豬腸道病原研究新平臺：新型豬腸道3D 類器官在病原感染與免疫應(yīng)答研究中的應(yīng)用

腸道類器官培養(yǎng)系統(tǒng)于2009 年由荷蘭胡布勒支研究所（Hubrecht Institute）Hans Clevers 研究員及其團(tuán)隊(duì)建立。與傳統(tǒng)的原代細(xì)胞培養(yǎng)不同，腸道類器官是由分離自腸隱窩的Lgr5+干細(xì)胞在富含層黏連蛋白的基質(zhì)膠中經(jīng)Noggin、R-spondin I、EGF、Wnt3a等因子刺激分化成具有多種表型的腸道上皮細(xì)胞3D研究模型。與細(xì)胞系相似，腸道類器官可以傳代、凍存，是腸道病原體外感染與免疫應(yīng)答研究的理想模型。作為一種可反應(yīng)腸黏膜上皮生理特性和結(jié)構(gòu)的模型，腸道類器官的出現(xiàn)填補(bǔ)了腸道相關(guān)研究中細(xì)胞系及原代細(xì)胞和本體動物模型之間的空白。

目前，腸道類器官已經(jīng)應(yīng)用于少量腸道病毒研究中。然而，由于當(dāng)前3D 培養(yǎng)條件下腸道類器官中腸上皮細(xì)胞微絨毛完全內(nèi)置于球體內(nèi)部，這使得大多數(shù)利用腸絨毛頂端膜入侵機(jī)體的病原微生物難以感染該類器官，從而使得相關(guān)病原-宿主相互作用的研究難以開展。有研究人員在病毒感染實(shí)驗(yàn)中通過物理性破壞類器官整體結(jié)構(gòu)、顯微注射、3D 類器官2D 化等手段來建立感染，但這些方法均存在較大缺陷。破壞類器官的物理結(jié)構(gòu)對細(xì)胞損傷較大，顯微注射費(fèi)時且進(jìn)度緩慢，類器官2D 化對細(xì)胞量的消耗大且其結(jié)果有別于正常生理狀態(tài)下的真實(shí)結(jié)果。

近期在《Journal of Virology》發(fā)表了“Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations”的研究論文。該研究對豬腸道類器官進(jìn)行了改造，建立了絨毛外翻型豬腸道類器官體外培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)的建立從根本上克服了上述弊端。在該研究過程中，作者首先建立了傳統(tǒng)的豬腸道類器官培養(yǎng)系統(tǒng)。此后去除培養(yǎng)體系中的基質(zhì)膠，并將其置于低黏附性的組織細(xì)胞培養(yǎng)板中誘導(dǎo)，培養(yǎng)3 d 后，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、間接免疫熒光染色可見懸浮培養(yǎng)的類器官中腸道上皮細(xì)胞極性發(fā)生翻轉(zhuǎn)。隨后，作者鑒定了在傳統(tǒng)類器官和極性翻轉(zhuǎn)類器官中均存在主要的腸上皮細(xì)胞類型：杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞和腸道干細(xì)胞。該研究開發(fā)的新型類器官培養(yǎng)方法使豬腸道類器官實(shí)現(xiàn)可懸浮培養(yǎng)，該懸浮培養(yǎng)的腸道類器官中腸上皮細(xì)胞的極性發(fā)生翻轉(zhuǎn)，使得原本位于類器官腔體內(nèi)的腸上皮細(xì)胞頂端膜發(fā)生翻轉(zhuǎn)、暴露于類器官外表面。該培養(yǎng)模型更加便于各類病原微生物與腸絨毛上皮相互作用，也更好的模擬了腸道內(nèi)病原與宿主相互作用的實(shí)際情況。

隨后，作者采用一種常見的豬腸道病毒——傳染性胃腸炎病毒（TGEV）測試了該極性翻轉(zhuǎn)類器官在病原感染與免疫應(yīng)答中的應(yīng)用。結(jié)果顯示，TGEV 可成功感染極性翻轉(zhuǎn)的腸道類器官，此外，TGEV 感染也順利激活了極性翻轉(zhuǎn)腸道類器官中I 型和III 型干擾素以及炎癥免疫應(yīng)答等通路。

本項(xiàng)研究結(jié)果表明，通過優(yōu)化豬3D 腸道類器官的培養(yǎng)條件，可改變類器官中上皮細(xì)胞的極性，以使得腸道3D 類器官中上皮細(xì)胞頂端膜直接暴露于外表面從而實(shí)現(xiàn)與病原自由互作。此外，該培養(yǎng)體系可是腸道3D 類器官結(jié)構(gòu)仍保持完整、生理特征穩(wěn)定。該研究為豬腸道3D 類器官更好地應(yīng)用于腸道病原-宿主互作研究提供了全新的解決方案。