原發(fā)性頭痛動物模型的建立及評價方法的研究進展

葉淑姿,肖芳

(中南大學湘雅公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生毒理學系,長沙 410078)

偏頭痛(migraine headache,MH)和緊張性頭痛(tension type headache,TTH)是原發(fā)性頭痛中最常見的兩種類型。其中MH是以自主神經(jīng)功能紊亂為特征,常伴有視物模糊、畏光、怕聲等視覺、感覺異常等癥狀[1]。TTH則是以額、顳及枕部輕度或中度疼痛為主的無搏動性鈍痛為特征,常伴有頭部肌群的痙攣性收縮及壓痛[2]。國際頭痛學會(International Headache Society,IHS)在2013年對頭痛疾病進行了科學分類[3],同時研究表明原發(fā)性頭痛與焦慮、抑郁等不良心理癥狀存在正相關[4]。2017年9月,《Lancet Neurology》報道截至2015年神經(jīng)系統(tǒng)疾病成為傷殘調(diào)整壽命年(disability adjusted life years,DALYs)的主要影響因素,分別占全球DALYs和死亡總?cè)丝诘?0.2%和16.8%,其中最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病即為MH和TTH[5]。目前原發(fā)性頭痛病因?qū)W研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病與遺傳因素、內(nèi)分泌因素、飲食因素,精神因素以及身體其他疼痛部位繼發(fā)相關,現(xiàn)有關于原發(fā)性頭痛的學說有血管源性學說[6]、皮層擴散性抑制學說[7]、三叉神經(jīng)血管學說[8]以及基因?qū)W說[9],然而其發(fā)病機制至今尚未完全闡明。建立動物疾病模型是探索人類疾病本質(zhì)及開發(fā)評價相應治療藥物的重要方法和手段。目前研究者們根據(jù)不同的病因?qū)W說理論建立了不同的原發(fā)性頭痛動物疾病模型,本文將通過綜述近年來MH和TTH的實驗動物疾病模型建立及評價方法的研究進展,分析不同原發(fā)性頭痛動物疾病模型的適用范圍及其優(yōu)缺點,為進一步研究原發(fā)性頭痛發(fā)病機制提供一定的理論基礎和依據(jù)。

1 MH動物模型

1.1 硝酸甘油(nitroglycerin,NTG)模型

1.1.1 NTG動物模型原理

NTG可使三叉神經(jīng)核尾部和中腦導水管周圍灰質(zhì)神經(jīng)元的興奮性增強[10],提高脊髓背角對傷害性信息的傳入反應,進而使支配腦膜的三叉神經(jīng)傳入支產(chǎn)生遲發(fā)和長效的痛覺敏化[11],降低痛覺的閾值。NTG是一氧化氮(nitric oxide,NO)的供體物質(zhì)之一,可刺激機體促使其血管平滑肌釋放NO引起顱內(nèi)外血管擴張產(chǎn)生頭痛[12],同時NO通過彌散作用活化鳥苷酸環(huán)化酶,可促使血管平滑肌松弛,導致顱內(nèi)外血管異常擴張繼而引發(fā)頭痛。此外,NO可以介導降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)等多種神經(jīng)肽的釋放,觸發(fā)神經(jīng)源性炎癥,參與MH發(fā)作[13]。

1.1.2 NTG動物模型的建立方法

NTG動物模型的建立方法包括NTG皮下注射[14]、靜脈注射[15]和腹腔注射[16],其中以腹腔注射的方法最為常用。根據(jù)MH發(fā)作時間的長短可分為急性MH和慢性MH,同時NTG動物模型也可根據(jù)不同的模型制備方法模擬人群的急、慢性MH。宋丹寧等[17]對220～260 g的成年雄性Wistar大鼠進行一次性臀部注射10 mg/kg NTG(5 mg/mL,含30%乙醇、30%丙二醇和水)建立急性NTG模型。制備慢性NTG模型的方法主要有以下三種。劉燕等[14]采用180～220 g的SD雄性大鼠,對其進行頸背部皮下注射NTG(10 mg/kg)造模,每周1次,連續(xù)3周。Pradhan等[18]用NTG注射液(5.0 mg/mL,用適量生理鹽水稀釋后,以10 mg/kg的劑量)對20～30 g雌雄各半的C57BL6/J小鼠進行腹腔注射,隔天1次,連續(xù)9 d,共5次。Sufka等[19]采用體重為250～330 g的SD大鼠,同時進行NTG的單次注射和重復注射(每三天1次,持續(xù)兩周,共5次)造模,根據(jù)國際頭痛疾病分類第三版(ICDH-3-Beta)診斷標準比較單次和重復注射NTG大鼠的行為終點。

1.1.3 NTG動物模型評價

NTG動物模型成功建立的評價標準主要包括行為學評價和生物學評價兩種。行為學觀察指標主要有造模后異常癥狀出現(xiàn)與消失的時間、單次注射NTG模型2 h內(nèi)單位時間內(nèi)撓頭、甩頭、爬籠的次數(shù)增加[19]、機械性痛覺和熱痛覺過敏(表現(xiàn)為機械痛閾和熱痛閾下降[1]),重復注射NTG的模型動物可出現(xiàn)壓力相關行為、活動度降低、畏光以及體重增量減少[19]。耳紅是該模型的特異性癥狀,通常在NTG注射2～3 min即可出現(xiàn),并持續(xù)3 h左右[20]。生物學指標可顯示注射NTG后,三叉神經(jīng)節(jié)、硬腦膜的誘導型一氧化氮合酶(inductive nitric oxide synthase,iNOS)和原癌基因c-fos的mRNA表達[21]水平較空白組明顯升高,中腦降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)基因表達也顯著上升[14]。

1.1.4 NTG動物模型的適用范圍及優(yōu)缺點

NTG動物模型制備中使用的動物易于獲得、制備方法簡單經(jīng)濟,且能在短時間內(nèi)大量復制,能觀察到動物在清醒狀態(tài)下的行為學改變。特別是慢性NTG模型的建立能有效模擬急性MH向慢性MH的轉(zhuǎn)變過程,其中畏光等癥狀符合ICDH-3-Beta偏頭痛的診斷標準,具有臨床同源性,可用于開發(fā)治療慢性MH的臨床藥物。但NTG動物模型的缺點在于其缺乏特異性,對顱內(nèi)血管起廣泛性作用,且全身反應也比較大。

1.2 皮層擴散性抑制(cortical spreading depression,CSD)模型

1.2.1 CSD動物模型原理

該動物模型是基于20世紀40年代Leao首次提出的CSD學說[22],該學說認為腦血流改變主要受神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控[23]。細胞內(nèi)外離子的動態(tài)平衡受到體內(nèi)外傷害性信息的影響,機體一旦接收到傷害性信息,便可產(chǎn)生一過性的去極化反應,出現(xiàn)MH先兆癥狀[24]。CSD是發(fā)生于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中傳播緩慢的去極化波,速率約為2～5 mm/min,持續(xù)約1 min,隨后出現(xiàn)數(shù)分鐘的腦電活動抑制[25]。此外,CSD也可使三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)(trigeminovascular system,TGVS)活化,進而導致腦膜中血流量增加以及血漿蛋白外滲[24]。

1.2.2 CSD動物模型的建立方法

CSD動物模型可由高K+、興奮性氨基酸(如N-甲基天冬氨酸,NMDA)、針刺或電刺激等因素誘發(fā)。石宏等[26]用高K+和電針針刺法誘導SD成年大鼠(體重為180～220 g),麻醉后進行股動脈插管并連接壓力傳感器,于腦立體定位儀固定,用PCLab生物信號采集系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測各生理參數(shù),保證其均在正常范圍內(nèi)。在保持硬腦膜完整的情況下,于顱頂開一個CSD的誘導窗口。電針組用電針針刺方法誘導產(chǎn)生CSD,在誘導窗口小孔內(nèi)進針并避開粗腦血管的位置;KCl誘導組則是將浸有3 mol/L KCl溶液的濾紙敷于小孔上,每10 min更換1次,持續(xù)1 h。也有報道如Kaufmann等[27]選取20～ 35 g的C57BL/6J小鼠,局部用KCl誘發(fā)CSD。

1.2.3 CSD動物模型評價

CSD動物模型的行為學觀察指標主要包括造模后異常癥狀出現(xiàn)與消失的時間、單位時間內(nèi)理毛、撓頭、舔爪、無目的咀嚼、轉(zhuǎn)向及甩頭動作等。僵直是CSD動物模型特異性行為,尤其是持續(xù)2～3 s的短暫性僵直[28]。有研究表明,注射NMDA 1 h內(nèi),可出現(xiàn)突然靜止不動的僵直行為。用內(nèi)源性成像方法可觀測動物發(fā)生僵直行為后腦電波的傳播圖像,也可用電生理的方法驗證模型是否成功建立[26]。由于CSD動物模型是可通過誘導神經(jīng)元泛通道連接蛋白(pannexin1,PANX1)去極化后通道開放,與活化的嘌呤能P2X7受體結(jié)合后形成P2X7-PANX1復合體,進而產(chǎn)生一系列生物學效應,最終引起MH。因此,生物學指標表現(xiàn)為PANX1下游信號通路的NO、P物質(zhì)、CGRP等遞質(zhì)的釋放以及原癌基因c-fos、神經(jīng)生長因子等表達的改變[29]。

1.2.4 CSD動物模型的適用范圍及優(yōu)缺點

此模型的MH發(fā)病機制與神經(jīng)學說基本吻合,其中興奮性氨基酸NMDA誘導造模法較為方便,手術創(chuàng)面小,造模成功率高,模型癥狀相似,重復性好。MH動物模型可模擬有先兆癥狀的MH,可用于研發(fā)先兆性MH治療的臨床藥物。上述針刺法和高K+法需在動物麻醉的狀況下進行,故無法觀察到CSD模型動物的行為學變化,且對操作技術要求高。

1.3 硬腦膜神經(jīng)炎癥模型

1.3.1 硬腦膜神經(jīng)炎癥動物模型原理

硬腦膜神經(jīng)炎癥動物模型是基于三叉神經(jīng)血管學說而建立的,通過研究痛覺傳導通路包括TGVS激活、敏化的重要作用進而探索MH的發(fā)病機制[30]。MH發(fā)生時,傷害性刺激信息通過三叉神經(jīng)節(jié)傳入,經(jīng)感覺神經(jīng)上行傳導系統(tǒng)傳入腦干、丘腦、皮質(zhì)等痛覺中樞,引發(fā)頭痛。與此同時,活化周圍神經(jīng)使其神經(jīng)末梢釋放血管活性促炎肽,如CGRP、P物質(zhì)、神經(jīng)激肽A(neurokinin A,NKA)等,進而引發(fā)血管擴張和MH癥狀[31]。

1.3.2 硬腦膜神經(jīng)炎癥動物模型的建立方法

目前,制備硬腦膜炎癥動物模型主要借助“炎癥湯”和辣椒素等化學刺激物以及電刺激硬腦膜來模擬。電刺激大鼠上矢狀竇區(qū)硬腦膜模型,實際就是刺激三叉神經(jīng)支配的硬腦膜血管系統(tǒng)及周邊部位,進而激活TGVS。TGVS的激活和敏化主要表現(xiàn)是CGRP釋放,神經(jīng)源性硬腦膜血管擴張,硬腦膜血漿蛋白滲出等[32]。吳蕾等將5～6周SD大鼠麻醉后固定于腦立體定位儀,暴露出矢狀縫、冠狀縫以及部分人字縫后鉆孔,垂直插入電極,單籠飼養(yǎng)適應性后第8天開始電刺激,每次2 h,連續(xù)3 d,電壓為3～5 V(電壓確定標準:大鼠隨電刺激出現(xiàn)節(jié)律性點頭或者顫動胡須)[32]。也可采用致炎劑刺激硬腦膜來建立硬腦膜神經(jīng)炎癥動物模型[33]。20世紀80年代,Moskowitz等[34]在實驗中發(fā)現(xiàn),電刺激三叉神經(jīng)節(jié)能夠引發(fā)無菌性腦膜炎。對SD大鼠進行每天1次,為期21 d的硬腦膜灌注“炎癥湯”和皮下注射苯甲酸利扎曲坦可建立大鼠藥物過量性頭痛動物模型(MOH)[35]。

1.3.3 硬腦膜神經(jīng)炎癥動物模型評價

面部機械痛閾值改變是硬腦膜神經(jīng)炎動物模型的特異性指標,因此可通過使用電子式機械測痛儀檢測模型動物痛閾變化情況來判斷模型是否建立成功。此外,硬腦膜神經(jīng)炎癥動物模型可見機械性痛覺過敏、行走距離減少、活動度增加、傷害性行為、焦慮和抑郁樣行為、谷氨酸與CGRP等行為和生物學改變。Vuralli等[36]在使用不同濃度的化學刺激物時,動物的行為學改變存在劑量依賴性,如行走距離減少,活動量增加,探索行為減少,且有研究表明雌性動物在更低的濃度下即可出現(xiàn)行為學改變[37]。MOH動物模型除了會出現(xiàn)以上硬腦膜神經(jīng)炎癥動物模型的相關表現(xiàn),還出現(xiàn)中腦導水管周圍灰質(zhì)Toll樣受體4(toll-like receptor4,TLR-4)的表達量升高[35]。

1.3.4 硬腦膜神經(jīng)炎癥動物模型的適用范圍及優(yōu)缺點

三叉神經(jīng)血管學說是目前較為完善的MH發(fā)病機制學說,具有一定的科學性和可行性,因此基于該學說的硬腦膜神經(jīng)炎動物模型成為實驗性MH動物模型的首選。然而該模型也存在不足之處,其使用的化學性刺激物可對血腦屏障造成損傷[38],引起慢性硬腦膜炎癥,直接引發(fā)頭痛而非該MH模型。而通過電刺激建立的上矢狀竇模型,由于建模過程中動物處于麻醉狀態(tài),因此無法進行行為學觀察。此外,該模型的建立對實驗室和實驗人員的手術操作方法技術要求高,不易在短時間內(nèi)大量復制。

1.4 轉(zhuǎn)基因MH動物模型

轉(zhuǎn)基因MH動物模型是基于MH的一種罕見的常染色體顯性遺傳性疾病家族性偏癱型偏頭痛(familial hemiplegic migraine,FHM)。FHM包括有3種亞型:FHM1型、FHM2型和FHM3型。其中的FHM1型是由編碼Ca2+通道的CACNA1A基因發(fā)生了突變[39],FHM2型是由于編碼Na+-K+-ATP酶的ATP1A2基因發(fā)生了突變[39],而FHM3型是由于編碼神經(jīng)元電壓門控Na+通道的α1亞基的SCNA1A基因發(fā)生了突變[40]。將CACNA1A基因中的點突變基因R192Q[41-43]和S218L[44-45]分別轉(zhuǎn)入嚙齒類動物的基因中,插入R192Q突變基因的小鼠整體神經(jīng)興奮性增加,Ca2+通道功能增強,三叉神經(jīng)血管中的CGRP受體敏感性降低[43],具有S218L突變基因的小鼠表現(xiàn)出更弱的Ca2+相關去極化的電流強度,更強的CSD敏感性,且存在MH發(fā)生的臨床同源性癥狀,如自發(fā)性畏光等[45]。

1.4.1 轉(zhuǎn)基因MH動物模型的建立方法

該動物模型采用胚胎干細胞同源重組的方法,人為將MH相關的基因?qū)雵X類動物[46]。研究者[46]通過同源重組的方法在小鼠的同源基因CACNA1A的相應位置引入人類的R192Q突變基因,編碼Cav2.1α1亞基。嵌合小鼠出生并通過生殖系傳遞R192Q KI+NEO等位基因,接著將該嵌合小鼠與腺病毒EIIA早期啟動子控制下表達Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠進行雜交去除NEO基因,不斷雜交使雜合子純化成R192Q KI小鼠。純合子R192Q KI小鼠無明顯表型,通過Southern印跡分析來證實R192Q KI純合小鼠的正確同源重組。隨后又將S218L突變基因?qū)胄∈驝ACNA1A基因,通過表型、分子和電生理結(jié)果分析,探討S218L綜合征的發(fā)病機制[45]。

1.4.2 轉(zhuǎn)基因MH動物模型評價

該動物模型通過使用基因靶向方法人為將MH相關的基因轉(zhuǎn)入嚙齒類動物,可導致一些離子通道改變,皮層谷氨酸能神經(jīng)傳遞和CSD易感性發(fā)生改變[43],因此可采用與CSD模型相同的檢測評價方式,如電生理,表型和分子等進行分析。轉(zhuǎn)基因MH動物模型麻醉后打開顱骨進行活體觀察可見小鼠硬腦膜血管擴張,離體三叉神經(jīng)節(jié)尾核,三叉神經(jīng)節(jié)和硬腦膜中的CGRP含量升高[43]。

1.4.3 轉(zhuǎn)基因MH動物模型的適用范圍及優(yōu)缺點

轉(zhuǎn)基因小鼠由于生存繁殖等原因,無法短期內(nèi)進行大量復制,且FHM的發(fā)病機制與一般MH的發(fā)病機制在一定程度上存在差異,所得到的實驗結(jié)果外推可行性差,但轉(zhuǎn)基因頭痛動物模型考慮到MH存在的遺傳易感性,從基因分子遺傳角度研究MH,尤其是對FHM發(fā)病機制的研究具有不可或缺的作用。

2 TTH動物模型

目前常用ATP頸部肌肉注射的方法建立TTH動物模型。

2.1 ATP頸部肌肉注射致TTH動物模型原理

TTH的發(fā)病可能受顱周肌障礙、心理、神經(jīng)介質(zhì)、中樞調(diào)節(jié)機制紊亂等多種因素影響[47],慢性TTH常伴有顱周圍組織的觸痛增加[48]。頭頸部肌肉受到外界刺激可增加顱骨肌筋膜的觸痛,這與TTH的產(chǎn)生高度相關[47]。頭頸部肌肉受損帶來的傷害性信息傳入中樞神經(jīng),致使皮層、丘腦、硬腦膜等感覺神經(jīng)元對痛覺易敏,通過頸部注射外源性刺激物能誘發(fā)頸部肌肉疼痛,該痛覺作用于腦部感覺神經(jīng)元網(wǎng)絡,產(chǎn)生異源性突出易化[49],進而產(chǎn)生TTH。

2.2 ATP頸部肌肉注射致TTH動物模型的建立方法

ATP頸部肌肉注射致TTH動物模型,是現(xiàn)今國內(nèi)外公認的TTH動物模型[50]。將ATP作為外源性刺激物誘發(fā)頸部肌肉疼痛,異源性突出易化,最終引發(fā)TTH。Nobel等[50]用2%異氟醚持續(xù)性麻醉雄性Wistar大鼠,右股動脈、靜脈留置管進行監(jiān)測給藥,使用動脈導管持續(xù)注入含1 IU/mL肝素的生理鹽水,并將大鼠固定于腦立儀,備皮后鉆顱窗并用生理鹽水保持濕潤,分離頸部肌肉用夾子夾住,最后切開寰枕韌帶,露出下面的硬脊膜。將穩(wěn)定的ATP類似物α、β-5′-三磷酸腺苷(α,β-meATP,10 mmol/L)注入同側(cè)顳肌,30 min后在同側(cè)頸部肌肉和/或顳肌內(nèi)注射2%利多卡因進行局部麻醉,期間常規(guī)檢查和記錄大鼠的麻醉程度、心率、血壓,并用腦膜、顳肌和頸肌的傳入信息記錄三叉神經(jīng)脊髓神經(jīng)元的持續(xù)活動。王謙等[49]通過半棘肌注射1μmol/Lα,β-meATP也成功建立TTH動物模型。

2.3 ATP頸部肌肉注射致TTH動物模型評價

通過監(jiān)測張頜反射(jaw-opening reflex,JOR)可判斷是否成功建模。JOR是通過監(jiān)測電刺激舌肌的傳入神經(jīng)完成[50],當ATP頸部肌肉注射致TTH動物模型建模后,JOR的疼痛閾值較建模前降低。首先,將兩根能釋放矩形脈沖時長500μs,頻率0.1 Hz,每組為8次脈沖的電極插入舌右側(cè)緣,再將兩根記錄電極插入右側(cè)二腹肌前腹,記錄通過電刺激舌肌誘發(fā)出的JOR,5 min重復1次。在得到穩(wěn)定的基線后,注射α,β-meATP引發(fā)異源性突出易化并持續(xù)觀察60 min,記錄二腹肌肌電和腦干誘發(fā)電位或記錄JOR發(fā)生的潛伏期及波幅反映肌筋膜敏感程度[50],最后與正常組進行對比判斷。

2.4 ATP頸部肌肉注射致TTH動物模型的適用范圍及優(yōu)缺點

ATP頸部肌肉注射致TTH動物模型是由穩(wěn)定的ATP類似物α,β-meATP引發(fā)異源性突出易化,其模擬頭頸部傷害性信息傳入中樞增強的發(fā)病機制,具有良好的科學可行性,可用于研發(fā)治療發(fā)作性TTH的相關藥物,但不適用于其他受體靶向治療藥物的研究[51],且實驗條件要求高,不易大量復制。

3 結(jié)語

建立并使用動物模型有利于對原發(fā)性頭痛的發(fā)病機制和治療方法進行深入研究,從而將基礎實驗與臨床應用銜接。以上各個動物模型雖分別在不同方面模擬人類原發(fā)性頭痛發(fā)病,但沒有一個模型可以完全模擬其發(fā)病機制。通過對過去研究的分析,我們可知評價一個原發(fā)性頭痛動物模型是否成功建立往往可以從行為學和生物學兩個方面進行綜合判斷。其中行為學指標包含有特異性和非特異性,然而仍有部分動物模型的這些指標仍不夠完善,缺乏特異性和規(guī)范性。而生物學指標往往是多個信號通路的下游分子事件,無法全面顯現(xiàn)模型的作用機制,不利于預防和治療藥物的研發(fā),因此也需要對模型的中游分子進行分析,找出特異性指標。因此受體特異性高、制備周期短、操作簡便、切實可靠的病理機制、且有簡單高效的評價標準的原發(fā)性頭痛動物模型是我們未來探索研究的方向。