干腌火腿中微生物多樣性及其分析方法的研究進(jìn)展

陳林，王正莉，吉莉莉，王衛(wèi)，張佳敏

(成都大學(xué)肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610106)

干腌火腿 (dry-cured ham)是用帶骨、皮、爪尖的整只豬腿經(jīng)腌制、洗曬、風(fēng)干和長期發(fā)酵、整形等工藝制成的一種生肉制品[1]。干腌火腿作為傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一，有著悠久的發(fā)展歷史。幾百年來，不同地域間人們生產(chǎn)加工火腿的工藝各有不同，逐漸形成了不同地域特點(diǎn)的產(chǎn)品。國外著名的干腌火腿主要有法國的Bayonne火腿和Corsican火腿、西班牙的 Iberian火腿和Serrano火腿、意大利的Parma火腿和Light Italian Country火腿、美國的Country-style火腿和德國的Westphalia火腿，而我國較著名的有浙江金華火腿、江蘇如皋火腿、云南宣威火腿、貴州盤縣火腿等[2-5]。

1 干腌火腿中微生物的作用

干腌火腿中對發(fā)酵起到重要作用的菌群主要有葡萄球菌、乳酸菌、酵母、霉菌等。干腌火腿中的米酒乳桿菌具有蛋白酶和脂肪酶的活性，一些細(xì)菌素對產(chǎn)品風(fēng)味及貯藏性的提高具有重要作用。葡萄球菌和微球菌能起到分解過氧化物、降解蛋白質(zhì)和脂肪的作用。有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，宣威火腿中的一些葡萄球菌、微球菌與霉菌共同作用，對火腿獨(dú)特風(fēng)味的形成具有基礎(chǔ)性作用。霉菌對火腿外觀的形成有重要作用，通過霉菌生長一方面可以消耗氧氣，防止肉品氧化、褪色，另一方面可以抑制腐敗菌的生長。霉菌還可以生成蛋白酶、脂肪酶，使產(chǎn)品產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味物質(zhì)?；鹜壬系拿咕c火腿色、香、味的形成有著直接關(guān)系，在金華火腿傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝中，霉菌的各項(xiàng)特征是感官檢查火腿質(zhì)量好壞的標(biāo)志之一。酵母的作用在于能使火腿中的維生素E、脯氨酸等香甜成分增加[6]。

2 干腌火腿中微生物菌群的分析方法

目前用于干腌火腿中微生物的相關(guān)研究方法主要包括兩大類，一類是純培養(yǎng)分析法[7,8]，另一類是借助分子生物學(xué)手段的免培養(yǎng)分析法[9]。

2.1 純培養(yǎng)分析法

純培養(yǎng)分析法是利用不同的培養(yǎng)基對試樣中的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，然后通過形態(tài)學(xué)、生理生化等方法進(jìn)行分離、計(jì)數(shù)、鑒定，得到微生物多樣性數(shù)據(jù)的一種傳統(tǒng)有效方法。目前，對干腌火腿微生物多樣性相關(guān)的研究報(bào)道大多采用此種方法。

胡萸英等[10]早在20世紀(jì)80年代就用純培養(yǎng)法從金華火腿中分離出大量微生物。其中霉菌主要有青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)、芽枝霉(Cladosporium)、交鏈孢霉(Alternaria)等。酵母菌主要有裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、隱球酵母屬(Cryptococcus)等。細(xì)菌主要為芽孢桿菌屬(Bacillus)、微球菌屬(Micrococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、黃桿菌屬(Flavobacteriu)等。甄宗圓等[11,12]發(fā)現(xiàn)用傳統(tǒng)工藝加工金華火腿過程中，上鹽后，火腿內(nèi)部微生物數(shù)量減少，進(jìn)入發(fā)酵房后很快可增加至最高106CFU/g，但在火腿成熟生香期，內(nèi)部微生物數(shù)量又下降至103CFU/g。內(nèi)部細(xì)菌占優(yōu)勢的是葡萄球菌，其次是乳酸菌(主要有消化乳桿菌、馬脲片球菌和戊糖片球菌等)，變異微球菌的數(shù)量也較多。內(nèi)部酵母菌群中主要有類筒假絲酵母、漢遜德巴利酵母、賽道威漢遜酵母、紅酵母等。余翔[13]發(fā)現(xiàn)現(xiàn)代工藝加工過程中金華火腿內(nèi)部的細(xì)菌優(yōu)勢種為乳酸菌、葡萄球菌；內(nèi)部主要的酵母菌是歐諾比假絲酵母、紅酵母、賽道威漢遜酵母、白色布勒擲孢酵母、多形漢森酵母等。

江東福等[14]研究宣威火腿時(shí)鑒定出表層生態(tài)菌圈中有17個(gè)屬的真菌群：曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、木霉屬(Trichoderma)、根霉屬(Rhizupus)、毛霉屬(Mucor)、擬青霉屬(Paecilomyces)、長蠕孢霉屬(Helmithosporium)、交鏈孢霉屬(Alternaria)、鐮刀菌屬(Fusarium)、刀孢霉屬(Clasterosporium)、葡柄霉屬(Stemphylium)、束絲菌屬(Ozonium)、膠霉屬(Gliocladium)及酵母和酵母狀真菌中的酵母屬(Saccharomyces)、漢遜氏酵母屬(Hansenula)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、黑酵母(black yeast)和7個(gè)屬的放線菌群。曲霉、青霉、酵母和鏈霉菌等屬是宣威火腿的主要菌群。馬萍等研究認(rèn)為宣威火腿酵母菌群占火腿總菌群的60%～70%，青霉、木霉、根霉、毛霉、黑曲霉等有益或無害菌群占8%～15%，煙曲、黃曲、雜曲霉等無益菌群占7%～10%，細(xì)菌占10%左右。李平蘭等[15]研究發(fā)現(xiàn)宣威火腿中的優(yōu)勢菌為葡萄球菌、微球菌和霉菌，而乳酸菌及腸桿菌、腸球菌的數(shù)量均明顯低于優(yōu)勢菌群。

蔣云升等[16]對如皋火腿微生態(tài)體系進(jìn)行的研究表明, 火腿中心部位發(fā)酵前期的菌系構(gòu)成為嗜鹽性球菌、桿菌和酵母, 中期以球菌和酵母為主, 后期只有球菌和少量的酵母分布。

李欣蔚等[17]用傳統(tǒng)培養(yǎng)法研究發(fā)現(xiàn)劍門火腿中的微生物主要為葡萄球菌、微球菌和酵母菌，其表層數(shù)量明顯高于內(nèi)部，乳酸菌主要分布于火腿內(nèi)部，霉菌主要存在于火腿表層。

胡永金等[18]對傳統(tǒng)工藝制作的三川火腿加工中微生物區(qū)系的動態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)腌制期、風(fēng)干期和焐灰期分別為三川火腿表面以及內(nèi)部細(xì)菌和葡萄球菌數(shù)量的增長期、穩(wěn)定期和減少期; 除腌制初期外，火腿內(nèi)部假單胞菌數(shù)量均高于其表面，且在整個(gè)加工過程中由于微生物之間的競爭性關(guān)系呈逐漸降低趨勢，腌制后期為火腿表面和內(nèi)部霉菌數(shù)量的急劇增長期，但在焐灰期驟減。

黨喜軍[19]用傳統(tǒng)純培養(yǎng)法研究發(fā)現(xiàn)諾鄧火腿表面微生物非常豐富，3年期火腿的細(xì)菌和真菌類群豐度最高。霉菌中的優(yōu)勢菌群為曲霉屬(Aspergillus)，酵母菌類群的優(yōu)勢菌群為德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)和假絲酵母屬(Candida)，細(xì)菌類群中的優(yōu)勢菌群為葡萄球菌屬(Staphylococcus)。此外，芽孢桿菌屬細(xì)菌也被分離檢測到，該屬菌群大多能產(chǎn)生具有較強(qiáng)蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性的消化酶，有利于火腿中大分子物質(zhì)的分解。

純培養(yǎng)分析法最大的優(yōu)點(diǎn)是可以獲得培養(yǎng)菌株，對后續(xù)功能菌株的篩選與應(yīng)用提供豐富的資源。許多研究者基于培養(yǎng)依賴法對分離出的微生物進(jìn)行了大量的研究。Lori等[20]從Parma火腿內(nèi)部樣品中分離出了耐鹽菌。潘明等從篩選到能夠產(chǎn)鮮、產(chǎn)香的5株葡萄球菌、2株桿菌、1株酵母菌，發(fā)現(xiàn)篩選的菌株都有較好的耐鹽性、耐亞硝酸鹽性，其中一些菌株具有蛋白酶和脂肪酶活性。并將其中部分菌株組合為發(fā)酵劑，進(jìn)行了火腿發(fā)酵工藝的優(yōu)化，得到了較好的發(fā)酵效果。顧于濱[21]按照肉制品發(fā)酵劑篩選標(biāo)準(zhǔn)從金華火腿發(fā)酵菌中篩選出了植物乳桿菌、彎曲乳桿菌和木糖葡萄球菌。將其運(yùn)用于發(fā)酵香腸的生產(chǎn)，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和木糖葡萄球菌能通過抑制脂肪的氧化顯著改善發(fā)酵香腸的品質(zhì)，并且能通過減少生物胺的形成來提高香腸的安全性。

2.2 免培養(yǎng)分析法

采用傳統(tǒng)常規(guī)分離純化和培養(yǎng)的方法來研究火腿中的微生物存在著不可避免的缺陷[22]，據(jù)報(bào)道，在自然界中有90%～99%的微生物用傳統(tǒng)方法無法培養(yǎng)出來，這就人為改變了原始菌群的微生態(tài)構(gòu)成，對研究結(jié)果造成較大偏差[23]。因此，以免培養(yǎng)分析法為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法開始在火腿微生物多樣性研究中被運(yùn)用。目前在干腌火腿中已被開發(fā)應(yīng)用的主要是高通量測序技術(shù)(high throughput sequencing，HTS)。該技術(shù)不需要大規(guī)模的投入，對加速生物學(xué)及生物醫(yī)學(xué)的研究具有引人矚目的作用[24]。它通過測定樣本中存在的細(xì)菌16S rRNA、真菌16S rRNA或內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)特定區(qū)域堿基序列，可一次性對幾十萬到幾百萬條的DNA分子進(jìn)行序列測定[25]。高通量測序技術(shù)可以檢測到大量不同分類水平的微生物，包括純培養(yǎng)物和許多未知的新分類單元。Ge Qingfeng等[26]用高通量技術(shù)比較了具有5年、15年和30年金華火腿廠不同廠齡廠家生產(chǎn)的火腿產(chǎn)品微生物多樣性情況，共獲得了18個(gè)門、242個(gè)屬的微生物，不同廠齡產(chǎn)品中微生物多樣性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和風(fēng)味物質(zhì)情況有顯著性差異，結(jié)果提示不同廠齡金華火腿廠可以形成特有的平衡的微生物多樣性結(jié)構(gòu)，可能對火腿獨(dú)特風(fēng)味的形成有貢獻(xiàn)。黨喜軍用高通量測序技術(shù)對諾鄧火腿的真菌研究表明，優(yōu)勢真菌類群主要分布在子囊菌門和擔(dān)子菌門，種類最多的4個(gè)屬分別為尾孢屬、假絲酵母屬、節(jié)擔(dān)菌屬、曲霉屬。細(xì)菌高通量測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、藍(lán)菌門和放線菌門是門水平優(yōu)勢細(xì)菌類群，而屬水平優(yōu)勢細(xì)菌類群主要是葡萄球菌屬、嗜冷桿菌屬和志賀氏菌屬。

母雨等用Illumina高通量測序技術(shù)從盤縣火腿中共鑒定出24個(gè)細(xì)菌門，433個(gè)細(xì)菌屬，其中厚壁菌門、變形菌門和放線菌門是最多的；共分離鑒定出2個(gè)真菌門，68個(gè)屬，優(yōu)勢菌是子囊菌門。

張?jiān)娨獾萚27]通過PCR法鑒定出了貴州威寧火腿中的10株菌株，其中有4株馬胃葡萄球菌(Staphylococcusequorum)、2株木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)、2株乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、1株變平滑假絲酵母菌(Candidametapsilosis)和1株近平滑假絲酵母菌(Candidaparapsilosis)；并發(fā)現(xiàn)了部分菌株有較強(qiáng)的耐鹽和耐低溫能力。

鄒穎玲等[28]利用PCR-DGGE技術(shù)從不同加工年份宣威火腿中檢測到27種真菌，主要有：Aspergilluspseudoglaucus，Phialosimplexcaninus，Aspergilluspenicillioides，Yamadazymatriangularis，Wallemiasebi，Candidaglucosophila等，其中Aspergilluspseudoglaucus是優(yōu)勢菌種。多樣性分析表明，加工3年的宣威火腿表面真菌群落多樣性最高，加工2年的火腿表面真菌群落多樣性最低。加工2年的火腿內(nèi)部真菌群落多樣性最高，加工3年的火腿內(nèi)部真菌群落多樣性最低。

免培養(yǎng)分析法中，除了高通量測序技術(shù)外，變性梯度凝膠電泳(DGGE)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等也被廣泛應(yīng)用到了微生物多樣性的研究中[29]。另外，DNA宏條形碼、寡核苷酸配型技術(shù)、Biolog微平板法，脂肪酸甲酯譜圖法、熒光原位雜交(FISH)、RFLP等相關(guān)技術(shù)也是微生物多樣性分析的常用技術(shù)[30]。

3 總結(jié)與展望

目前，火腿微生物多樣性相關(guān)研究結(jié)果主要還是用傳統(tǒng)培養(yǎng)法獲得，PCR-DGGE和高通量測序等相關(guān)技術(shù)還很少有報(bào)道。DNA宏條形碼、寡核苷酸配型技術(shù)、Biolog微平板法、脂肪酸甲酯譜圖法、熒光原位雜交(FISH)、RFLP等分析方法在獲取微生物多樣性信息方面各有優(yōu)劣，因此為了獲取更加全面、準(zhǔn)確的微生物群落組成、結(jié)構(gòu)及變化等信息，需要結(jié)合實(shí)際研究目標(biāo)，采取多層次、多角度的研究手段，通過多種分析方法的互補(bǔ)，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、完整解析微生物群落及其代謝產(chǎn)物的動態(tài)變化過程，從而實(shí)現(xiàn)火腿發(fā)酵過程中產(chǎn)品品質(zhì)、安全及穩(wěn)定的可控性。