動物源性食品大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留檢測樣品前處理技術(shù)研究綜述

劉彥釗，張麗麗

(河南質(zhì)量工程職業(yè)學(xué)院 食品與化工系, 河南 平頂山 467000)

大環(huán)內(nèi)酯類(Macrolides)抗生素[1]是一類因具有14～16碳內(nèi)酯環(huán)化學(xué)結(jié)構(gòu)而得名的抗生素.一代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素由于副作用大，目前使用相對較少.20世紀(jì)70年代先后問世的羅紅霉素、克拉霉素、氟紅霉素、阿奇霉素等第二代半合成藥物，與第一代比較，具有抗菌譜廣、生物利用度高、對酸穩(wěn)定、不良反應(yīng)少、抗菌后效應(yīng)明顯等優(yōu)點.由于耐藥菌的不斷出現(xiàn)，不易耐藥的酮基大環(huán)內(nèi)酯類第三代藥物，如泰利霉素、喹紅霉素已經(jīng)上市，其結(jié)構(gòu)由大環(huán)內(nèi)酯類抗生素衍生而來，耐酸且抗菌作用增強(qiáng)，耐藥性低.以泰地羅新、泰拉菌素、加米霉素為代表的大環(huán)內(nèi)酯類第四代抗生素也已進(jìn)入市場，此類抗生素特點為藥效時間長，只適用于飼養(yǎng)周期長的牛、豬等大牲畜.畜牧業(yè)專用的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素品種如利菌沙、泰樂菌素、乙酰螺旋霉素、替米考星和托拉霉素等應(yīng)用非常廣泛[2].

1 樣品前處理技術(shù)研究意義

隨著大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在畜牧業(yè)中的廣泛使用，不可避免地在飼養(yǎng)的動物體內(nèi)殘留，導(dǎo)致食物品質(zhì)下降，更隨食物鏈進(jìn)入人體后對敏感體質(zhì)人群造成各種不良反應(yīng)[3-5].我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、國家衛(wèi)生健康委員會和國家市場監(jiān)督管理總局2019年第114號公告頒布了國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》(GB31650-2019)，該標(biāo)準(zhǔn)已于2020年4月1日起正式實施，在該標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了紅霉素、吉他霉素、螺旋霉素等多種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在牛、羊、豬、雞等不同動物的肌肉、脂肪、肝、腎等不同組織中的最大殘留限量(MRL) ；同時頒布的國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(GB31660.1-2019)則制定了水產(chǎn)品中竹桃霉素、紅霉素、克拉霉素等9種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法.研究動物源性食品大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留檢測方法，一方面可以為國家制定與完善相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)提供參考，另一方面對保障動物源性食品安全、保護(hù)人民大眾生命健康具有重要意義.

目前大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢測方法基本采用高效液相色譜法(HPLC)或高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)，這些方法中采用的檢測儀器均具有卓越的靈敏度、高性能和高可靠性等特點；而動物性食品如肌肉組織、禽蛋、動物內(nèi)臟、脂肪等樣品成分復(fù)雜，導(dǎo)致樣品中抗生素分離過程的干擾因素多、雜質(zhì)去除難，需要深入研究樣品前處理技術(shù)，以期能夠快速、準(zhǔn)確地對樣品中殘留的抗生素進(jìn)行提取、富集，所以樣品前處理是動物源性食品大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留檢測工作非常重要的基礎(chǔ)性工作.樣品前處理技術(shù)在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留分析中不僅最費時、費力、成本高，其效果好壞直接影響到方法的檢測限和分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，而且還影響到分析儀器的工作壽命.本文綜述了國內(nèi)外近年動物源性食品大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留檢測前處理技術(shù)的相關(guān)文獻(xiàn)，擬為進(jìn)一步研究和開發(fā)快速、便捷、高效的前處理方法提供依據(jù).

2 樣品前處理技術(shù)研究綜述

樣品的前處理一般包括從樣品中提取殘留抗生素、濃縮提取液和去除提取液中干擾性雜質(zhì)的分離凈化等步驟，其目的是使樣品經(jīng)處理后更適合分析儀器測定的要求，以提高分析的速度、效率、準(zhǔn)確度、靈敏度和精密度.目前常見的樣品前處理技術(shù)有液-液萃取(liquid-liquid extraction, LLE) 、加壓液體萃取(pressurized liquid extraction, PLE)、微波輔助萃取(microwave-assistcd extraction，MAE)、超聲波輔助萃取(ultrasound assisted extraction，UAE)、固相萃取(solid phase extraction，SPE) 、磁固相萃取(magnetic solid phase extraction，MSPE)、在線固相萃取(online SPE)、分子印跡固相萃取法(molecularly imprinted solid phase extraction，MISPE)、 QuEChERS (quick，easy，cheap，effective，rugged，safe)等.

2.1 液-液萃取法

液-液萃取法[6]利用相似相溶原理，將一種或多種混溶的溶劑(即萃取劑)加入與之互不相溶的待測溶液中，通過振搖，靜置或離心分層，將目標(biāo)化合物轉(zhuǎn)移到萃取劑而實現(xiàn)組分分離的樣品處理方法.又稱為溶劑萃取.王浩等[7]建立了液相色譜-質(zhì)譜測定牛奶中包含大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在內(nèi)的5類35種抗生素殘留的檢測方法，在Mcllvaine緩沖液的作用下，使用乙腈對抗生素進(jìn)行提取，35種化合物的檢出限均低于10.0 μg/kg,方法回收率可達(dá)70.1%～109.9%.液-液萃取法成本低、操作簡單，但是步驟繁瑣耗時，有機(jī)溶劑用量大且具毒性，不利于健康環(huán)保，在樣品干擾物質(zhì)含量較高時萃取效果不理想.

2.2 加壓液體萃取法

加壓液體萃取技術(shù)[8]是一種將高溫高壓條件與液體溶劑相結(jié)合來實現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物快速高效萃取的方法.與其他萃取方法相比，加壓液體萃取是一種相對快速的操作過程，易于自動化并且溶劑消耗較低.EZZARIAI等[9]建立了使用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UHPLC/MS)測定源自污水污泥、棕櫚廢料和草的混合物的堆肥中的大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和氟喹諾酮類抗生素殘留的一種快速分析方法，使用加壓液體萃取法從堆肥中提取抗生素，最終測得羅紅霉素、金霉素、土霉素、依諾沙星和環(huán)丙沙星的回收率分別為24%～30%、53%～93%、33%～57%、69%～135%和100%～171%，效果令人滿意.

2.3 微波輔助萃取法

微波輔助萃取[10]是指在微波作用下大大加快萃取速率的一種萃取方法.具體做法是將固體樣品和有機(jī)溶劑加入到密閉容器中，讓樣品和萃取溶劑充分接觸，然后用微波加熱，使待測物在高溫條件下被提取到有機(jī)溶劑中，加熱的過程中可以通過調(diào)節(jié)微波加熱的參數(shù)對目標(biāo)物進(jìn)行選擇性萃取.用這種方法處理樣品的優(yōu)點是能在短時間內(nèi)完成多種組分的萃取、萃取溶劑的用量少、重現(xiàn)性好、回收率高、易于實現(xiàn)自動化操作，是一種環(huán)境友好的樣品前處理方法.這種技術(shù)是1986年由匈牙利學(xué)者GANZLER等[11]提出的，微波輔助萃取具有設(shè)備簡單、適用范圍廣、萃取效率高、重現(xiàn)性好、節(jié)省時間、節(jié)省試劑、污染小等特點，表現(xiàn)出良好的發(fā)展前景和巨大的應(yīng)用潛力.

ZHANG等[12]開發(fā)了一種可同時檢測魚肉中包含紅霉素、克林霉素、泰樂菌素、替米考星、羅紅霉素5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在內(nèi)的54種藥物的微波輔助萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，在最佳合成和提取條件下，檢出限和定量限分別為0.01～0.50 μg/kg和0.05～2.00 μg/kg，回收率56.3%～119.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0.3%～17.1%，萃取過程需12 min，該法簡單、快速、環(huán)保、基質(zhì)干擾小、富集系數(shù)高.

2.4 超聲波輔助萃取法

超聲波輔助萃取[13]是利用超聲波輻射壓強(qiáng)產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化效應(yīng)、機(jī)械振動、擾動效應(yīng)、高加速度、乳化、擴(kuò)散、擊碎和攪拌作用等多級效應(yīng)，增大物質(zhì)分子運(yùn)動頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而加速目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑，促進(jìn)提取的進(jìn)行.超聲波對固體樣品的預(yù)處理很有利，它促進(jìn)和加速了提取過程，如分散、均化、霧化、洗滌和衍生過程，而且還可避免高溫對目標(biāo)成分的破壞，方法操作簡單，副產(chǎn)品少，目標(biāo)物易分離，能達(dá)到比常規(guī)提取更理想的結(jié)果.

LORENZETTI等[14]建立了一種反相超聲輔助萃取-電泳分析法測定雞脂肪樣品中的大環(huán)內(nèi)酯抗生素的方法，該法在35～200 μg/kg范圍內(nèi)線性良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于13%，替米考星和泰樂霉素的定量限分別為17.4～55.0 μg/kg和22.1～47.0 μg/kg，回收率為73%～117%.

2.5 固相萃取法

固相萃取法[15]是復(fù)雜樣品前處理領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的一種技術(shù)，它能快速、簡便、有效地除去各類樣品中的雜質(zhì)組分，并達(dá)到對待測組分分離和濃集的目的，大大縮短了樣品的制備時間，克服了傳統(tǒng)液-液萃取法耗時長、所需樣品量大、易乳化、分離效果不佳等缺點，且隨著該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，SPE技術(shù)實現(xiàn)了自動化操作，便于處理大規(guī)模樣品，在大批量樣品的分析工作中應(yīng)用越來越多.

王一涵等[16]建立了固相萃取凈化/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定豬肉中14種大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留的方法，樣品先使用乙腈溶液提取，再使用固相萃取富集，14種抗生素的回收率均在71.1%～102%之間，方法準(zhǔn)確可靠.CHEN等[17]自建了多孔芳香族骨架(PAF)，并使用該骨架作為固相萃取劑建立了一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)測定雞肉樣品中的6種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢測方法.在優(yōu)化的條件下，該法對6種抗生素檢出限為0.2～0.5 μg/kg，回收率為82.1%～101.4%，在食品安全分析和監(jiān)測中具有測定大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的潛力.徐潔等[18]建立了Oasis HLB固相萃取小柱萃取(SPE)、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)同時測定水中5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(羅紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素、螺旋霉素和泰樂菌素)的分析方法，回收率在64.8%～90.8%之間，儀器檢出限為0.012～0.085 μg/L，定量限為0.041～0.285 μg/L.

2.6 磁固相萃取法

磁固相萃取[19]是基于磁性納米顆粒(MNPs)為固相吸附材料的一種前處理技術(shù).該法具有富集倍數(shù)高、檢出限低、線性范圍寬、樣品通量高和良好的抗干擾能力等特點，適合分析復(fù)雜基質(zhì)樣品中的痕量或超痕量抗生素殘留.

秦?zé)頪20]采用堿性溶液中共沉淀的方法制備了一種磁性石墨烯(G-Fe3O4)納米材料，并將該磁性固相萃取劑用于水產(chǎn)品前處理，建立了水產(chǎn)品中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素HPLC-MS/MS殘留檢測方法，檢出限0.41～0.52 μg/kg，定量限1.25～1.65 μg/kg，平均回收率為87.4%～98.2%，日內(nèi)、日間精密度均小于8.5%.

2.7 在線固相萃取法

在線固相萃取技術(shù)[21]是一種新出現(xiàn)的前處理技術(shù)，此類裝置通過一個六通閥將萃取裝置和樣品分析裝置連接，通過六通閥的切換，依次進(jìn)行樣品前處理和分析過程.近年來，在線固相萃取技術(shù)開始被應(yīng)用于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素檢測的前處理.相對于一般的固相萃取法，在線固相萃取法具有固萃小柱可重復(fù)利用、洗脫有機(jī)溶劑耗量低、樣品降解量低、自動化程度高、可早期預(yù)警和在線監(jiān)測等優(yōu)點.張曉光等[22]建立了在線固相萃取凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測豬肉中10種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留的方法，樣品提取后使用在線固相萃取柱(HLB柱)富集凈化，回收率為69.6%～115.2%，檢出限0.05～0.30 μg/kg，定量限0.10～1.00 μg/kg.

2.8 分子印跡固相萃取法

分子印跡固相萃取法[23-24]是以分子印跡聚合物作為固相萃取的填料，分子印跡固相萃取具體操作和傳統(tǒng)固相萃取類似，主要包括柱子預(yù)處理、上樣、淋洗和洗脫等步驟.該法克服了傳統(tǒng)固相萃取技術(shù)特異性差等缺點，與免疫吸附材料具有相似的選擇性，而且具有制備簡單、穩(wěn)定性好和可重復(fù)使用等優(yōu)點.

SONG等[25]以甲基丙烯酸為功能單體，通過沉淀聚合法合成了特定類別的大環(huán)內(nèi)酯分子印跡聚合物，該聚合物對于側(cè)鏈具有不同空間排列以及不同內(nèi)酯環(huán)大小的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，顯示出不同的比吸附和印跡因子，在分子印跡聚合物固相萃取的基礎(chǔ)上，建立了一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定豬肉中七種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留的快速、選擇性、重現(xiàn)性好的方法，加標(biāo)濃度為5、10、25、100 μg/ kg時，七種大環(huán)內(nèi)酯類化合物的平均回收率在68.6%至95.5%之間，日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于8%.檢出限和定量限分別為0.2～0.5和0.5～2.0 μg/ kg.

JI等[26]使用螺旋霉素作為模板，甲基丙烯酸作為功能性單體以及中孔MCM-41作為載體來制備了一種中空多孔分子印跡聚合物，在此基礎(chǔ)上建立了一種HPLC-MS/MS同時測定阿奇霉素等七種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢測方法，回收率88.0%～117%，檢出限低至3～17 ng/kg，表明該方法即使從復(fù)雜基質(zhì)中選擇性提取大環(huán)內(nèi)酯類藥物也具有優(yōu)勢.

洪月琴[27]以沉淀聚合方式制備以紅霉素(ERY)和泰樂菌素(TYL)為模板,甲基丙烯酸(MAA)為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)為交聯(lián)劑的復(fù)合模板分子印跡聚合物(MIP)，使用該分子印跡聚合物制作了MISPE分子印跡固相萃取柱，對樣品進(jìn)行前處理后采用毛細(xì)管電泳檢測了替米考星、紅霉素、克拉霉素、羅紅霉素、泰樂菌素5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的殘留量，回收率為75.3%～94.2%，富集倍數(shù)達(dá)2 825～4 540倍，檢出限達(dá)到0.3～0.8 μg/L，因此制作的MISPE柱可以應(yīng)用于牛奶樣品的富集和凈化前處理中.李愛蕓等[28]以替米考星為模板分子、甲基丙烯酸為功能單體合成了替米考星分子印跡聚合物，并用該聚合物作為填料制成分子軌跡固相萃取槍頭，對蜂蜜樣品中的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進(jìn)行前處理后，采用高效液相色譜法進(jìn)行分離檢測，檢出限和定量限分別為 14.2～71.6 μg/kg，回收率為 90%～110%.

2.9 QuEChERS法

QuEChERS 法[29]是Quick(快速)、Easy(簡單)、Cheap(便宜)、Effective(有效)、Rugged(可靠/耐用)和Safe(安全)的縮寫，是一種集以上優(yōu)勢于一身的樣品前處理技術(shù).QuEChERS實質(zhì)是振蕩法萃取、液液萃取法初步凈化、基質(zhì)分散固相萃取凈化相組成所形成的一種樣品前處理方法.衍生方法后有超聲萃取、凝膠滲透色譜萃取等.一般從萃取溶劑、萃取方式、鹽析劑和凈化劑的選擇等方面考慮QuEChERS技術(shù)在具體檢測方法中的應(yīng)用.該方法減少了溶劑及其他材料的使用，縮短了分析時間和成本，極大地滿足了現(xiàn)代實驗室的需求.

ZHOU等[30]采用一種改進(jìn)的快速、簡便、廉價、有效、穩(wěn)定、安全的提取方法(QuEChERS)進(jìn)行樣品前處理，該方法采用反應(yīng)曲面法(RSM)優(yōu)化，建立了QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(QuEChERS-HPLC-MS/MS)同時分析牛奶中16種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素和4種代謝物殘留量的檢測方法，回收率62.27%～115.28%，16種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素及4種代謝物在1～100 μg/L濃度范圍內(nèi)均能檢測到，所有分析物的檢出限和定量限分別為0.30～0.85 μg/kg 和1.1～4.0 μg/kg，日內(nèi)和日間精度分別低于10%和15% ，該方法可應(yīng)用于不同乳制品中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素及其代謝物的篩選.

汪建妹等[31]建立了QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(QuEChERS-UPLC-MS/MS)同時測定有機(jī)肥中磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類46種抗生素的分析方法.46種抗生素在1～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.996 6～0.999 9，在25、100、400 μg/kg加標(biāo)濃度下，3類抗生素的回收率分別為67.8%～95.6%、65.6%～89.4%和66.6%～107.8%.

3 結(jié)論與展望

動物源性食品大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留的特點是殘留水平低，樣品基質(zhì)復(fù)雜，干擾物質(zhì)多，不易從樣品中分離、提純.這就對樣品進(jìn)行凈化和富集的前處理過程提出了很高的要求.樣品前處理的結(jié)果將直接關(guān)系著整個檢測的準(zhǔn)確度與精密度.因而，有必要發(fā)展一種快速、靈敏、高效的樣品前處理技術(shù).

傳統(tǒng)的前處理方法如液-液萃取等，操作繁瑣、周期長，需要使用大量的有機(jī)溶劑，對操作者的身體健康和環(huán)境帶來了不利影響.

固相萃取法(SPE)常采用一次性使用的可棄小柱，其填料一般為專門為樣品處理設(shè)計的吸附劑，填料量相對較少，節(jié)省時間和溶劑，可以凈化很小體積的樣品，并且處理過程中不會產(chǎn)生乳化現(xiàn)象.而一般的SPE法的吸附劑對不同種類的抗生素并沒有專一性，當(dāng)樣品成分復(fù)雜時易發(fā)生共萃取而難以滿足復(fù)雜組分的分析要求.

分子印跡固相萃取法(MISPE)則是將分子印跡技術(shù)應(yīng)用到固相萃取前處理過程中，通過開發(fā)具有特異選擇性的高效吸附劑，簡化了樣品前處理過程，縮短了分析時間，使分析方法進(jìn)一步精確可靠，MISPE將越來越廣泛地應(yīng)用于食品中大環(huán)內(nèi)酯抗生素的殘留檢測.

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留檢測的基質(zhì)樣品以動物源類基質(zhì)為主，如動物組織肉、肝、乳制品等，飼料為其次.QuEChERS法之所以在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留檢測領(lǐng)域迅速占有一席之地是因為其具有特殊的優(yōu)勢：可以根據(jù)不同基質(zhì)和不同獸藥的物理、化學(xué)性質(zhì)通過調(diào)整提取溶劑、pH、鹽類或稀釋劑等來適應(yīng)不同情況.QuEChERS對于高蛋白和基質(zhì)更復(fù)雜的樣品如肝臟等的應(yīng)用還比較有限，所測試的藥物也較有限.因此，開發(fā)新型的萃取劑和凈化劑，擴(kuò)大樣品前處理的范圍，QuEChERS必將在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留檢測領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用.