非洲馬瘟疫苗研究進(jìn)展

印春生，李雙星，劉業(yè)兵

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

非洲馬瘟(African horse sickness)是由非洲馬瘟病毒(African horse sickness virus，AHSV)引起的馬屬動物等單蹄動物的一種急性或亞急性非接觸性蟲媒傳染病，呈地方性和季節(jié)性流行，主要以發(fā)熱、皮下水腫及臟器出血為特征[1]。該病主要流行于撒哈拉沙漠以南非洲、北非、中東及阿拉伯半島的也門等地區(qū)，對馬屬動物危害較大，致死率高達(dá)95%以上，是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的必須通報(bào)的疫病[2-3]。

根據(jù)OIE網(wǎng)站相關(guān)信息，近幾個月在泰國東北部的呵叻府暴發(fā)非洲馬瘟疫情，以巴沖區(qū)域?yàn)橐咔橹行?。疫情時間起始于2020年2月24日，通報(bào)時已經(jīng)至少影響到341匹易感馬匹，其中62匹發(fā)病，42匹死亡。OIE接到報(bào)告后當(dāng)即取消了泰國非洲馬瘟的無疫區(qū)狀態(tài)[4]。2020年3月底以來，該國又報(bào)告多起非洲馬瘟疫情，而且離我國邊境直線距離不足800公里，疫情給我國的非洲馬瘟防控帶來極大風(fēng)險(xiǎn)。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2020年4月22日發(fā)布《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳關(guān)于做好非洲馬瘟防范工作的通知》要求各相關(guān)單位加強(qiáng)非洲馬瘟的疫情監(jiān)測、疫苗制造和質(zhì)量控制等相關(guān)技術(shù)儲備[5]。為此，本文綜述了非洲馬瘟疫苗的研究進(jìn)展，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 非洲馬瘟病毒

非洲馬瘟病毒屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)成員，與藍(lán)舌病病毒(Blue tongue virus，BTV)和馬器質(zhì)性腦炎病毒(Equine encephalosis virus，EEV)等其他環(huán)狀病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)相似[1]。AHSV的基因組由10個雙鏈RAN片段組成，編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP7)和4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3和NS3a)。病毒的基因組包裹在由VP3和VP7兩個主要蛋白與VPl、VP4和VP6三個體積較小蛋白組成的核心顆粒內(nèi)，120個VP3蛋白組成的“子核”及病毒的VPl、VP4和VP6蛋白共同構(gòu)成病毒的核心。病毒外部是由780個VP7蛋白構(gòu)成，其功能是維持子核層結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，子核和VP7蛋白共同形成病毒的內(nèi)衣殼，其中VP3、VP7蛋白被認(rèn)為是形成內(nèi)衣殼的主要蛋白。病毒的外衣殼是由VP2和VP5蛋白的三聚體組成，VP2是主要的變異性抗原蛋白，與病毒核心共同構(gòu)成完整的病毒粒子[6]。外衣殼蛋白是病毒的首要分型抗原，決定病毒中和抗體特異性，VP2被認(rèn)為是最主要的AHSV血清型特異性抗原，但在缺乏VP2蛋白時VP5蛋白也可以產(chǎn)生一定程度的中和抗體[7]。非洲馬瘟病毒共有9個血清型[8,9]，感染后痊愈的馬屬動物會對相應(yīng)的血清型產(chǎn)生很好的免疫力，對其他血清型也可產(chǎn)生部分免疫保護(hù)效果，但保護(hù)效果一般較差。

2 癥狀及診斷

非洲馬瘟為高度傳染性疾病，但非接觸性傳染病，該病毒不能在馬匹中直接傳播，必須經(jīng)過中間媒介庫蠓等昆蟲叮咬進(jìn)行傳播，但在某些蜱類體內(nèi)也可分離到病原[10]。AHSV在不同宿主內(nèi)所引起的病毒血癥持續(xù)時間不同，一般持續(xù)4～8日。犬可以通過食用污染病毒的馬類制品而發(fā)生AHS，但犬在AHSV傳播和儲存過程中發(fā)揮較少作用[11]。非洲馬瘟的臨床表現(xiàn)根據(jù)發(fā)病程度和嚴(yán)重性可分為心型、心肺型、肺型和發(fā)熱型(馬瘟型)四個類型，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、呼吸困難等，致死率可達(dá)到90%以上[12]。

非洲馬瘟的診斷沒有統(tǒng)一國際標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)發(fā)生疫病時，可先用ELISA或PCR等進(jìn)行快速鑒定，然后在實(shí)驗(yàn)室分離病毒。疫情暴發(fā)時，應(yīng)盡早通過病毒中和試驗(yàn)，或采用RT-PCR 并結(jié)合測序方法，以確定血清型。

2.1 病原學(xué)診斷 對疑似患病動物進(jìn)行臨床診斷需要結(jié)合臨床癥狀、病理變化以及流行病學(xué)信息綜合分析和診斷，但由于大部分臨床癥狀和病變并不是AHSV所特有的，所以要確診還需要對病毒進(jìn)行分離鑒定。通常在動物發(fā)熱期間采集抗凝血樣品或在動物剛死亡時采集脾、肺、淋巴結(jié)、唾液腺等樣品進(jìn)行病毒分離。AHSV首選分離方法是在2～4日齡乳鼠腦內(nèi)接種病毒[13]。AHSV也可以在昆蟲細(xì)胞，如蚊子細(xì)胞、庫蠓細(xì)胞中繁殖，但他們不會在這些細(xì)胞上引起細(xì)胞病變(CPE)，這些細(xì)胞系通常僅用于病毒的擴(kuò)增，為病毒在哺乳動物細(xì)胞分離進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。常見的哺乳動物細(xì)胞系如倉鼠腎細(xì)胞(BHK)、非洲綠猴細(xì)胞(Vero)等都可以用來分離AHSV，一般可在7日內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞病變[14]。

病原學(xué)確診最佳方法為反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，可以利用分子探針或者以AHSV的VP3和VP7蛋白基因序列為模板設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR，對組織中含有的病毒進(jìn)行鑒定，RT-PCR方法可以在幾個小時內(nèi)對AHSV含量很低的無活病毒樣品進(jìn)行分型。間接夾心ELISA也可以快速診斷急性感染死亡動物體內(nèi)固體組織中AHSV抗原。另外，群特異性試驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、直接和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)也可以鑒定分離病毒。

2.2 血清學(xué)診斷 血清學(xué)診斷主要針對能夠產(chǎn)生群特異性抗體的病毒VP7蛋白，目前已成功研制多種血清學(xué)檢測方法，如補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、瓊脂免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、免疫熒光實(shí)驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)等[15,16]。另外，有報(bào)道已經(jīng)建立了針對4型AHSV-NS3蛋白的間接ELISA方法[17]，該方法可以將自然感染的動物和接種滅活疫苗的動物相區(qū)分。血清中和試驗(yàn)(SNT)可以鑒別血清型特異性抗體，由于感染初期抗體水平較低，SNT在初期診斷中不是很常用，但在AHSV的血清學(xué)監(jiān)測中還是重要的檢測方法之一。在AHS流行的地區(qū)，可能存在多種血清型混合感染的情況存在，所以需要采集樣品多次，每次樣品采集時間至少需要間隔2周以上才能進(jìn)行確診。

3 疫苗研究進(jìn)展

目前，在疫情流行的地區(qū)，對于AHS的防控主要以疫苗免疫預(yù)防和對癥輔助性控制為主，主要使用弱毒苗對馬匹進(jìn)行免疫接種，其中多價弱毒苗的應(yīng)用使AHS的暴發(fā)頻率和程度大大降低。滅活疫苗曾經(jīng)使用過幾年，但是由于一些固有缺陷現(xiàn)已停用。近十幾年以來，隨著生物學(xué)的發(fā)展和生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，AHS核酸疫苗、亞單位疫苗、活載體疫苗等一系列新型疫苗的研發(fā)取得了較大進(jìn)步，并均取得了良好的免疫效果。

3.1 弱毒活疫苗 最早在20世紀(jì)30年代，Alexander就證明AHSV的小鼠適應(yīng)株可在雞胚中繁殖，并在不喪失免疫原性的情況下能夠在雞胚中連續(xù)傳代，使得病毒的毒力逐漸減弱，該研究同時證明AHSV存在多種毒株，并且不同毒株對免疫馬的保護(hù)效果差異較大，保護(hù)率在26%～81%之間[18]。60年代，Erasmus等利用哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的方法成功繁殖AHSV，并發(fā)現(xiàn)病毒引起細(xì)胞的蝕斑大小可區(qū)分AHSV的不同毒株，該發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步促進(jìn)了弱毒活疫苗的研制[19]。在過去的幾十年里，人們成功研制出多種不同血清學(xué)的多價弱毒疫苗，并均應(yīng)用于馬匹的接種?，F(xiàn)有的多價活疫苗應(yīng)用效果研究認(rèn)為，血清1型和2型、3型和7型、5型和8型以及6型和9型之間均存在交叉保護(hù)，但是血清4型和其他血清型之間均沒有交叉保護(hù)。但2006年在南非的西開普省暴發(fā)了9起5型AHSV引起的疫情，這使得人們開始質(zhì)疑多價活疫苗的免疫能否產(chǎn)生對血清5型的AHSV足夠保護(hù)。目前，常見的多價弱毒活疫苗主要為兩種，分別為三價苗(血清型1、3和4)和四價苗(血清型2、6、7和8)[20]。

雖然弱毒活疫苗是目前預(yù)防AHS的最佳選擇，但它的使用也引起了人們對其他一些問題的關(guān)注。如馬匹群內(nèi)以及不同血清型之間的血清型特異性免疫應(yīng)答的差異很大，動物可能需要多次免疫接種才能完全獲得所有9種AHS血清型保護(hù)。此外，流行毒株與疫苗毒株之間的基因重組可能導(dǎo)致新的遺傳變異或使弱毒疫苗株的毒力返強(qiáng)。2004～2014年，在西開普地區(qū)流行的毒株、弱毒活疫苗毒株同AHSV參考毒株的全基因組序列比對研究結(jié)果表明，活疫苗毒株的內(nèi)部基因發(fā)生了重組，并恢復(fù)了強(qiáng)毒的毒力[21]。弱毒株病毒的另一個缺點(diǎn)是不能從血清學(xué)上鑒別是疫苗接種誘導(dǎo)的免疫還是自然感染誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫，易引起對動物的不必要撲殺。

3.2 滅活疫苗 非洲馬瘟滅活疫苗具有良好的免疫效果，尤其防控4型的AHS，通常采用滅活疫苗進(jìn)行免疫。AHS滅活疫苗的生產(chǎn)中常使用的滅活劑為甲醛、β-丙內(nèi)酯或溴甲基亞胺等[22-23]，后兩種滅活劑主要作用于核酸而非蛋白，以確保疫苗的免疫原性不受損害。常用的滅活疫苗有組織毒滅活疫苗和細(xì)胞毒滅活疫苗。組織毒滅活疫苗是制造方法比較原始的一種疫苗，即取瀕死期典型病馬的脾臟，研磨成乳劑，加入滅活劑滅活后，當(dāng)?shù)刂苯佑米黝A(yù)防接種。這種疫苗目前只在個別地區(qū)用作緊急預(yù)防注射。細(xì)胞毒滅活疫苗是將AHSV細(xì)胞適應(yīng)株接種哺乳動物細(xì)胞系上大量增殖，隨后在病毒培養(yǎng)液內(nèi)加入滅活劑滅活處理后，再加入氫氧化鋁佐劑，制成單價或多價疫苗。研究報(bào)道，AHS 9型滅活疫苗免疫接種豚鼠和馬都產(chǎn)生了中和抗體反應(yīng)，證實(shí)了豚鼠可作為疫苗有效性評價的替代動物，攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，免疫馬能夠抵抗強(qiáng)毒的攻擊[24]。滅活疫苗的主要缺點(diǎn)是生產(chǎn)成本高，大規(guī)模分離純化病毒，需要嚴(yán)格控制生物安全風(fēng)險(xiǎn)；需要多次反復(fù)接種才能夠保持較好的免疫性能；在血清學(xué)上無法區(qū)分動物是接種疫苗還是受到感染。商品化的AHS滅活疫苗曾經(jīng)在1987～1991年期間用于西班牙、葡萄牙和摩洛哥的AHS疫情的防控，但目前已不再生產(chǎn)這種疫苗[1]。

3.3 核酸疫苗 核酸疫苗也稱DNA(或RNA)疫苗,是指將含有編碼目的蛋白基因序列的質(zhì)粒載體，經(jīng)肌肉注射等方法接種宿主體內(nèi)，通過宿主細(xì)胞表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。有關(guān)AHS的核酸疫苗研究報(bào)道較少，僅有Romito等報(bào)道AHSV-VP2的DNA作為核酸疫苗的研究，該核酸疫苗在接種馬匹后僅后觀察到一匹馬產(chǎn)生了VP2蛋白特異性的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且這匹馬在隨后爆發(fā)的AHS疫情中存活下來，但是報(bào)道的中和抗體滴度較低，也沒有進(jìn)行強(qiáng)毒攻毒試驗(yàn)研究。此外，用克隆的AHS VP2 cDNA免疫母雞，可刺激卵黃IgY抗體的產(chǎn)生，其血清中和效價比用純化的AHS疫苗接種后低80倍。因此，實(shí)際生產(chǎn)中很難生產(chǎn)出適用的AHS核酸疫苗[25]。

3.4 亞單位疫苗 亞單位疫苗，即通過化學(xué)分解、有控制性的蛋白水解、生物合成或基因重組亞單位蛋白制備的疫苗。AHS的亞單位疫苗研究目前主要通過基因重組主要結(jié)構(gòu)蛋白的方法制備。有研究報(bào)道，通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的重組AHSV VP2已單獨(dú)或聯(lián)合VP5或VP7作為亞單位疫苗使用，并被證明可誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫。但是重組獲得的可溶性抗原的免疫原性一般較差，從昆蟲細(xì)胞裂解物中純化的桿狀病毒所表達(dá)VP2的聚集性，再加上重復(fù)免疫接種的要求，以及使用強(qiáng)效佐劑增強(qiáng)免疫原性，一定程度上限制了這類亞單位疫苗的應(yīng)用[26-28]。但是，亞單位疫苗具有自身優(yōu)勢，它們可以區(qū)分動物是被流行毒株感染，還是接種疫苗。

3.5 痘病毒載體疫苗 Guthrie等用同時表達(dá)AHSV 4 VP2和VP5蛋白的金絲雀痘病毒疫苗接種馬，可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對該血清型病毒的特異性中和抗體。攻毒實(shí)驗(yàn)表明，高劑量疫苗免疫的馬抵抗了產(chǎn)AHSV 4的攻擊，血清中和抗體效價范圍從1∶10到1∶80[29]。但是，免疫馬產(chǎn)生的中和性抗體效價與攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果之間的關(guān)系沒有的明確相關(guān)性，血清抗體陰性的馬在攻毒后也可能存活。此外，在疫苗的后續(xù)研究中還發(fā)現(xiàn)VP2和VP5蛋白免疫后均檢測到γ干擾素的產(chǎn)生，這表明細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)很可能也在攻毒保護(hù)中起到重要作用。過去十多年來，已有多篇基于改良的安卡拉牛痘病毒(Modified Vaccinia Virus Ankara, MVA)重組AHSV蛋白疫苗的研究報(bào)道[30-33]。MVA毒株最初是在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中連續(xù)傳代的牛痘病毒，連續(xù)傳代引起12%的病毒基因組丟失，包括干擾宿主免疫反應(yīng)的基因，并導(dǎo)致在大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中無法復(fù)制。重組MVA疫苗是非復(fù)制的活病毒載體，既可誘導(dǎo)體液免疫又可產(chǎn)生細(xì)胞免疫，通過細(xì)胞表面的MHC分子促進(jìn)抗原在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。已有研究表明MVA疫苗是最有效的疫苗研究策略，在啟動疫苗接種后作為異種抗原刺激，促進(jìn)已有的T細(xì)胞對重組抗原免疫反應(yīng)，減少對病毒載體本身抗原的應(yīng)答，從而避免了對病毒載體已有免疫的問題。用表達(dá)AHSV VP2(MVA-VP2)的MVA進(jìn)行同源引物增強(qiáng)免疫也可以誘導(dǎo)中和性抗體，從而對免疫小鼠或馬都產(chǎn)生攻毒保護(hù)作用。研究結(jié)果表明，僅表達(dá)外衣殼蛋白VP2的MVA疫苗接種試驗(yàn)動物也可產(chǎn)生免疫保護(hù)，說明VP5不是這類疫苗的必要成分，但可提高疫苗的效果。將接種MVA- VP2小鼠的脾細(xì)胞移植到未接種的對照小鼠，并未導(dǎo)致顯著的病毒血癥的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而且對小鼠注射陽性血清產(chǎn)生的被動免疫也能夠使小鼠獲得免疫攻毒保護(hù)，因此體液免疫可能發(fā)揮更為重要的作用。但是使用MVA-VP2或MVA-NS1免疫的小鼠在受到多肽序列刺激時，能夠產(chǎn)生干擾素的細(xì)胞上調(diào)現(xiàn)象[34]，說明細(xì)胞免疫可能在一定程度上起到輔助保護(hù)作用。

多價AHSV疫苗研究結(jié)果表明，馬在4周后分別接種4型MVA-VP2(4)或9型MVA-VP2(9)或兩者同時接種或連續(xù)接種，產(chǎn)生了針對AHSV 4和AHSV 9的中和抗體。接種4個月后，當(dāng)中和抗體滴度急劇下降時，再接種5型AHSV的MVA-VP2(5)疫苗不僅能誘導(dǎo)產(chǎn)生AHSV 5的中和抗體，而且還能誘導(dǎo)產(chǎn)生AHSV 4、6和9非特異性抗體。這些結(jié)果表明，MVA-VP2可作為一種多價疫苗，用于對一種以上的AHSV血清型的防控。試驗(yàn)結(jié)果還表明，在AHSV血清型5、6、8和9之間可能存在其他交叉反應(yīng)的抗原表位。研究進(jìn)一步證實(shí)，病毒載體的免疫不會對MVA-VP2疫苗的效果產(chǎn)生影響[32]。Calvo等[33]用活疫苗MVA-VP2，熱滅活MVA-VP2，紫外滅活MVA-VP2和蔗糖梯度純化MVA-VP2等四種不同的4型AHSV的MVA-VP2疫苗誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，結(jié)果證實(shí)MVA疫苗中表達(dá)的VP2蛋白和接種后宿主細(xì)胞中瞬時表達(dá)的VP2蛋白都能夠誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。

3.6 反向遺傳學(xué)疫苗 在過去的十多年中，反向遺傳操作系統(tǒng)已用于構(gòu)建基于活病毒的AHSV新型疫苗。這些活疫苗毒株通過構(gòu)建病毒復(fù)制復(fù)合體編碼五個病毒蛋白VP1，VP3，VP4，VP6和NS2的cDNA質(zhì)粒，先轉(zhuǎn)染入哺乳動物細(xì)胞系中，第二次再轉(zhuǎn)染十個具有完全復(fù)制能力的病毒RNA轉(zhuǎn)錄本，然后激發(fā)宿主細(xì)胞啟動病毒完全復(fù)制進(jìn)行病毒拯救。

不同的AHSV病毒血清型可以通過使用相同的初級轉(zhuǎn)錄復(fù)合物進(jìn)行拯救，然后交換T7 RNA轉(zhuǎn)錄的一種或多種衣殼蛋白，可將編碼這些蛋白質(zhì)的基因整合到一個常見的經(jīng)過精確設(shè)計(jì)病毒基因組中，病毒基因組中可以包含一個或多個缺失基因，目前已經(jīng)研制成功兩種生產(chǎn)缺陷病毒株的主要疫苗技術(shù)平臺。由于可入侵細(xì)胞而無復(fù)制能力(ECRA)的疫苗毒株(以前也稱為作為無傳染性的一次性復(fù)制毒株，DISC)缺少功能性的VP6基因，因此即使在受感染的細(xì)胞中也無法完成一個完整的復(fù)制周期?；蛉笔б呙缍局昴軌蛟诒磉_(dá)VP6基因的細(xì)胞系中拯救成功，并不斷增殖，但是拯救的病毒并無感染活性。相比之下，無傳染性的一次性復(fù)制(DISA)疫苗株缺乏非必需基因和非結(jié)構(gòu)蛋白NS3 / NS3a基因的共表達(dá)[35-37]。沒有這些蛋白質(zhì)的表達(dá)，可防止病毒的釋放，從而抑制產(chǎn)生病毒血癥，在沒有蚊蟲叮咬傳播的情況下，僅在受感染動物體內(nèi)局部復(fù)制。這些反向遺傳構(gòu)建的疫苗均符合區(qū)分自然感染和疫苗免疫(DIVA)疫苗的標(biāo)準(zhǔn)。

AHSV新型反向遺傳學(xué)疫苗研發(fā)的主要目標(biāo)是針對9種血清型病毒提供保護(hù)。研究人員嘗試研制一系列基因缺失毒株，每個毒株均包含不同血清型的VP2特異性衣殼蛋白。但是，僅替換一種蛋白基因會導(dǎo)致獲得的重組病毒與親本毒株相比病毒滴度顯著下降。想要獲得具有適當(dāng)復(fù)制缺陷的各血清型疫苗株，就需要在病毒基因組替換VP2和VP5兩個基因或VP2、VP3、VP5、VP7和NS3的五個基因，具體替換數(shù)量根據(jù)擬構(gòu)建的病毒血清型。已經(jīng)用馬駒對4型AHSV單價疫苗或1-4-6-8型的四價AHSV疫苗的安全性和免疫原性進(jìn)行了科學(xué)評價[36]。攻毒實(shí)驗(yàn)中，免疫馬均獲得了較好的保護(hù)。雖然反向遺傳學(xué)疫苗看起來很有希望，但是還需要進(jìn)一步研究免疫劑量和免疫持續(xù)期，相關(guān)的疫苗成本和其他要求可能限制其進(jìn)一步商業(yè)化生產(chǎn)[38]。

3.7 病毒樣顆粒疫苗 病毒樣顆粒(VLP)是一類安全、無自主復(fù)制能力蛋白復(fù)合物，它們本身具有佐劑性能，與亞單位疫苗相比具有更高免疫原性，因?yàn)榭乖砦灰杂行蛑貜?fù)陣列顯示在完整的病毒粒子表面，具有巨大的天然抗原優(yōu)勢。VLP與宿主免疫細(xì)胞的相互作用可誘導(dǎo)先天性以及獲得性的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，同時又不存在毒力返強(qiáng)或活毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，使其成為極具吸引力的新型疫苗。某些病毒成分的缺失可以用分子診斷技術(shù)區(qū)分接種疫苗的動物和感染的動物，符合DIVA疫苗的標(biāo)準(zhǔn)。AHSV的VP2，VP3，VP5和VP7蛋白質(zhì)通過疏水，靜電和共價相互作用導(dǎo)致VLP的自發(fā)自組裝。大多數(shù)重組蛋白可以在昆蟲細(xì)胞系、微生物發(fā)酵系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中、轉(zhuǎn)基因動物以及植物表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建VLP。

通過與昆蟲細(xì)胞共同感染產(chǎn)生的AHSV CLP(核心樣顆粒)還在初步研究，表達(dá)AHSV VP3或VP7的重組桿狀病毒未構(gòu)建成功。CLP代表病毒的內(nèi)部和中間蛋白質(zhì)層，而缺少由完整VLP形成所需的蛋白VP5和VP2。在后續(xù)的研究中，共表達(dá)AHSV蛋白的感染以及AHSV CLP和VLP的組裝均通過與桿狀病毒重組體同時表達(dá)兩種AHSV衣殼蛋白，即VP2和VP3或VP5和VP7，但是，整體VLP產(chǎn)量非常低，無法進(jìn)行量化生產(chǎn)[39]。

Dennis等[40-41]已開發(fā)一種植物生產(chǎn)的AHSV VLP疫苗，將常見的兩種不同血清型的AHSV四種衣殼蛋白在普通的煙草中進(jìn)行瞬時共表達(dá)，AHSV VLP能夠有效地自我組裝，形成良好的空間結(jié)構(gòu)，免疫接種馬具有良好的安全性并產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)。這類新型的VLP疫苗是一種完全由蛋白質(zhì)組成的，無傳染性的疫苗，應(yīng)用植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)能夠顯著降低生產(chǎn)成本。此外，該類疫苗技術(shù)平臺模擬AHSV天然野毒株的免疫原性，對免疫的動物都不會產(chǎn)生任何副作用，并且不存在毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)。以5型AHSV的 VLP免疫馬匹的血清還能夠產(chǎn)生針對8型AHSV交叉免疫反應(yīng)，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這兩種血清型之間具有交叉保護(hù)作用。

4 小 結(jié)

非洲馬瘟對馬來說是一種致死性疾病。目前對于患病馬匹除了良好的飼養(yǎng)管理外，還沒有特異性的治療方法，可以采取各種干預(yù)支持措施,如使用非甾體抗炎藥來緩解疼痛、發(fā)熱,抗生素來防止繼發(fā)細(xì)菌感染，或糖皮質(zhì)激素來幫助穩(wěn)定細(xì)胞膜和保持血管膜完整性,但這些措施都是輔助性治療。我國目前尚未發(fā)現(xiàn)此病，為防止從國外傳入，禁止從發(fā)病國家和地區(qū)輸入易感動物或相關(guān)制品。發(fā)生可疑病例時，按《中華人民共和國動物防疫法》規(guī)定，采取緊急、強(qiáng)制性的控制和撲滅措施，同時相關(guān)部門應(yīng)及時采樣進(jìn)行病毒鑒定，確診病原及血清型，撲殺病馬及同群馬，尸體進(jìn)行深埋或焚燒銷毀處理。我國相關(guān)科研單位必須在經(jīng)過主管部門審批同意后開展相關(guān)科研工作，尤其對疑似病料等生物性材料必須在有資質(zhì)的高等級生物安全實(shí)驗(yàn)室操作，嚴(yán)格防止病毒擴(kuò)散或泄露。