川陳皮素通過調(diào)節(jié)長鏈非編碼RNA LSINCT5影響胰腺癌細胞增殖及其機制

梅佳 曾娟 王琴 李軍 韓永紅

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院腫瘤科（武漢430024）

胰腺癌是一種惡性程度高、預(yù)后極差的腫瘤，其發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)逐年上升。近20年來，胰腺癌的發(fā)病率在我國增加了6倍，嚴重危害人民的健康和生存質(zhì)量［1］。對于胰腺癌的治療，手術(shù)、放化療仍是主要手段。但是化療藥物毒副作用較大，并且易產(chǎn)生耐藥性。即使胰腺癌患者接受各種途徑治療后，其整體的預(yù)后水平并不理想，總體5年生存率只有3%［2-3］。因此，醫(yī)學研究人員亟待尋找療效好、毒副作用小的藥物［4］，緩解患者的痛苦。研究報道多種中藥成分具有抗腫瘤作用，且毒副作用小，已經(jīng)成為腫瘤的主要輔助治療途徑之一。

川陳皮素是陳皮的有效成分之一，為多甲氧基黃酮類化合物中的一種，在柑橘屬植物果皮中的含量較為豐富，具有較高的生物利用度和滲透性。研究報道川陳皮素具有多種藥理學活性，包括抗腫瘤、抗炎、抗氧化等［5-10］。川陳皮素對肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌等多種腫瘤細胞具有選擇性的抑制作用。

長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，在調(diào)節(jié)細胞分化、增殖、凋亡和遷移等生物學過程中發(fā)揮重要作用。近期研究表明，LncRNA調(diào)控多種關(guān)鍵的促癌基因或抑癌基因的表達，從而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。除了調(diào)節(jié)其他基因，LncRNA自身也作為致癌或者抑癌因子，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11-12］。LncRNA是否參與了中藥的抗腫瘤過程，尚未見報道。本研究旨在探討川陳皮素對胰腺癌細胞增殖的抑制作用及其潛在分子機制。

1 方法

1.1 細胞培養(yǎng)胰腺癌細胞株MIAPaCa-2和PANC1及正常胰腺導管上皮細胞株H6C7均購于武漢大學保藏中心。所有細胞株均培養(yǎng)在加入10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的PRMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。采用二甲基亞砜（DMSO）溶解川陳皮素（上海索萊寶生物科技有限公司）。DMSO作為溶劑，其終濃度不超過0.1%。

1.2 CCK-8采用CCK8檢測細胞活力變化。細胞消化后，用完全培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)整為3×103/mL，接種于96孔板中。培養(yǎng)48 h后，棄掉培養(yǎng)基，加入CCK8反應(yīng)試劑，繼續(xù)孵育2 h。采用酶標儀（美國Biotek公司）檢測96孔板每孔在450 nm的吸光度值。

1.3 RT-PCR采用Trizol（美國Invitrogen公司）從癌組織及癌旁組織樣品和細胞株中提取總RNA。超微量紫外分光光度計（德國Eppendorf公司）測定總RNA濃度以及純度。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TAKARA公司）以RNA為模板合成cDNA，之后運用SYBR Green RT-PCR試劑盒（日本TAKARA公司）檢測LncRNA的表達豐度。

1.4 集落形成實驗細胞消化后，完全培養(yǎng)基重新懸浮細胞制成單細胞懸液。按1×103/mL濃度將細胞接種于六孔板上。連續(xù)培養(yǎng)14 d后，加入10%的甲醛固定細胞15 min，1.0%的結(jié)晶紫染色5 min?？諝飧稍锖筮M行計數(shù)。

1.5 流式細胞術(shù)轉(zhuǎn)染si-LSINCT5 48 h后，用遇冷的70%乙醇固定細胞后，50 mg/mL PI對細胞進行染色，流式細胞儀檢測每個階段細胞數(shù)量。

1.6 Western BlotRIPA提取細胞的總蛋白，超微量分光光度計測定蛋白濃度后加入Loading Buffer，沸水煮5 min將蛋白變性。每個蛋白樣本取40 μg加入SDS-PAGE進行電泳分離。通過電轉(zhuǎn)方式將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜在含有5%脫脂奶粉的TBST中室溫封閉2 h。以1∶1 000比例稀釋一抗，4°C下一抗孵育PVDF膜過夜。HRP標記的二抗以1∶3 000稀釋后室溫孵育PVDF膜2 h后，ECL顯影。

1.7 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)均以表示，采用SPSS 19.0分析軟件和單因素方差分析ANOVA方法或非配對t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LSINCT5在胰腺癌組織和細胞中表達增加采用RT-PCR檢測LSINCT5在10對胰腺癌組織及其癌旁組織中LSINCT5的表達情況，LSINCT5在胰腺癌患者腫瘤組織（3.05±0.49）中的表達顯著高于其癌旁組織（1.02±0.09）中的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1A；進一步檢測了LSINCT5在胰腺癌細胞株MIAPaCa-2和PANC1及正常胰腺導管上皮細胞株H6C7中的表達水平，結(jié)果顯示，LSINCT5在MIAPaCa-2（2.19± 0.23）和PANC1（1.81± 0.20）中的表達與H6C7（1.03± 0.09）相比顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（分別為P＜0.01，P＜ 0.05），見圖1B。

圖1 LSINCT5在胰腺癌組織和癌旁組織（A）及細胞株（B）中表達Fig.1 Expression of LSINCT5 in pancreatic cancer tissues and adjacent tissues（A）and cell lines（B）

2.2 川陳皮素對胰腺癌細胞增殖能力的影響觀察川陳皮素對胰腺癌細胞增殖的影響，運用CCK-8法檢測川陳皮素不同濃度（40、80、160、320 μmol/L）對胰腺癌細胞株MIAPaCa-2和PANC1干預(yù)后，MIAPaCa-2增殖能力分別為（82.41±9.13）、（63.32±7.72）、（33.34 ± 4.12），（17.13 ±1.64），空白組為（99.92±9.41）；PANC1增殖能力分別為（77.14±8.91）、（59.12 ± 7.23）、（39.61 ± 4.54），（16.12 ± 1.93），空白組為（99.75±9.22），川陳皮素分別作用MIAPaCa-2和PANC1細胞48 h后，與空白對照組相比，兩組胰腺癌細胞株活力均受到不同程度的抑制（圖2A、圖2B）。川陳皮素的濃度為160 μmol/L時，對兩種細胞株的活力抑制作用超過40%，因此，選擇濃度為160 μmol/L的川陳皮素進行后續(xù)研究。

2.3 微陣列芯片篩選川陳皮素干預(yù)后，細胞中表達差異最大的LncRNA采用微陣列芯片分析川陳皮素干預(yù)胰腺癌細胞株后，細胞內(nèi)LncRNAs的表達譜變化情況。結(jié)果如圖3A所示，在MIAPaCa-2胰腺癌細胞中加入160 μmol/L川陳皮素處理48 h后，21個LncRNA表達上調(diào)（表達差異＞2倍），19個LncRNA表達下調(diào)（表達差異＞2倍），見圖3B。其中，LncRNA LSINCT5表達下調(diào)的變化最為明顯。接下來采用RT-PCR對微陣列芯片的結(jié)果進行進一步驗證，結(jié)果顯示160 μmol/L川陳皮素分別干預(yù)MIAPaCa-2和PANC1細胞48 h后，MIAPaCa-2和PANC1中LSINCT5表達分別為（0.42±0.06）、（0.32±0.05），與未加藥組（0.99±0.09）相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖3C。結(jié)果提示在川陳皮素的作用下，LSINCT5表達明顯下調(diào)，有可能作為致癌調(diào)節(jié)因子參與調(diào)節(jié)胰腺癌的細胞生物學功能。

圖2 川陳皮素對胰腺癌細胞株MIAPaCa-2（A）和PANC1（B）活力的影響Fig.2 Effects of nobiletin on the activity of pancreatic cancer cell line MIAPaCa-2（A）and PANC1（B）

圖3 川陳皮素對胰腺癌細胞株中LncRNA表達影響（A和B）和細胞株中（C）LSINCT5表達的影響Fig.3 Effects of nobiletin on LncRNA expression in pancreatic cancer cell lines（A and B）and LSINCT5 expression in cell lines（C）

2.4 LSINCT5促進胰腺癌細胞增殖筆者運用RNA干擾的方法，合成LSINCT5的干擾序列抑制其表達，觀察LSINCT5對胰腺癌細胞增殖的影響。CCK-8實驗結(jié)果如圖4A顯示，抑制LSINCT5表達后，MIAPaCa-2和PANC1細胞活力顯著降低，與對照組si-NC相比，在72 h和96 h時差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。集落形成實驗結(jié)果如圖4B顯示，將si-LSINCT5轉(zhuǎn)染進入MIAPaCa-2和PANC1細胞48 h后，兩種胰腺癌細胞株分別為（0.42± 0.06）、（0.32± 0.05）mm2，菌落數(shù)量均明顯減少，與si-NC組（0.98±0.08）mm2相比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖4 LSINCT5對胰腺癌細胞株增殖能力的影響Fig.4 Effect of LSINCT5 on the proliferation of pancreatic cancer cell lines

2.5 LSINCT5促進胰腺癌細胞周期進展將LSINCT5干擾序列及對應(yīng)的si-NC序列分別轉(zhuǎn)染進MIAPaCa-2和PANC1細胞株后，提取細胞總RNA后，進行微陣列芯片分析。結(jié)果如圖5A所示，與si-NC組相比較，轉(zhuǎn)染LSINCT5干擾序列的細胞中，有20個與細胞周期相關(guān)的基因表達出現(xiàn)異常（表達差異＞2倍）。其中，14個基因表達下調(diào)，6個基因表達上調(diào)。因此，接下來筆者采用流式細胞術(shù)檢測LSINCT5對胰腺癌細胞細胞周期進展的影響情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染LSINCT5干擾序列后，MIAPaCa-2處于G0/G1期細胞數(shù)量為（78.11±9.15）%，與si-NC組（58.15±6.19）%比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；PANC1處于G0/G1期細胞數(shù)量為（74.19±8.51）%，與si-NC組（55.18±6.22%）比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖5B、5C。結(jié)果提示，LSINCT5誘導腫瘤細胞增殖可能與其刺激細胞周期進展、促進G1期向S期轉(zhuǎn)移相關(guān)。

2.6 LSINCT5調(diào)節(jié)細胞周期關(guān)鍵因子的蛋白表達水平上述結(jié)果提示LSINCT5對腫瘤細胞的細胞周期進展有顯著地促進作用，本部分采用Western Blot和RT-PCR的方法檢測LSINCT5對細胞周期關(guān)鍵因子Cyclin B1、CyclinE和P21表達影響，明確LSINCT5對細胞周期影響的內(nèi)在機制。結(jié)果如圖6顯示，將LSINCT5干擾序列轉(zhuǎn)染進入MIAPaCa-2和PANC1細胞48 h后，細胞周期關(guān)鍵因子CyclinB1、CyclinE的mRNA和蛋白表達均顯著降低，P21的mRNA和蛋白表達均升高，與si-NC相比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果提示，LSINCT5直接或間接的影響細胞周期相關(guān)蛋白的mRNA和蛋白表達，進一步明確了LSINCT5對腫瘤細胞的細胞周期促進作用潛在可能機制。

2.7 川陳皮素抑制胰腺癌細胞增殖與LSINCT5明顯相關(guān)上述結(jié)果提示LSINCT5促進胰腺癌細胞增殖，川陳皮素對胰腺癌細胞增殖有明顯的抑制作用，并且胰腺癌細胞經(jīng)過川陳皮素干預(yù)后，LSINCT5的表達降低，下一步探究LSINCT5是否作為關(guān)鍵因素參與川陳皮素的抑瘤作用。結(jié)果顯示，川陳皮素160 μmol/L干預(yù)MIAPaCa-2和PANC1細胞48 h后，si-NC組兩種細胞的增殖能力明顯受到抑制（圖7A），且細胞中LSINCT5表達均顯著降低（圖7B），與未加川陳皮素干預(yù)組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。但是川陳皮素干預(yù)48 h后，si-LSINCT5組兩種細胞的細胞活力沒有受到顯著抑制（圖7C、D），LSINCT5的表達變化也不明顯（圖7E）。結(jié)果表明，抑制LSINCT5表達后，川陳皮素對胰腺癌細胞增殖的抑制作用明顯減弱。

圖5 LSINCT5對胰腺癌細胞周期的微陣列芯片分析（A）和細胞株（B和C）細胞周期的影響Fig.5 Effects of LSINCT5 on cell cycle by microarray chip analysis（A）and on pancreatic cancer cell lines and（B and C）

圖6 LSINCT5對細胞周期關(guān)鍵因子蛋白質(zhì)表達（A和C）和mRNA表達（B和D）的影響Fig.6 Effects of LSINCT5 on protein expression levels（A and C）and mRNA expression levels（B and D）of key cell cycle factors

3 討論

圖7 川陳皮素對胰腺癌細胞增殖的影響及與LSINCT5的關(guān)系Fig.7 Effect of nobiletin on the proliferation of pancreatic cancer cells and its relationship with LSINCT5

LncRNA對細胞多個環(huán)節(jié)的生物學過程中所展現(xiàn)的調(diào)節(jié)功能逐漸受到醫(yī)學研究者的關(guān)注，包括細胞分化、細胞周期、分子支架、DNA甲基化/去甲基化平衡、轉(zhuǎn)錄基因沉默等［13-17］。研究［18］顯示，LncRNA在不同的腫瘤組織和腫瘤細胞株中表達出現(xiàn)異常，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA LSINCT5的表達量在正常細胞和胰腺癌細胞中表達量具有顯著差異，隨后的功能研究揭示LSINCT5能夠促進胰腺癌細胞增殖、提升細胞活力、刺激細胞周期進展，在胰腺癌中可能起到促癌因子的作用。與LONG等［19］在乳腺癌和宮頸癌中的研究結(jié)論相一致。

LncRNAs在調(diào)控抑癌基因或者促癌基因表達中發(fā)揮了重要作用，可作為腫瘤診斷、治療方案選擇和預(yù)后判斷等的重要分子標記物［20］。LncRNAs在中藥單體防治癌癥過程中是否發(fā)揮作用值得探討。本研究首先采用川陳皮素干預(yù)胰腺癌細胞株MIAPaCa-2和PANC1，篩選出最佳的藥物作用濃度及表達量變化最明顯的長鏈非編碼RNA。微陣列芯片發(fā)現(xiàn)川陳皮素干預(yù)后，多個LncRNAs的表達發(fā)生變化，其中以LSINCT5表達變化最為明顯。為了進一步探明LSINCT5在川陳皮素抑制胰腺癌細胞增殖中的作用，筆者加入si-LSINCT5阻斷其表達豐度，發(fā)現(xiàn)川陳皮素對腫瘤細胞的抑制作用明顯降低。因此，筆者推測川陳皮素抑制胰腺癌細胞增殖和LSINCT5明顯相關(guān)。

由于胰腺癌細胞中LSINCT5在川陳皮素處理后，表達下調(diào)最為明顯，其潛在機制與細胞生物學功能相關(guān)，功能研究表明抑制LSINCT5表達能夠明顯導致細胞周期阻滯，處于G0/G1期的細胞百分比顯著增加。進一步采用Western Blot和RT-PCR檢測抑制LSINCT5表達后，細胞周期變化相關(guān)基因表達水平變化，發(fā)現(xiàn)CyclinB1、CyclinE的mRNA和蛋白質(zhì)表達均顯著降低，P21的mRNA和蛋白質(zhì)表達均升高。LSINCT5調(diào)節(jié)胰腺癌細胞增殖機制可能與細胞周期進展有關(guān)，涉及到調(diào)控G1、S和M期進展關(guān)鍵基因表達水平，與魏等在黑色素瘤中的研究結(jié)論相似［21］。

綜上所述，本研究首次報道LSINCT5調(diào)節(jié)胰腺癌細胞多個功能，包括促進細胞增殖、刺激細胞周期進展，LSINCT5可作為重要的促癌調(diào)節(jié)因子，可能是一個有效的治療胰腺癌的分子靶點；筆者還發(fā)現(xiàn)川陳皮素通過調(diào)控LSINCT5表達抑制胰腺癌細胞增殖和細胞活力，進而阻滯細胞周期，發(fā)揮抗腫瘤作用；為尋找有效的靶向作用LSINCT5的抑制劑或者天然抗腫瘤中藥提供了新思路，為胰腺癌的防治提供新的途徑和策略。本研究的不足之處未在體內(nèi)研究LSINCT5在胰腺癌中的功能，后續(xù)筆者將采用實驗動物模型進一步驗證LSINCT5的功能及川陳皮素抗腫瘤的新機制及途徑。