絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系及篩選技術(shù)的研究進(jìn)展

王越，李雅凝，曲曉磊，王旭彤

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040)

0 引言

絲狀真菌(Filamentous fungi)是一種廣泛分布于土壤、水域、空氣及動(dòng)植物體內(nèi)外等自然環(huán)境中的真核微生物，在人類的生產(chǎn)、生活及基礎(chǔ)生物學(xué)研究中具有重要地位和作用。在發(fā)酵、紡織、食品和皮革等工業(yè)中，絲狀真菌可以提高產(chǎn)品品質(zhì)降低污染風(fēng)險(xiǎn)。如黑曲霉(Aspergillusniger)能分解飼料中的大分子糖類為單糖和寡糖，并生成多種有機(jī)酸、維生素、生物酶、生長因子，有效提高了發(fā)酵飼料的營養(yǎng)水平和消化吸收率。還能產(chǎn)生抗生素物質(zhì)激發(fā)動(dòng)物機(jī)體自身有益菌種的繁殖增殖，抵制有害菌群生長；在農(nóng)業(yè)上，絲狀真菌具有生物防治的功能，如木霉菌(Trichodermaspp.)對多種植物病原菌有拮抗作用，往往通過競爭作用、抗生作用、重寄生作用和誘導(dǎo)宿主抗性等方式抑制目標(biāo)病原體生長繁殖[1]；在醫(yī)藥衛(wèi)生方面，絲狀真菌同樣具有重要作用，如桑黃(Sanghuangporusbaumii)作為一種珍貴的絲狀真菌，其含有的多糖、黃酮及萜類物質(zhì)具有重要的藥用價(jià)值，作為主要活性物質(zhì)的桑黃多糖具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及降血糖等多種生物活性，它可以通過提高機(jī)體免疫力而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，還能誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡[2]。

由于絲狀真菌的遺傳背景復(fù)雜、育種周期長以及定向性較差，傳統(tǒng)的育種方法(自然選擇、雜交育種)已不能滿足人們對新菌株的需求。隨著基因時(shí)代的發(fā)展，大量絲狀真菌基因組序列公布，絲狀真菌的遺傳背景逐漸清晰，其中絲狀真菌基因功能的研究漸漸成為了熱點(diǎn)。通過基因工程的手段在分子水平上研究絲狀真菌的基因功能以及定向改良菌種的研究報(bào)道越來越多，而構(gòu)建穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系是研究基因功能和定向改造菌株的基礎(chǔ)。

目前關(guān)于絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究報(bào)道較多，轉(zhuǎn)化方法也具有多樣性，對于轉(zhuǎn)化后的絲狀真菌篩選方法也多種多樣。因此，綜述了近年來絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化方法和陽性轉(zhuǎn)化子的篩選方法，為進(jìn)一步研究并應(yīng)用高效遺傳轉(zhuǎn)化體系提供有益參考。

1 遺傳轉(zhuǎn)化方法及轉(zhuǎn)化子檢測方法的發(fā)展與應(yīng)用

1.1 遺傳轉(zhuǎn)化方法

遺傳轉(zhuǎn)化是指宿主的感受態(tài)細(xì)胞吸收了同源或外源的大分子(質(zhì)粒和染色體DNA)而在遺傳性狀上發(fā)生定向改變。在絲狀真菌的轉(zhuǎn)化中，可以以菌絲體、孢子、原生質(zhì)體等為受體材料，將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞內(nèi)，使其在宿主細(xì)胞中得到穩(wěn)定整合、表達(dá)并遺傳。

1.1.1 電擊轉(zhuǎn)化法。電擊轉(zhuǎn)化法是通過高壓脈沖對絲狀真菌的原生質(zhì)體或細(xì)胞進(jìn)行處理，使受體表面產(chǎn)生一個(gè)20～40 nm的電穿孔，從而使外源大分子(DNA)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。電擊法對受體細(xì)胞產(chǎn)生的擾動(dòng)很小，保持了受體細(xì)胞的生理活性[3]。雖然電擊法需要較昂貴的專業(yè)設(shè)備，但電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化效率高、操作簡便，在許多實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用。電擊法多以原生質(zhì)體為受體材料，已成功獲得了草菇(Volvariellavolvacea)[4]、金針菇(Flammulinavelutipes)[5]、紫孢側(cè)耳(Pleurotussapidus)[6]靈芝(Ganodermalucidum)[7]等絲狀真菌的陽性轉(zhuǎn)化子。由于目前絲狀真菌的轉(zhuǎn)化受體多為原生質(zhì)體，而對于有些真菌來說，其原生質(zhì)體制備過程繁雜，再生較難，轉(zhuǎn)化效率較低，轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定，不適合進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化[8]，因此電擊法在絲狀真菌中的應(yīng)用具有一定局限性。

1.1.2 聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)法。高國楠首創(chuàng)的聚乙二醇介導(dǎo)法是使用較早較普遍細(xì)胞融合方法，PEG是一種帶有大量負(fù)電荷的細(xì)胞融合劑，在高pH條件下，碳酸鈣可與DNA結(jié)合構(gòu)成DNA-碳酸鈣復(fù)合物，PEG通過干擾細(xì)胞膜表面的電荷平衡，影響細(xì)胞間的識(shí)別，從而促進(jìn)外源DNA分子進(jìn)入原生質(zhì)體以及細(xì)胞間融合。2004年，王強(qiáng)等[9]首次通過PEG轉(zhuǎn)化緩沖液將外源基因轉(zhuǎn)入靈芝(Ganodermalucidum)，并在含有100 μg/mL潮霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，篩選到的轉(zhuǎn)化子通過PCR和Southern 雜交技術(shù)檢測轉(zhuǎn)化效率約為5～6個(gè)/μg (抗性轉(zhuǎn)化子/pAN7-1+107個(gè)原生質(zhì)體)。目前，PEG介導(dǎo)法已成功構(gòu)建了靈芝(Ganodermalucidum)、黃曲霉(Aspergillusflavus)[10]、產(chǎn)黃青霉(Pennicilliumchrysogenum)[11]、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)[12]等絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系。PEG介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化效率受PEG聚合度、PEG濃度和作用時(shí)間、離子種類和濃度、融合劑pH、溫度等很多因素影響。2016年，汪琪[13]等人從原生質(zhì)體濃度、PEG濃度、PEG種類、轉(zhuǎn)化介質(zhì)Ca2+等6個(gè)方面對PEG介導(dǎo)的茯苓的轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行探究，得到了最優(yōu)的條件。相比于電擊法而言，PEG介導(dǎo)法不需要特別的儀器設(shè)備，成本較低，操作簡便。但PEG對在原生質(zhì)體有一定的毒性，變異率高[14]，且由于受外部內(nèi)部多種因素的影響，穩(wěn)定性、重復(fù)性較差[13]，轉(zhuǎn)化率較低，因此還有待于完善。

1.1.3 基因槍介導(dǎo)法?；驑尳閷?dǎo)法，又叫生物彈道技術(shù)或粒子轟擊細(xì)胞法，是利用基因槍將含有目的基因的DNA溶液打入細(xì)胞，使其穿過層層細(xì)胞結(jié)構(gòu)導(dǎo)入目的細(xì)胞核內(nèi)，完成基因轉(zhuǎn)移?；驑尳閷?dǎo)法轉(zhuǎn)化的受體材料較為廣泛，在動(dòng)物、植物、葉綠體及絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化中均有廣泛應(yīng)用?；驑屴D(zhuǎn)化絲狀真菌時(shí)可以以菌絲、孢子為受體材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化，無需制備原生質(zhì)體，操作簡單。2005年，郭麗瓊[15]等人首次建立了草菇(Volvariellavolvacea)基因槍法遺傳轉(zhuǎn)化體系，以草菇的菌絲體為材料，獲得了8個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子。2006年，王陽[16]等人應(yīng)用基因槍法以小麥條銹菌 (Pucciniastriiformisf.sp.tritici)的夏孢子為受體材料進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，為深入研究小麥條銹菌的毒性基因及其結(jié)構(gòu)的變異奠定基礎(chǔ)?；驑尫ň哂惺荏w材料廣泛、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，但是基因槍介導(dǎo)法需要專門的實(shí)驗(yàn)儀器，耗材也很昂貴，成本較高，多拷貝整合還可能發(fā)生共抑制[17]，轉(zhuǎn)化率相對較低。

1.1.4 限制性酶介導(dǎo)的整合法。限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的整合法(REMI)是指在線性的質(zhì)粒和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶的作用下轉(zhuǎn)化絲狀真菌的原生質(zhì)體[18]，限制性內(nèi)切酶進(jìn)入受體細(xì)胞后，識(shí)別受體DNA上特異的位點(diǎn)并進(jìn)行切割，產(chǎn)生的粘性末端可以質(zhì)?；パa(bǔ)相連，質(zhì)粒DNA 通過堿基配對插入受體細(xì)胞的基因組，從而成功實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)具有定向性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化效率高、適用范圍廣等特點(diǎn)。2007年，周慶新[19]利用限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的整合技術(shù)轉(zhuǎn)化尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)，最后獲得了20株尖孢鐮刀菌轉(zhuǎn)化子，而沒有得到嗜熱絲孢菌的轉(zhuǎn)化子。由于影響REMI轉(zhuǎn)化的因素有很多，如原生質(zhì)體的制備、質(zhì)粒和限制性內(nèi)切酶的選擇都會(huì)影響轉(zhuǎn)化率，作者分析試驗(yàn)選用的質(zhì)粒pUCATP攜帶的A.nidulans的PtrpC啟動(dòng)子不能在嗜熱菌中起作用從而無法調(diào)控潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(HPT)基因表達(dá)。2010年，江蓓蓓[20]等以玉米彎孢霉葉斑病菌(Curvularialunata)WD-1的原生質(zhì)體為實(shí)驗(yàn)材料，將含有HPT的質(zhì)粒pUCATPH進(jìn)行限制酶介導(dǎo)的整合轉(zhuǎn)化，成功獲得了陽性轉(zhuǎn)化子，并在培養(yǎng)基上培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)孢量和生長速度明顯慢于野生菌株，這為玉米彎孢霉葉斑病菌的防治提供了有意義的線索。酶介導(dǎo)法雖然定向性強(qiáng)，范圍廣，但是酶的種類和濃度對轉(zhuǎn)化效率影響很大，這大大限制了酶介導(dǎo)方法的使用。

1.1.5 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。根癌農(nóng)桿菌是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，在自然界中，農(nóng)桿菌通過侵染受體傷口進(jìn)入細(xì)胞后，Ti質(zhì)粒上的Vir基因區(qū)域和T-DNA區(qū)域共同作用，將T-DNA高效率地整合到宿主的基因組上并進(jìn)行表達(dá)。因此，人們選擇將外源目的基因插入到質(zhì)粒的T-DNA區(qū)域，通過農(nóng)桿菌的感染將外源基因整合到宿主細(xì)胞的染色體上，培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)化子。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法(ATMT)最初是由 Bundock[21]在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中開始應(yīng)用的，隨后該方法被用于進(jìn)行多種絲狀真菌的研究。1998年de Groo[22]利用根癌農(nóng)桿菌，以原生質(zhì)體、分生孢子和菌絲體為受體材料成功轉(zhuǎn)化了多個(gè)絲狀真菌，黑曲霉(Aspergillusniger)、云孢鐮刀菌(Fusariumvenenatum)、瑞士木霉(Trichodermareesei)、黑木耳炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)等。2000年，Chen等[23]首次以雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)的菌褶組織為受體材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法實(shí)現(xiàn)了雙孢蘑菇的遺傳轉(zhuǎn)化。目前在食用菌中已有很多物種進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建，比如雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)、金針菇(Flammulinavelutipes)、草菇(Volvariellavolvacea)等[24]。相對于其他的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌的轉(zhuǎn)化具有操作簡便、受體廣泛、轉(zhuǎn)化效率高、單拷貝插入和遺傳穩(wěn)定等優(yōu)勢[25]。但根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化受很多因素影響，如選用的根癌農(nóng)桿菌菌株類型、受體材料、二者共培養(yǎng)的時(shí)間和濃度以及篩選轉(zhuǎn)化子需要的抗生素的種類等。其次，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對載體要求較高，攜帶T-DNA的雙元表達(dá)載體的構(gòu)建過程較為復(fù)雜[26]，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)T-DNA的插入具有偏好性，而且可能打斷宿主原有的基因或引起染色體重排，從而改變了宿主的表型。2013年，俞咪娜[27]等人在對稻曲病菌突變體5062的研究中發(fā)現(xiàn)突變體菌與野生菌的表型有顯著差異，而且T-DNA插入引起了稻曲病菌的染色體重排現(xiàn)象，從而推測突變體5062的表型發(fā)生變化是T-DNA插入和染色體重排共同作用的結(jié)果。

1.2 絲狀真菌轉(zhuǎn)化子的檢測技術(shù)

絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立通常以載體為基礎(chǔ)，將改造的載體通過各種轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞內(nèi)，從而使載體上的目的基因在宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)。由于目前遺傳轉(zhuǎn)化的效率較低，在轉(zhuǎn)化過程中，不是所有的宿主細(xì)胞都一定被轉(zhuǎn)化，也不是所有的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中一定含有目的基因。因此，在絲狀真菌進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化后，外源基因是否進(jìn)入絲狀真菌細(xì)胞，并整合到染色體上，整合的外源基因是否能夠穩(wěn)定表達(dá)是研究絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的重中之重。所以準(zhǔn)確快速鑒定轉(zhuǎn)化子對絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建具有重要的意義。

1.2.1 以基因?yàn)榛A(chǔ)的檢測技術(shù)

1.2.1.1 PCR鑒定：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是1985年創(chuàng)立的一種在體外模仿DNA的天然復(fù)制的分子生物學(xué)技術(shù)，具有周期短、操作簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，在遺傳轉(zhuǎn)化子的鑒定中應(yīng)用廣泛。在絲狀真菌轉(zhuǎn)化子檢測中，我們通常以轉(zhuǎn)化子的單個(gè)克隆為模板，利用特異性引物或通用引物對轉(zhuǎn)化子中的目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而鑒定和篩選陽性轉(zhuǎn)化子。目前常用的檢測基因有GUS基因，GFP基因，HPT基因等。但由于PCR擴(kuò)增有時(shí)得到的產(chǎn)物特異性較差，會(huì)出現(xiàn)假陽性擴(kuò)增，因而對轉(zhuǎn)化子的陽性檢測還需要其他方法進(jìn)一步鑒定。

1.2.1.2 Southern 印跡雜交鑒定：Southern印跡雜交是1975年英國人Southern發(fā)明的一種研究DNA圖譜的基本技術(shù)，利用電泳分離的待檢測的靶單鏈DNA與標(biāo)記的單鏈核酸探針進(jìn)行雜交，從而判斷待檢測的DNA樣品中是否有與探針同源的片段以及該片段的長度。2006年，應(yīng)盛華等[28]對球孢白僵菌(Beauveriabassiana)孢壁蛋白相關(guān)的耐熱分子機(jī)理進(jìn)行了研究，并且建立了基于球孢白僵菌芽生孢子的新型遺傳轉(zhuǎn)化體系。應(yīng)盛華等人挑選了10個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行Southern雜交鑒定，有2個(gè)轉(zhuǎn)化子顯示出雜交帶。2012年，師亮等[29]首次建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的靈芝遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，提取了轉(zhuǎn)化子的DNA進(jìn)行了Southern blot檢測，轉(zhuǎn)化子均顯示陽性雜交信號(hào)。Southern雜交技術(shù)能夠防止操作污染和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化殘留所引起的假陽性的信號(hào)出現(xiàn)[30]，具有特異性強(qiáng)，靈敏性高的特點(diǎn)，是檢測外源基因?qū)氲闹匾侄巍ｋS著Southern雜交技術(shù)的不斷發(fā)展，逐漸成熟，其越來越多地被應(yīng)用到絲狀真菌基因工程基礎(chǔ)研究中。

1.2.1.3 Northern 印記雜交鑒定：Northern 印記雜交鑒定是指將提取的轉(zhuǎn)化子的總RNA或mRNA用變性凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用探針與膜雜交，然后通過探針的標(biāo)記性質(zhì)來鑒定其中特定mRNA分子的含量及其大小。2006年，于寒穎等[31]為了對核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)arom基因進(jìn)行功能驗(yàn)證和相應(yīng)蛋白的研究，構(gòu)建了酵母表達(dá)載體pYES2-arom并將其導(dǎo)入釀酒酵母H158 (SaccharomycescerevisiaeH158) 中，對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行Northern雜交結(jié)果顯示，核盤菌arom基因在釀酒酵母胞內(nèi)成功表達(dá)。Northern印跡雜交技術(shù)是一種快速檢測和篩選陽性克隆片段的方法，并具有簡便、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物和植物轉(zhuǎn)基因檢測方面應(yīng)用廣泛。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對Northern blot技術(shù)優(yōu)化的相關(guān)研究也越來越多。在Northern blot中最為常用的電泳膠是含有甲醛的瓊脂糖凝膠，但甲醛具有較強(qiáng)的毒性，2004年，胡盛平[32]等通過改良，建立了安全無毒RNA凝膠電泳法，其次他們還簡化了RNA的轉(zhuǎn)印過程。此外，Northern blot需要提取RNA，但由于RNA極易受外界環(huán)境因素特別是核糖核酸酶的影響，其次在絲狀真菌中，由于復(fù)雜的細(xì)胞壁和內(nèi)源酶活性以及干擾RNA提取的多糖等物質(zhì)的存在，從絲狀真菌中提取和純化出有生物活性的RNA比較困難。因此Northern雜交在絲狀真菌的轉(zhuǎn)化子鑒定中應(yīng)用較少。

1.2.1.4 轉(zhuǎn)化子DNA測序：DNA測序是指分析特定DNA片段的堿基序列，即檢測腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶與胸腺嘧啶的排列方式。由于DNA測序技術(shù)的不斷發(fā)展，為了更準(zhǔn)確的鑒定轉(zhuǎn)化子為目的克隆，我們通常會(huì)利用PCR、核酸雜交技術(shù)鑒定之后，從陽性克隆中挑選幾例轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA測序，以便再次確認(rèn)是否轉(zhuǎn)化成功。2015年，丑天勝等[33]通過高通量測序技術(shù)對金針菇(Flammulinavelutipes)的一個(gè)RNAi轉(zhuǎn)化子菌株1382R3進(jìn)行了DNA測序，成功檢測到了外源載體DNA在基因組中的插入位點(diǎn)和拷貝數(shù)量。2017年，崔月貞[34]等采用PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，將綠色熒光蛋白基因(GFP)轉(zhuǎn)化到球炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)中，轉(zhuǎn)化子經(jīng)測序表明GFP基因已整合至球炭疽菌基因組DNA中。DNA測序技術(shù)的迅速發(fā)展，以高通量、低成本為特點(diǎn)的二代測序技術(shù)得到了充分的發(fā)展與應(yīng)用，是一種科學(xué)、可靠的方法，但是對轉(zhuǎn)化子逐一測序，所需的工作量大，費(fèi)用比較高。2020年，劉媛媛[35]等應(yīng)用矩陣設(shè)計(jì)對金針菇的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序，大大節(jié)省了測序費(fèi)用、提高效率，并且準(zhǔn)確檢測出其插入位點(diǎn)和拷貝數(shù)。

1.2.2 以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)

1.2.2.1 營養(yǎng)缺陷型篩選：營養(yǎng)缺陷型菌株與野生型菌株相比失去了合成某些代謝物如氨基酸、維生素的能力，只能在完全培養(yǎng)基或補(bǔ)充了相應(yīng)的生長因子的基本培養(yǎng)基中才能正常生長。在構(gòu)建絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的過程中，只有轉(zhuǎn)化子可以在不含該種成長因子的培養(yǎng)基中生長。營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因來自宿主本身，有利于基因表達(dá)，易于篩選，在大多數(shù)絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用廣泛。1973年，Mishra等首次利用肌醇缺陷型粗糙脈孢菌(Neurospora)進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)[36]。目前，營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記在酵母菌、絲狀真菌以及少數(shù)細(xì)菌中已經(jīng)得到應(yīng)用。1979年, Botstein[37]和Struhl[38]以編碼乳清苷5-磷酸脫羧酶的基因(ura3)作為選擇標(biāo)記構(gòu)建釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。這類篩選標(biāo)記在構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)等科學(xué)研究模式菌， 以及釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和畢赤酵母(pichiapastoris)等基因高效表達(dá)體系應(yīng)用最為成功。在絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化中，尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型是一種常用的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記。2019年，周陳力[39]等人采用紫外光誘變、單單雜交、孢子單核化的方法從靈芝單核體菌株出發(fā)，成功得到尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型雙核體菌株，為靈芝遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建提供了材料。營養(yǎng)缺陷型菌株在科學(xué)研究領(lǐng)域有重要作用，但部分絲狀真菌營養(yǎng)缺陷型菌株不易獲得，給營養(yǎng)缺陷型的篩選帶來麻煩。

1.2.2.2 抗性基因篩選：抗性基因篩選是指在構(gòu)建絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系時(shí)，常常選擇帶有抗生素抗性基因的載體轉(zhuǎn)入受體菌株，而后在含有該抗生素的培養(yǎng)基上幫助篩選出已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。相比于營養(yǎng)缺陷型篩選，抗性基因篩選對受體菌沒有特定的要求，操作起來比較簡單方便。但由于不同菌株對不同種類和濃度抗生素的敏感性不同，因此，篩選出合適的抗生素濃度種類和濃度對轉(zhuǎn)化子的鑒定具有重要意義。目前，被廣泛應(yīng)用的抗生素類標(biāo)記基因包括氨芐青霉素抗性基因，氯霉素抗性基因，鏈霉素抗性基因，四環(huán)素抗性基因，卡那霉素抗性基因，潮霉素抗性基因等。其中，以HPT作為篩選基因的研究最為廣泛。2010年，董曉雅等[40]在利用PEG-CaCl2介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法構(gòu)建平菇(Pleurotusostreatus)遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究中，將含有HPT的載體轉(zhuǎn)入平菇，轉(zhuǎn)化子經(jīng)過80 μg/mL潮霉素初篩和100 μg/mL潮霉素復(fù)篩，獲得了具有潮霉素抗性的陽性轉(zhuǎn)化子。2017年，張昕[41]等在研究金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因(FIP-fve)對金針菇本身的生物學(xué)功能時(shí)，構(gòu)建了帶有HPT的FIP-fve基因沉默載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入金針菇菌絲，將轉(zhuǎn)化后的金針菇菌絲塊置于含有潮霉素(9 μg/mL)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，共得到5個(gè)金針菇陽性轉(zhuǎn)化子。使用藥物抗性相比于營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記更簡單，不需要受體具有營養(yǎng)缺陷型，因此抗性基因篩選在絲狀真菌的轉(zhuǎn)化中應(yīng)用更加廣泛。但使用藥物篩選易導(dǎo)致菌株產(chǎn)生耐藥性，抗性較為不穩(wěn)定，只能在初篩和復(fù)篩中應(yīng)用，對于抗性篩選出的轉(zhuǎn)化子，仍需要應(yīng)用其他檢測方式鑒定基因是否整合到真菌基因組中。

1.2.2.3 報(bào)告基因檢測：報(bào)告基因是一類用于檢測組裝的嵌合基因在導(dǎo)入受體細(xì)胞后是否具有功能的指示基因，通常把目的基因與報(bào)告基因組裝成嵌合基因，通過檢測它的表達(dá)產(chǎn)物來判斷外源目的基因是否成功整合進(jìn)宿主細(xì)胞。作為報(bào)告基因，在遺傳選擇和篩選檢測方面必須具有以下幾個(gè)條件：①表達(dá)產(chǎn)物具有相對的穩(wěn)定性，很容易被檢測；②表達(dá)產(chǎn)物在受體細(xì)胞中本不存在，或僅存微量的相似的內(nèi)源性表達(dá)產(chǎn)物；③報(bào)告基因的表達(dá)對受體細(xì)胞無影響。最常用的報(bào)告基因大多是編碼抗生素抗性蛋白的基因、β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(CAT)、熒光素酶基因、熒光蛋白家族等。其中CAT是真核基因表達(dá)調(diào)控中最早使用的報(bào)告基因之一[42]，但由于其具有放射性，與其他報(bào)告基因相比線性范圍較窄，靈敏性較差；熒光素酶基因雖然操作簡單、靈敏度高，但是其所需要的檢測儀器較貴；熒光蛋白家族包括綠色、紅色、黃熒光蛋白等，其中綠色熒光蛋白(GFP)是應(yīng)用最多的一種。2008年，王曉利等[43]建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瑞士木霉(Trichodermareesei)轉(zhuǎn)化體系中GFP作為標(biāo)記基因，通過熒光顯微鏡下對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行熒光觀察，結(jié)果顯示在瑞氏木霉菌絲和孢子中都可以觀察到強(qiáng)烈的綠色熒光。2016年，祁浩等[44]利用GFP基因驗(yàn)證了所構(gòu)建的綠色熒光蛋白釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表達(dá)載體具有便捷篩選及良好的表達(dá)效果。GFP基因在絲狀真菌的研究中廣泛應(yīng)用，是一種良好的標(biāo)記物，其表達(dá)對寄主細(xì)胞無毒性作用，并且易于檢測，只需要紫外光或藍(lán)光激發(fā)，就可觀察到綠色熒光。除GFP基因之外，GUS基因存在于一些細(xì)菌基因組內(nèi)，在真菌中很少或完全檢測不出GUS活性，而且GUS報(bào)告基因的檢測僅需簡單的化學(xué)反應(yīng)即可肉眼觀察到，因此GUS基因在分子生物學(xué)研究中使用頻率更高。2012年，徐志超等[45]用香菇三磷酸甘油醛脫氫酶(GPD)啟動(dòng)子構(gòu)建了載體p1305.1-GPD，以GUS基因?yàn)閳?bào)告基因，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)將載體轉(zhuǎn)入靈芝(Ganodermalucidum)細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)化子在GUS染色后呈現(xiàn)明顯藍(lán)色，表明GUS可以作為篩選靈芝轉(zhuǎn)化子的報(bào)告基因。2012年，師亮[29]等在靈芝(Ganodermalucidum)中分別構(gòu)建了EGFP和GUS報(bào)告基因表達(dá)載體， 通過對轉(zhuǎn)化子的檢測表明GUS在靈芝中更加敏感。目前利用報(bào)告基因來檢測轉(zhuǎn)化子已經(jīng)是一種廣泛應(yīng)用的手段，但是報(bào)告蛋白的半衰期較長，影響了基因表達(dá)的實(shí)時(shí)監(jiān)測，以及報(bào)告基因的靈敏度、檢測方法的容易程度、檢測所需的費(fèi)用等仍是我們應(yīng)該考慮的問題[42]。

1.2.3 生物學(xué)鑒定。除了利用分子生物學(xué)技術(shù)從基因?qū)用孢M(jìn)行轉(zhuǎn)化子的鑒定之外，轉(zhuǎn)化子和野生型菌株在一些生物學(xué)特性方面也有明顯差異。2010年，董曉雅[40]等在構(gòu)建平菇(Pleurotusostreatus)遺傳轉(zhuǎn)化體系時(shí)，首先利用潮霉素對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初篩和復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)陽性轉(zhuǎn)化子菌絲較為濃密，生長速度快，而假陽性轉(zhuǎn)化子菌絲則相對稀疏，生長速度慢。2016年，柏英等[46]在研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的同源重組的方法構(gòu)建的黑曲霉(Aspergillusniger)ras基因敲除子時(shí)，從生長速度、菌絲形態(tài)及產(chǎn)孢情況、生長溫度、生物量等生物學(xué)特性方面對敲除子進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化子的生長速度比野生型慢，而且菌絲致密、顏色較深同時(shí)轉(zhuǎn)化子邊長菌絲邊產(chǎn)孢。2017年，孫佳瑩[47]等以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法構(gòu)建了玉米北方炭疽病菌(Aureobsidiumzeae)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過該體系獲得了5種轉(zhuǎn)化子，并將野生型的菌落特征和5種轉(zhuǎn)化子一并進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子在菌落顏色、生長速度、革質(zhì)化及產(chǎn)孢量等方面都有一定變化。2019年，宋燕嬌[48]等在采用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法陰環(huán)炭團(tuán)菌(Annulohypoxylonstygium)TJAS01的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因TJAS01-V10012900進(jìn)行敲除的研究中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子在生長速度、菌落形態(tài)特征方面與野生型菌株相比具有明顯差異。通過形態(tài)學(xué)觀察、生物量測定的等生物學(xué)鑒定來篩選轉(zhuǎn)化子更加直觀，操作簡單，可以作為分子生物學(xué)鑒定手段的輔助手段加以利用。

2 總結(jié)和展望

絲狀真菌作為一種在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景的微生物，對其基因功能的研究尤為重要。近年來發(fā)展了許多真菌基因功能研究方法，如轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)、基因敲除技術(shù)、基因過表達(dá)技術(shù)等，這些技術(shù)的研究主要以真菌的遺傳轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)。目前絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化主要存在以下幾個(gè)方面的問題，轉(zhuǎn)化率低、篩選鑒定不夠快速準(zhǔn)確、操作較為復(fù)雜。

2.1 轉(zhuǎn)化率低

絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化效率與所選用的轉(zhuǎn)化方法、受體材料以及質(zhì)粒載體的選擇密切相關(guān)。如PEG介導(dǎo)法、電擊法或限制性內(nèi)切酶法多以原生質(zhì)體作為受體材料，因此原生質(zhì)體的再生是影響轉(zhuǎn)化率的一個(gè)重要因素。原生質(zhì)體再生率受到各種條件的影響，如菌齡、酶濃度、酶解溫度、預(yù)處理等的影響，提高原生質(zhì)體的再生率是提高轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵因素。對于部分絲狀真菌而言，原生質(zhì)體制備過程繁雜，再生較難，我們可以嘗試以菌絲體、孢子為受體材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化可以不制備原生質(zhì)體，操作簡便，轉(zhuǎn)化效率相對較高，是絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化中較為常用的方法。但在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化中，農(nóng)桿菌菌株的類型、乙酰丁香酮的濃度、共培養(yǎng)的條件等也對轉(zhuǎn)化效率有影響。此外，外源基因在受體菌中表達(dá)還與所選用的載體有關(guān)，不同的載體類型以及驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子對轉(zhuǎn)化效率也有較大的影響。2012年，師亮[29]構(gòu)建靈芝的遺傳轉(zhuǎn)化體系時(shí)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源啟動(dòng)子能夠顯著提高轉(zhuǎn)化效率。

2.2 篩選鑒定不夠快速準(zhǔn)確

在多種絲狀真菌的轉(zhuǎn)化子鑒定方法中，抗生素篩選是最直觀的篩選轉(zhuǎn)化子方法，但是假陽性率較高；PCR鑒定檢測速度快、成本較低，但是在轉(zhuǎn)化子中也會(huì)存在一定的假陽性；Southern雜交操作較為復(fù)雜、成本較高，但是特異性強(qiáng)、靈敏度高。因此在遺傳轉(zhuǎn)化研究中，常常將3種方法結(jié)合鑒定陽性轉(zhuǎn)化子可以節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間、降低試驗(yàn)成本，并且檢測更靈敏。此外，熒光蛋白基因作為篩選標(biāo)記具有熒光穩(wěn)定、易于檢測、對細(xì)胞無毒害、無物種特異性和無需底物等特點(diǎn)，也經(jīng)常與PCR鑒定相結(jié)合，但由于一些真菌菌絲自身帶有熒光，所以不適用于所有絲狀真菌。因此針對不同的真菌綜合選用合適的篩選方法對陽性轉(zhuǎn)化子的篩選具有重要意義。

2.3 操作較為復(fù)雜

我們現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化方法有些需要特定的設(shè)備才能進(jìn)行，如基因槍介導(dǎo)法。其他的幾種轉(zhuǎn)化方法也需要篩選出合適的轉(zhuǎn)化條件。另外原生質(zhì)體的制備也是一個(gè)比較復(fù)雜的過程，因此，改良絲狀真菌原生質(zhì)體制備和再生的手段，或者嘗試以孢子或其他受體材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可能會(huì)使轉(zhuǎn)化更加簡單高效。

絲狀真菌作為一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的菌類，遺傳研究開展得較晚，相信隨著分子生物學(xué)手段的不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立將越來越精確、高效。進(jìn)一步加深對現(xiàn)有轉(zhuǎn)化方法的研究，如T-DNA在絲狀真菌中的插入和整合機(jī)制，或綜合多種轉(zhuǎn)化方法共同進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這對構(gòu)建絲狀真菌轉(zhuǎn)化體系，研究其基因功能以及絲狀真菌的改造具有重要的意義。