陳林,王正莉,吉莉莉,王衛(wèi),張佳敏
(成都大學(xué)肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610106)
干腌火腿 (dry-cured ham)是用帶骨、皮、爪尖的整只豬腿經(jīng)腌制、洗曬、風(fēng)干和長期發(fā)酵、整形等工藝制成的一種生肉制品[1]。干腌火腿作為傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一,有著悠久的發(fā)展歷史。幾百年來,不同地域間人們生產(chǎn)加工火腿的工藝各有不同,逐漸形成了不同地域特點(diǎn)的產(chǎn)品。國外著名的干腌火腿主要有法國的Bayonne火腿和Corsican火腿、西班牙的 Iberian火腿和Serrano火腿、意大利的Parma火腿和Light Italian Country火腿、美國的Country-style火腿和德國的Westphalia火腿,而我國較著名的有浙江金華火腿、江蘇如皋火腿、云南宣威火腿、貴州盤縣火腿等[2-5]。
干腌火腿中對發(fā)酵起到重要作用的菌群主要有葡萄球菌、乳酸菌、酵母、霉菌等。干腌火腿中的米酒乳桿菌具有蛋白酶和脂肪酶的活性,一些細(xì)菌素對產(chǎn)品風(fēng)味及貯藏性的提高具有重要作用。葡萄球菌和微球菌能起到分解過氧化物、降解蛋白質(zhì)和脂肪的作用。有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn),宣威火腿中的一些葡萄球菌、微球菌與霉菌共同作用,對火腿獨(dú)特風(fēng)味的形成具有基礎(chǔ)性作用。霉菌對火腿外觀的形成有重要作用,通過霉菌生長一方面可以消耗氧氣,防止肉品氧化、褪色,另一方面可以抑制腐敗菌的生長。霉菌還可以生成蛋白酶、脂肪酶,使產(chǎn)品產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味物質(zhì)?;鹜壬系拿咕c火腿色、香、味的形成有著直接關(guān)系,在金華火腿傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝中,霉菌的各項(xiàng)特征是感官檢查火腿質(zhì)量好壞的標(biāo)志之一。酵母的作用在于能使火腿中的維生素E、脯氨酸等香甜成分增加[6]。
目前用于干腌火腿中微生物的相關(guān)研究方法主要包括兩大類,一類是純培養(yǎng)分析法[7,8],另一類是借助分子生物學(xué)手段的免培養(yǎng)分析法[9]。
純培養(yǎng)分析法是利用不同的培養(yǎng)基對試樣中的微生物進(jìn)行培養(yǎng),然后通過形態(tài)學(xué)、生理生化等方法進(jìn)行分離、計(jì)數(shù)、鑒定,得到微生物多樣性數(shù)據(jù)的一種傳統(tǒng)有效方法。目前,對干腌火腿微生物多樣性相關(guān)的研究報(bào)道大多采用此種方法。
胡萸英等[10]早在20世紀(jì)80年代就用純培養(yǎng)法從金華火腿中分離出大量微生物。其中霉菌主要有青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)、芽枝霉(Cladosporium)、交鏈孢霉(Alternaria)等。酵母菌主要有裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、隱球酵母屬(Cryptococcus)等。細(xì)菌主要為芽孢桿菌屬(Bacillus)、微球菌屬(Micrococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、黃桿菌屬(Flavobacteriu)等。甄宗圓等[11,12]發(fā)現(xiàn)用傳統(tǒng)工藝加工金華火腿過程中,上鹽后,火腿內(nèi)部微生物數(shù)量減少,進(jìn)入發(fā)酵房后很快可增加至最高106CFU/g,但在火腿成熟生香期,內(nèi)部微生物數(shù)量又下降至103CFU/g。內(nèi)部細(xì)菌占優(yōu)勢的是葡萄球菌,其次是乳酸菌(主要有消化乳桿菌、馬脲片球菌和戊糖片球菌等),變異微球菌的數(shù)量也較多。內(nèi)部酵母菌群中主要有類筒假絲酵母、漢遜德巴利酵母、賽道威漢遜酵母、紅酵母等。余翔[13]發(fā)現(xiàn)現(xiàn)代工藝加工過程中金華火腿內(nèi)部的細(xì)菌優(yōu)勢種為乳酸菌、葡萄球菌;內(nèi)部主要的酵母菌是歐諾比假絲酵母、紅酵母、賽道威漢遜酵母、白色布勒擲孢酵母、多形漢森酵母等。
江東福等[14]研究宣威火腿時(shí)鑒定出表層生態(tài)菌圈中有17個(gè)屬的真菌群:曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、木霉屬(Trichoderma)、根霉屬(Rhizupus)、毛霉屬(Mucor)、擬青霉屬(Paecilomyces)、長蠕孢霉屬(Helmithosporium)、交鏈孢霉屬(Alternaria)、鐮刀菌屬(Fusarium)、刀孢霉屬(Clasterosporium)、葡柄霉屬(Stemphylium)、束絲菌屬(Ozonium)、膠霉屬(Gliocladium)及酵母和酵母狀真菌中的酵母屬(Saccharomyces)、漢遜氏酵母屬(Hansenula)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、黑酵母(black yeast)和7個(gè)屬的放線菌群。曲霉、青霉、酵母和鏈霉菌等屬是宣威火腿的主要菌群。馬萍等研究認(rèn)為宣威火腿酵母菌群占火腿總菌群的60%~70%,青霉、木霉、根霉、毛霉、黑曲霉等有益或無害菌群占8%~15%,煙曲、黃曲、雜曲霉等無益菌群占7%~10%,細(xì)菌占10%左右。李平蘭等[15]研究發(fā)現(xiàn)宣威火腿中的優(yōu)勢菌為葡萄球菌、微球菌和霉菌,而乳酸菌及腸桿菌、腸球菌的數(shù)量均明顯低于優(yōu)勢菌群。
蔣云升等[16]對如皋火腿微生態(tài)體系進(jìn)行的研究表明, 火腿中心部位發(fā)酵前期的菌系構(gòu)成為嗜鹽性球菌、桿菌和酵母, 中期以球菌和酵母為主, 后期只有球菌和少量的酵母分布。
李欣蔚等[17]用傳統(tǒng)培養(yǎng)法研究發(fā)現(xiàn)劍門火腿中的微生物主要為葡萄球菌、微球菌和酵母菌,其表層數(shù)量明顯高于內(nèi)部,乳酸菌主要分布于火腿內(nèi)部,霉菌主要存在于火腿表層。
胡永金等[18]對傳統(tǒng)工藝制作的三川火腿加工中微生物區(qū)系的動態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)腌制期、風(fēng)干期和焐灰期分別為三川火腿表面以及內(nèi)部細(xì)菌和葡萄球菌數(shù)量的增長期、穩(wěn)定期和減少期; 除腌制初期外,火腿內(nèi)部假單胞菌數(shù)量均高于其表面,且在整個(gè)加工過程中由于微生物之間的競爭性關(guān)系呈逐漸降低趨勢,腌制后期為火腿表面和內(nèi)部霉菌數(shù)量的急劇增長期,但在焐灰期驟減。
黨喜軍[19]用傳統(tǒng)純培養(yǎng)法研究發(fā)現(xiàn)諾鄧火腿表面微生物非常豐富,3年期火腿的細(xì)菌和真菌類群豐度最高。霉菌中的優(yōu)勢菌群為曲霉屬(Aspergillus),酵母菌類群的優(yōu)勢菌群為德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)和假絲酵母屬(Candida),細(xì)菌類群中的優(yōu)勢菌群為葡萄球菌屬(Staphylococcus)。此外,芽孢桿菌屬細(xì)菌也被分離檢測到,該屬菌群大多能產(chǎn)生具有較強(qiáng)蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性的消化酶,有利于火腿中大分子物質(zhì)的分解。
純培養(yǎng)分析法最大的優(yōu)點(diǎn)是可以獲得培養(yǎng)菌株,對后續(xù)功能菌株的篩選與應(yīng)用提供豐富的資源。許多研究者基于培養(yǎng)依賴法對分離出的微生物進(jìn)行了大量的研究。Lori等[20]從Parma火腿內(nèi)部樣品中分離出了耐鹽菌。潘明等從篩選到能夠產(chǎn)鮮、產(chǎn)香的5株葡萄球菌、2株桿菌、1株酵母菌,發(fā)現(xiàn)篩選的菌株都有較好的耐鹽性、耐亞硝酸鹽性,其中一些菌株具有蛋白酶和脂肪酶活性。并將其中部分菌株組合為發(fā)酵劑,進(jìn)行了火腿發(fā)酵工藝的優(yōu)化,得到了較好的發(fā)酵效果。顧于濱[21]按照肉制品發(fā)酵劑篩選標(biāo)準(zhǔn)從金華火腿發(fā)酵菌中篩選出了植物乳桿菌、彎曲乳桿菌和木糖葡萄球菌。將其運(yùn)用于發(fā)酵香腸的生產(chǎn),發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和木糖葡萄球菌能通過抑制脂肪的氧化顯著改善發(fā)酵香腸的品質(zhì),并且能通過減少生物胺的形成來提高香腸的安全性。
采用傳統(tǒng)常規(guī)分離純化和培養(yǎng)的方法來研究火腿中的微生物存在著不可避免的缺陷[22],據(jù)報(bào)道,在自然界中有90%~99%的微生物用傳統(tǒng)方法無法培養(yǎng)出來,這就人為改變了原始菌群的微生態(tài)構(gòu)成,對研究結(jié)果造成較大偏差[23]。因此,以免培養(yǎng)分析法為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法開始在火腿微生物多樣性研究中被運(yùn)用。目前在干腌火腿中已被開發(fā)應(yīng)用的主要是高通量測序技術(shù)(high throughput sequencing,HTS)。該技術(shù)不需要大規(guī)模的投入,對加速生物學(xué)及生物醫(yī)學(xué)的研究具有引人矚目的作用[24]。它通過測定樣本中存在的細(xì)菌16S rRNA、真菌16S rRNA或內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)特定區(qū)域堿基序列,可一次性對幾十萬到幾百萬條的DNA分子進(jìn)行序列測定[25]。高通量測序技術(shù)可以檢測到大量不同分類水平的微生物,包括純培養(yǎng)物和許多未知的新分類單元。Ge Qingfeng等[26]用高通量技術(shù)比較了具有5年、15年和30年金華火腿廠不同廠齡廠家生產(chǎn)的火腿產(chǎn)品微生物多樣性情況,共獲得了18個(gè)門、242個(gè)屬的微生物,不同廠齡產(chǎn)品中微生物多樣性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和風(fēng)味物質(zhì)情況有顯著性差異,結(jié)果提示不同廠齡金華火腿廠可以形成特有的平衡的微生物多樣性結(jié)構(gòu),可能對火腿獨(dú)特風(fēng)味的形成有貢獻(xiàn)。黨喜軍用高通量測序技術(shù)對諾鄧火腿的真菌研究表明,優(yōu)勢真菌類群主要分布在子囊菌門和擔(dān)子菌門,種類最多的4個(gè)屬分別為尾孢屬、假絲酵母屬、節(jié)擔(dān)菌屬、曲霉屬。細(xì)菌高通量測序結(jié)果發(fā)現(xiàn),厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、藍(lán)菌門和放線菌門是門水平優(yōu)勢細(xì)菌類群,而屬水平優(yōu)勢細(xì)菌類群主要是葡萄球菌屬、嗜冷桿菌屬和志賀氏菌屬。
母雨等用Illumina高通量測序技術(shù)從盤縣火腿中共鑒定出24個(gè)細(xì)菌門,433個(gè)細(xì)菌屬,其中厚壁菌門、變形菌門和放線菌門是最多的;共分離鑒定出2個(gè)真菌門,68個(gè)屬,優(yōu)勢菌是子囊菌門。
張?jiān)娨獾萚27]通過PCR法鑒定出了貴州威寧火腿中的10株菌株,其中有4株馬胃葡萄球菌(Staphylococcusequorum)、2株木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)、2株乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、1株變平滑假絲酵母菌(Candidametapsilosis)和1株近平滑假絲酵母菌(Candidaparapsilosis);并發(fā)現(xiàn)了部分菌株有較強(qiáng)的耐鹽和耐低溫能力。
鄒穎玲等[28]利用PCR-DGGE技術(shù)從不同加工年份宣威火腿中檢測到27種真菌,主要有:Aspergilluspseudoglaucus,Phialosimplexcaninus,Aspergilluspenicillioides,Yamadazymatriangularis,Wallemiasebi,Candidaglucosophila等,其中Aspergilluspseudoglaucus是優(yōu)勢菌種。多樣性分析表明,加工3年的宣威火腿表面真菌群落多樣性最高,加工2年的火腿表面真菌群落多樣性最低。加工2年的火腿內(nèi)部真菌群落多樣性最高,加工3年的火腿內(nèi)部真菌群落多樣性最低。
免培養(yǎng)分析法中,除了高通量測序技術(shù)外,變性梯度凝膠電泳(DGGE)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等也被廣泛應(yīng)用到了微生物多樣性的研究中[29]。另外,DNA宏條形碼、寡核苷酸配型技術(shù)、Biolog微平板法,脂肪酸甲酯譜圖法、熒光原位雜交(FISH)、RFLP等相關(guān)技術(shù)也是微生物多樣性分析的常用技術(shù)[30]。
目前,火腿微生物多樣性相關(guān)研究結(jié)果主要還是用傳統(tǒng)培養(yǎng)法獲得,PCR-DGGE和高通量測序等相關(guān)技術(shù)還很少有報(bào)道。DNA宏條形碼、寡核苷酸配型技術(shù)、Biolog微平板法、脂肪酸甲酯譜圖法、熒光原位雜交(FISH)、RFLP等分析方法在獲取微生物多樣性信息方面各有優(yōu)劣,因此為了獲取更加全面、準(zhǔn)確的微生物群落組成、結(jié)構(gòu)及變化等信息,需要結(jié)合實(shí)際研究目標(biāo),采取多層次、多角度的研究手段,通過多種分析方法的互補(bǔ),實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、完整解析微生物群落及其代謝產(chǎn)物的動態(tài)變化過程,從而實(shí)現(xiàn)火腿發(fā)酵過程中產(chǎn)品品質(zhì)、安全及穩(wěn)定的可控性。