3β羥基類(lèi)固醇脫氫酶1和細(xì)胞色素P450 17A1在小鼠下丘腦內(nèi)的表達(dá)

賈俊濤， 李 強(qiáng)， 王 昆， 劉昊東， 海日汗， 范奎奎， 潘 登， 杜晨光,

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 內(nèi)蒙古包頭014109 ； 2.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所， 河北石家莊050000 ； 3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院， 內(nèi)蒙古呼和浩特010018)

下丘腦作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)調(diào)節(jié)內(nèi)臟活動(dòng)和內(nèi)分泌活動(dòng)的關(guān)鍵中樞，可對(duì)能量代謝及各類(lèi)激素的分泌發(fā)揮關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用[1]。類(lèi)固醇激素作為激素大家族中的一個(gè)分支，亦可在動(dòng)物體多種生理活動(dòng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用。例如，雌激素除可作用于生殖泌尿系統(tǒng)外亦可作用于神經(jīng)系統(tǒng)以及內(nèi)臟，發(fā)揮促進(jìn)生殖器官和性征的發(fā)育、能量代謝和神經(jīng)系統(tǒng)認(rèn)知功能的正常等作用。

目前在小鼠等哺乳動(dòng)物的研究中，鮮有報(bào)道研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)類(lèi)固醇激素的合成機(jī)制以及合成調(diào)節(jié)因子的表達(dá)分布?，F(xiàn)有研究?jī)H局限于睪丸、卵巢等性腺組織內(nèi)類(lèi)固醇激素的合成及作用[2]。類(lèi)固醇激素是由多種調(diào)節(jié)酶經(jīng)復(fù)雜的過(guò)程合成的，簡(jiǎn)言之，即類(lèi)固醇激素合成系統(tǒng)被激活后，作為合成前體的膽固醇經(jīng)類(lèi)固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)，從線粒體外膜轉(zhuǎn)移至內(nèi)膜，后經(jīng)包括3β羥基類(lèi)固醇脫氫酶1(3β-HSD1)和細(xì)胞色素P450 17A1(CYP17A1)等酶的作用逐步合成類(lèi)固醇激素[3]。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病及db/db小鼠模型均表現(xiàn)為類(lèi)固醇激素含量增加，并且是由于其合成調(diào)節(jié)因子的表達(dá)增多造成的[4]，但并未說(shuō)明中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控作用。因此，研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)類(lèi)固醇激素的合成機(jī)制對(duì)治療潛在的類(lèi)固醇激素相關(guān)疾病將具有重要意義。

本試驗(yàn)以C57BL/6小鼠下丘腦為試驗(yàn)材料，分別使用免疫熒光技術(shù)定位3β羥基類(lèi)固醇脫氫酶1(3β-HSD1)和細(xì)胞色素P450 17A1(CYP17A1)免疫陽(yáng)性熒光信號(hào)的分布,并使用Western Blot技術(shù)檢測(cè)3β-HSD1和CYP17A1蛋白在下丘腦內(nèi)的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57BL/6小鼠，購(gòu)自北京維通利華生物科技有限公司，經(jīng)自群繁育后，獲得適應(yīng)現(xiàn)有飼養(yǎng)條件的6～8周齡小鼠，最大程度減少環(huán)境應(yīng)激。試驗(yàn)藥品：標(biāo)準(zhǔn)驢血清白蛋白 (Jackson，NDS，071-000-121)；檸檬酸鈉(Sigma，1064325000)；磷酸鹽粉末(福州邁新,0060)；驢血清(Jackson,119842)；一抗：Rabbit Anti-3βHSD1(Abcam,ab65156),Rabbit Anti-CYP17A1 (Abcam,ab125022),GAPDH(Abcam,ab181602)；二抗：Alexa647 Donkey anti-Rabbit (Abcam,ab150075)，Goat-anti-rabbit IgG (Jackson)。試驗(yàn)儀器：恒溫孵育儀(Eppendorf ThermoMixerTMC)，灌注泵(SENZ,310D)，冰凍切片機(jī)(Lecia,CM1950)，激光共聚焦顯微鏡(Nikon Confocal C2)，酶標(biāo)儀(Bio-Tek,Synergy HT)。

1.2 組織獲取及處理 用于免疫熒光檢測(cè)的小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉徹底麻醉后，使用灌注泵(SENZ-210D)經(jīng)心肺以3.5 mL/min灌注3 min生理鹽水共約10 mL，后以5 mL/min灌注固定液(4%多聚甲醛，Sigma,158127，pH 7.4)40 min，共約200 mL， 隨后取其腦組織置于相應(yīng)固定液中固定過(guò)夜，修塊后轉(zhuǎn)移至30%蔗糖(VETEC,V900116)溶液中4 ℃脫水直至完全沉降。使用OCT包埋劑(SLEE,30001101)包埋后置于冰凍切片機(jī)(Lecia,CM1950)對(duì)腦組織冠狀面進(jìn)行連續(xù)切片，厚度為30 μm， 漂片法洗滌，4 ℃保存，并加入疊氮化鈉(NaN3)防腐。

用于Western Blot檢測(cè)的小鼠，經(jīng)斷頸處死，快速剖取下丘腦組織，凍存于-80 ℃。

1.3 免疫熒光 分別選取不同位置腦組織切片于4 ℃搖床上使用1% Triton(Sigma,T8787)+0.4% SDS(pH 8.70) 80 r/min預(yù)處理4 h。3% NDS(Jackson，071-000-121)室溫(29 ℃)封閉1 h，4 ℃過(guò)夜孵育一抗(3βHSD1，1∶200；CYP17A1，1∶200)、然后室溫孵育二抗(Alexa647，1∶2 000) 2 h。每步結(jié)束后用PBS清洗3次，每次10 min。然后將切片整齊的貼于載玻片，待其完全干燥后，使用激光共聚焦顯微鏡于647波段進(jìn)行掃描。

1.4 Western Blot 從-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)取出下丘腦組織，使用裂解液(CWBIO，RIPA Lysis Buffer，01408/60412)進(jìn)行蛋白提取。蛋白上清液按比例添加蛋白上樣緩沖液95 ℃變性10 min，蛋白經(jīng)5%～12% SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)印至NC膜(PALL，LOTT70983)上，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1 h，分別孵育一抗Rabbit-anti (3β-HSD1和CYP17A1，1∶1 000；GAPDH 1∶5 000)4 ℃搖床過(guò)夜，二抗Donkey anti-Rabbit IR800 (Jackson,LI-COR926-68022,1∶20 000)，室溫?fù)u床孵育2 h。應(yīng)用蛋白掃描儀成像檢測(cè)3β-HSD1和CYP17A1在下丘腦內(nèi)的蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 3β-HSD1神經(jīng)元在小鼠下丘腦內(nèi)的分布 3β-HSD1神經(jīng)元在小鼠下丘腦內(nèi)呈廣泛性表達(dá)，主要表達(dá)于下丘腦腹內(nèi)側(cè)核(VMH)、背外側(cè)核(DMH)、弓狀核(ARC)內(nèi)，見(jiàn)中插彩版圖1。

2.2 細(xì)胞色素P450 17A1神經(jīng)元在小鼠下丘腦內(nèi)的分布 細(xì)胞色素P450 17A1神經(jīng)元在小鼠下丘腦內(nèi)背外側(cè)核(DMH)和室旁核(PVN)分布，見(jiàn)中插彩版圖2。

2.3 蛋白3β-HSD1和CYP17A1在下丘腦的表達(dá) 3β-HSD1和CYP17A1在小鼠下丘腦內(nèi)的蛋白表達(dá)情況，見(jiàn)中插彩版圖3。

3 討論

下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)是一個(gè)復(fù)雜的神經(jīng)內(nèi)分泌反饋回路，控制各類(lèi)激素的分泌，如腎上腺糖皮質(zhì)激素。其功能的核心是下丘腦室旁核(PVN)，促皮質(zhì)激素釋放因子的神經(jīng)元表達(dá)于此[5]。下丘腦是生物機(jī)體內(nèi)重要的神經(jīng)內(nèi)分泌中樞，控制著機(jī)體眾多生理活動(dòng)。在下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)中，下丘腦分泌的促腎上腺激素釋放激素(CRH)調(diào)節(jié)腺垂體分泌促性腺激素，卵泡刺激素和黃體生成素，二者又可刺激性腺分泌性激素，如雌二醇(E2)和睪酮(T)，同時(shí)性激素又能對(duì)下丘腦的激素分泌發(fā)揮反饋性調(diào)節(jié)作用。因此性腺和下丘腦之間存在緊密的功能性聯(lián)系。同時(shí)，內(nèi)源性類(lèi)固醇，如雌激素和雄激素，在神經(jīng)系統(tǒng)中具有多種功能，包括對(duì)神經(jīng)元存活、增殖和突觸傳遞調(diào)節(jié)的影響。在出生后階段，哺乳動(dòng)物的性腺產(chǎn)生3組必需的類(lèi)固醇激素：孕激素(孕酮P4)、雌激素(雌激素E1和雌二醇E2)和雄激素(雄烯二酮A和睪酮T)。這些代謝產(chǎn)物由類(lèi)固醇生成途徑中的膽固醇產(chǎn)生，通過(guò)各種酶的活性合成[6-7]。3β羥基類(lèi)固醇脫氫酶1(3β-HSD1)和細(xì)胞色素P450 17A1(CYP17A1) 在孕酮和睪酮的合成中起重要作用，同時(shí)CYP19A1基因的產(chǎn)物亦參與雌激素和雌二醇的合成[8-9]。然而目前鮮有報(bào)道研究下丘腦內(nèi)性類(lèi)固醇激素合成關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的表達(dá)及相關(guān)合成機(jī)制，為此本試驗(yàn)針對(duì)類(lèi)固醇激素合成關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子(3β-HSD1和CYP17A1)在下丘腦內(nèi)的分布進(jìn)行定位，結(jié)果表明，3β-HSD1和CYP17A1在下丘腦內(nèi)的背外側(cè)核、腹內(nèi)側(cè)核、室旁核及弓狀核內(nèi)分布，根據(jù)以往研究報(bào)道猜測(cè)上述核團(tuán)內(nèi)3β-HSD1和CYP17A1在下丘腦調(diào)節(jié)激素分泌的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性調(diào)控作用。

3β-HSD1是膜結(jié)合酶，根據(jù)表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型分布于線粒體膜和微粒體膜。在過(guò)去的10年中，羥基類(lèi)固醇脫氫酶的多種亞型已被分離并在人、小鼠和大鼠體內(nèi)進(jìn)行了功能性研究[10-11]。3β-HSD1酶控制著類(lèi)固醇激素生物合成中的關(guān)鍵類(lèi)固醇生成反應(yīng)，參與糖皮質(zhì)激素、礦皮質(zhì)激素、孕酮、雄激素和雌激素在許多組織中的形成。產(chǎn)后卵巢由卵泡和黃體組成，它們具有特定的功能，并依賴(lài)于激素生成酶的差異表達(dá)，從而產(chǎn)生選擇性的激素[12]。在卵巢發(fā)育的早期階段檢測(cè)到3β-HSD1，以及睪丸激素的缺失，表明這種酶可能發(fā)揮不同的作用，可能參與產(chǎn)后階段產(chǎn)生類(lèi)固醇激素的體細(xì)胞系。另一方面，對(duì)一些可合成睪酮的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)表明，3β-HSD1可大量催化其他一些中間代謝物，如孕酮。

細(xì)胞色素P450 17A1 (CYP17A1)是人類(lèi)體內(nèi)一種極其重要的酶，催化所有內(nèi)源性雄激素的形成[13]。它是一種非典型的細(xì)胞色素P450酶，催化2種不同類(lèi)型的底物氧化。通過(guò)羥化酶活性，催化孕烯醇酮的17α-羥基化反應(yīng)生成17α-OH孕烯醇酮。隨后，通過(guò)其C17、C20裂解酶作用，進(jìn)一步將17α-OH孕烯醇酮轉(zhuǎn)化為雄激素脫氫表雄酮，是雄激素二酮、睪酮、雙氫睪酮的前體。通過(guò)幾十年的研究,目前已證實(shí)雄激素在前列腺癌等疾病中的重要性，睪丸外雄激素形成的發(fā)現(xiàn)有助于闡明該疾病的病理，特別是抗閹割性疾病[14]。因此，對(duì)CYP17A1的特異性抑制已成為一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，類(lèi)固醇合成調(diào)節(jié)因子3β-HSD1和CYP17A1分別在下丘腦內(nèi)側(cè)核(VMH)、背外側(cè)核(DMH)、弓狀核(ARC)以及室旁核(PVN)有陽(yáng)性神經(jīng)元分布。據(jù)報(bào)道，上述下丘腦核團(tuán)均涉及能量代謝及激素的分泌調(diào)節(jié)[15-16]。同時(shí)，類(lèi)固醇激素參與機(jī)體眾多穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，其中包括能量代謝和生殖調(diào)控[17-18]。以上結(jié)論為研究類(lèi)固醇激素在下丘腦內(nèi)的潛在作用提供形態(tài)學(xué)支持。

4 結(jié)論

綜上，類(lèi)固醇激素合成調(diào)節(jié)因子(3β-HSD1和CYP17A1)在下丘腦關(guān)鍵功能核團(tuán)的分布，以及其核團(tuán)的眾多調(diào)控作用。提示3β-HSD1和CYP17A1參與下丘腦涉及的能量代謝及激素分泌的功能活動(dòng)中，為進(jìn)一步研究下丘腦調(diào)控類(lèi)固醇激素的合成及分泌提供了參考數(shù)據(jù)。