(zhì)量息息相關(guān)的多酚化合物不僅影響酒的口感，還與葡萄酒的色澤相關(guān)，而且還具有較強(qiáng)的抗氧化能力，如螯合金屬離子、清除自由基等[23]。在葡萄酒貯藏期間，酒體中的酚類物質(zhì)可以相互之間發(fā)生環(huán)加成、氧化、聚合等多種化學(xué)反應(yīng)。另外，葡萄酒中的多酚類物質(zhì)還具有還原性，可以消耗酒體中60%的氧氣[24]。因此，在南方山葡萄酒加速氧化結(jié)束后，總酚的含量下降較多。游離花色苷和原花青素是葡萄酒中的一大類多酚化合物，其含量、種類、結(jié)構(gòu)及聚合度與葡萄酒的品質(zhì)密切相關(guān)。葡萄酒中的游離花色苷在貯藏期間能夠轉(zhuǎn)化為相對穩(wěn)定的多聚化合物和低聚體，還能夠同花色素-乙烯基苯酚、花色素-丙酮酸等物質(zhì)進(jìn)行縮合反應(yīng)，并受到酒體中溶解氧含量的影響；葡萄酒中的原花青素能夠消耗氧從而有效防止葡萄酒中其它物質(zhì)被氧化，并對葡萄酒的顏色穩(wěn)定和葡萄酒的澀味、苦味和結(jié)構(gòu)感起到重要作用[25]。在本試驗條件下，2種葡萄酒的原花青素經(jīng)過30 d的加速氧化后損失均超過了44%，而游離花色苷幾乎損失殆盡，導(dǎo)致葡萄酒紅色色調(diào)下降，營養(yǎng)物質(zhì)損失，并產(chǎn)生不利的氧化物質(zhì)，從而影響了葡萄酒的風(fēng)味和品質(zhì)。因此對葡萄酒在加工陳釀期間游離花色苷、原花青素等抗氧化類物質(zhì)有效控制，也是提高葡萄酒品質(zhì)的重要途徑之一。