斑馬魚在功能性食品研究中的應用進展

郭勝亞，朱曉宇，周佳麗，張勇,，彭逸，榮佳，張立將，李春啟,,*

(1. 杭州環(huán)特生物科技股份有限公司，杭州 310051； 2. 浙江省人用物品安全性評價技術研究重點實驗室早期評價基地，杭州 310053； 3. 南京新環(huán)檢測科技有限公司，南京 210032)

目前，越來越多的生物活性成分在食物中發(fā)現，通過一些活性成分的配比形成的功能性食品已漸漸運用于生活，但食品研究領域也存在著不少問題，如如何區(qū)分活性化合物、如何推斷活性化合物是否具有生物學特性并且其安全性缺乏可靠的實驗依據。故研究確認食品的有效活性成分并對其安全性進行評價，是目前食品研究一個重要內容。

斑馬魚(Zebrafish，Daniorerio)是一種脊椎動物，與人類基因同源性高達87%，其信號傳導通路與人類基本近似，生物結構和生理功能與哺乳動物高度相似[1-2]，具有飼養(yǎng)成本低、體積小、發(fā)育周期短、體外受精、透明易觀察、單次產卵數較高、給藥量小等特點。目前，斑馬魚已被美國國家衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)列為繼大鼠和小鼠之后的第三大模式生物。經濟合作發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development,OECD)與中國已公布多個斑馬魚化學品毒性評價標準[3]，斑馬魚技術在歐美已經通過監(jiān)管部門的藥物非臨床研究質量管理規(guī)范(Good Laboratory Practice，GLP)認證，可用于新藥臨床申報。在我國已被列入科技部“重大新藥創(chuàng)制”專項。斑馬魚被廣泛應用于藥物、醫(yī)學、生命科學、以及環(huán)境安全檢測等多個領域。近年來，斑馬魚在食品安全性評價，活性成分篩選及作用機制研究等方面都有著廣泛應用。

1 斑馬魚及其胚胎在食品功效評價中的應用

斑馬魚是公認的生態(tài)毒理學模型。在上個世紀70年代，國外已經開始應用斑馬魚進行重金屬和有機物的急性毒性研究。除了毒性，斑馬魚還被用來評估食物成分的生物活性，包括對食品、食品提取物和從食品中分離出來的分子進行功能測試。

1.1 代謝性疾病

斑馬魚具有控制人體代謝的所有關鍵器官和調控機制，是研究代謝紊亂的良好模型。斑馬魚在能量平衡[4]、膽固醇代謝[5]、食欲調節(jié)[6]、胰島素調節(jié)[7]、脂肪細胞分化和脂質儲存[8]等關鍵功能與哺乳動物類似。

斑馬魚通過脂蛋白運輸脂肪和膽固醇，并在內臟、皮下和肌肉脂肪細胞庫中作為三酰甘油(triglyceride，TG)儲存[9-10]，脂質代謝網絡與哺乳動物相似，相關蛋白如載脂蛋白、脂肪酸轉運蛋白、膽固醇轉運蛋白、長鏈?；o酶的表達和功能相似，表明斑馬魚是一種適合人類脂質代謝的模型。血液中的高膽固醇水平會誘導其在血管中積累，在血管中它們會氧化并產生炎癥，從而引發(fā)動脈粥樣硬化。利用斑馬魚建立的動脈粥樣硬化模型則不需殺死動物就能直接且動態(tài)觀察到血管硬化的發(fā)展情況。Kim等[11]研究了枇杷葉、葡萄皮和巴西莓果泥對高膽固醇血癥斑馬魚抗動脈粥樣硬化作用。研究表明飼用巴西莓的魚血清總膽固醇(serum total cholesterol，TC)和膽固醇酯轉移蛋白(cholesteryl-ester transfer protein，CETP)活性最低，而飼用枇杷葉的魚血清TC和TG較飼用高膽固醇飼料(high cholesterol diet，HCD)的魚降低。飼用巴西莓和枇杷葉的組表現出更少的肝臟炎癥，以及脂肪肝的減少和氧化物質含量的減少。這些結果表明開發(fā)一種新的功能性膳食劑來治療慢性代謝性疾病，如高脂血癥是有潛力的。

此外，由于肥胖可能是研究最多的斑馬魚代謝紊亂，食品提取物和化合物的減脂能力已經過測試。斑馬魚胚胎和幼魚因本身透明，脂肪染色可直接觀察，可以用來快速觀察脂肪沉積。通過這種方式，葡萄酒渣提取物和白藜蘆醇及其糖苷(多酚類化合物，來源于如葡萄，葡萄酒，花生和可可)被證明可以增加脂肪儲備消耗[12-13]。山奈酚(高良姜山奈酚和秈稻山奈酚中存在的一種氟類化合物)具有調節(jié)脂質代謝的抗肥胖作用[14]。飲食誘導肥胖(dietary induced obesity，DIO)成年斑馬魚體重指數(body mass index，BMI)升高，血TG升高，肝脂肪變性(肝脂堆積)。圣草次苷是檸檬中的一種抗氧化類黃酮，在DIO斑馬魚中顯示出類似于高脂飲食對大鼠的降脂作用[15]。金巴利番茄可通過調節(jié)脂肪生成相關基因的表達，改善飲食誘導的肥胖，尤其是血脂異常和肝脂肪變性[16]?？偟膩碚f，DIO斑馬魚是一個很有吸引力的模型系統(tǒng)，用來評估功能性食品和化合物對肥胖發(fā)育和治療的影響。

總之，斑馬魚可以用來模擬代謝紊亂，因為大多數不平衡和癥狀在這個模型中被精確地復制。

1.2 抗氧化性能

斑馬魚被廣泛用于篩選具有抗氧化潛力的分子，方法有多種，比如直接測定活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生，或者測量其他氧化損傷的生物標志物和相關過程。多糖一般是功能食品成分的重要補充來源。Gao等[17]和Lee等[18]研究了蘆薈多糖在偶氮二異丁脒鹽酸鹽(2,2′-Azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride，AAPH)誘導和巖藻多糖在炎癥誘導的斑馬魚中的抗氧化性能。蘆薈多糖和巖藻多糖處理組均顯著降低了ROS的產生。Chen等[19]人對幾種黃酮類化合物進行了篩選，發(fā)現雖然大多數測試分子降低了ROS的產生，但其中一些分子增加了ROS的產生。

氧化應激誘導的細胞凋亡也被研究，以進一步評估化合物的抗氧化能力。與未處理組相比，AAPH誘導前用蘆薈多糖處理斑馬魚、高糖誘導前用墨角藻黃素處理斑馬魚、乙醇誘導前用多酚類化合物處理斑馬魚、紫外線(ultraviolet radiation b，UVB)照射前用槲皮苷和黃酮處理斑馬魚均可使細胞凋亡減少。

最后，其他氧化損傷的生物標志物已經被用來評估功能分子的抗氧化能力，如脂質過氧化標志物，包括丙二醛(malondialdehyde，MDA)。

1.3 免疫調節(jié)

斑馬魚作為脊椎動物，有較成熟的免疫系統(tǒng)，具有先天性和獲得性2種免疫系統(tǒng)[20]，斑馬魚免疫系統(tǒng)與哺乳動物相似，包括各種白細胞種群、炎癥介質和信號分子[21]。炎癥的主要特征之一是局部炎癥介質的釋放引起毛細血管床血管擴張和血管通透性增加，從而引起熱、腫脹和發(fā)紅。這種炎癥反應的關鍵功能之一是將中性粒細胞輸送到受損或受感染的組織中。對組織損傷或感染的有力反應必須包括通過趨化刺激將先天免疫系統(tǒng)的細胞招募到受影響的部位。利用轉基因斑馬魚(中性粒細胞特異性髓過氧化物酶啟動子下表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)觀察中細粒細胞向傷口部位遷移的數量來篩選從天然產物中提取化合物的抗炎活性[22]?？寡椎钠渌^察指標如炎癥因子也常來篩選抗炎物質，結核桿菌素B(tuberatolide B，TTB)是來源于馬尾藻類海草，研究發(fā)現TTB顯著抑制脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導斑馬魚炎癥生產的促炎細胞因子如白介素(interleukin-6，IL-6)和IL-1β(interleukin-1β)，表明TTB可能被用作功能性抗炎食品和營養(yǎng)保健品[23]。腸道免疫也是近幾年來研究比較多的一個方面，Wang等[24]用嗜水氣單胞菌感染斑馬魚，發(fā)現兩株高黏附性乳酸菌處理后具有腸道粘膜免疫保護作用。

1.4 抗血管新生的活動

腫瘤新生血管的形成是以血管生成的方式發(fā)生的，若能夠抑制腫瘤組織的血管生成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應，勢必可以達到抑制腫瘤生長和轉移的目的[25]。斑馬魚血管系統(tǒng)的發(fā)育和解剖結構與哺乳動物相似。利用轉基因血管熒光斑馬魚，即在內皮細胞中表達綠色熒光蛋白(GFP)，在顯微鏡下主動脈及節(jié)間血管在清晰可見，這使得在體內觀察新血管的形成成為可能，現已成為一種理想的抗血管生成高通量藥物篩選的模型，已廣泛應用于藥物研究，也用于食品研究。

目前在該領域研究最多的主要活性成分是多酚。Lam等[26]通過斑馬魚胚胎實驗測試了諾比列酮(一種從柑橘類水果中提取的多甲氧基類黃酮)，發(fā)現這種多酚抑制了斑馬魚節(jié)間血管的形成。其他多酚類化合物如槲皮素[27]破壞轉基因斑馬魚胚胎的節(jié)間血管、背主動脈和后主靜脈的形成、白藜蘆醇衍生物[28]引起斑馬魚節(jié)間血管收縮，下調血管內皮細胞生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)mRNA的表達抑制血管生成和4-甲基傘形花序酮[29]抑制轉基因斑馬魚節(jié)間血管的形成。除此之外，一些天然提取物，比如肉桂[30]、硫酸多糖[31]和綠原酸[32]均可阻斷斑馬魚新生血管的形成。

總之，斑馬魚為測試食物化合物和提取物在血管生成中的有效性提供了理想的環(huán)境，不僅提供了有關血管發(fā)育的信息，而且還確定了受影響的血管或組織的類型。

1.5 神經保護

近年來，斑馬魚被廣泛應用于神經科學研究中，斑馬魚胚胎在24 hpf(受精后24 h)原代神經元細胞開始分化，48 hpf腦室形成，在6 dpf(受精后6 d)所有的神經系統(tǒng)形成，可在短時間呈現整個神經系統(tǒng)。斑馬魚神經元的形成及分化等過程與其他脊椎動物相似[33]，整個神經遞質系統(tǒng)，包括膽堿能，多巴胺能和去甲腎上腺素能通路已經被闡明[34-35]。斑馬魚已被用于測試食品化合物在不同神經科學領域的生物活性。

Richetti等[36]人研究表明槲皮素和蘆丁對東莨菪堿誘導的斑馬魚抑制性回避記憶缺陷也具有潛在的保護作用，這表明這些黃酮類化合物可能是預防和治療神經退行性疾病的潛在藥物。斑馬魚胚胎時期還可以觀察到一些運動行為，如逃避反射、游動等[37]。利用紅外攝影機連續(xù)采集圖像可以對斑馬魚運動進行分析，在某一特定時間內采集斑馬魚運動軌跡，可以了解食品處理后斑馬魚運動的次數、持續(xù)時間和距離。Kumari等[38]人研究發(fā)現α-亞麻酸能夠治療戊四唑誘導的斑馬魚癲癇發(fā)作，使斑馬魚癲癇發(fā)作時總運動距離和平均速度均有明顯改善，也能顯著減少c-fos mRNA水平。斑馬魚在學習，睡眠，藥物成癮及其他神經行為表型與人類相似[39-40]。此外，有人觀察到斑馬魚在回避食物等行為上有變化，食欲和食物攝入量的調節(jié)與哺乳動物的調節(jié)相似[41]。因此，在該模型中研究食物或食物復合物成癮或厭食癥等復雜行為是可能的[42]。

1.6 其他條件

姜辣素是生姜中的主要成分，Chen等[43]報道了10-姜辣素對斑馬魚胚胎造血的促進作用高于其他姜辣素。為了研究益生菌保留率與腸道蠕動的關系，開發(fā)抗便秘益生菌，Lu等[44]根據斑馬魚模型的熒光強度和腸道蠕動促進作用對菌株其進行篩選。結果表明，副干酪X11具有較好的腸蠕動促進作用。Cai等[45]研究了羊肚菌多糖對斑馬魚的美白作用，為羊肚菌多糖在食品和化妝品行業(yè)中潛在的美白作用提供了依據。

2 結語

隨著消費水平的不斷升級，消費者對于高品質的食品、功能性食品等的需求也在日益攀升，但是由于科研投入少，基礎研究不夠，并且商家肆意夸大產品的功能與療效，使得消費者產生排斥心理。開發(fā)生產的功能性食品大致分為三代，第一代為各類強化食品和滋補產品，未經過嚴格的實驗證明或者科學論證，僅根據食品中的營養(yǎng)成分來推斷功能，第二代為經過動物和人體實驗證明具有某種生理調節(jié)功能的食品，目前我國市場上大多為該類功能性食品，第三代是明確食品中的功能因子以及產生的作用機理，開發(fā)出量效與構效明確的新型功能性食品，這是我國功能性食品未來研究和發(fā)展的重點[46]。所以建立快速、有效的毒性和功效檢測平臺，加強食品安全和有效性驗證及其機制研究的相關檢測，將為人民群眾的飲食安全提供更好的保障。

斑馬魚是近年來用于藥學領域研究的熱門模式生物，其優(yōu)勢在于化合物的高通量活性篩選。在食品研究方面，斑馬魚實驗結果不僅可以成為功能性食品配方確定的依據，即通過實驗證明最終確定的配方優(yōu)于其它配方，包括不同原料組方的比較，以及相同原料組方不同配比的比較，甚至同一配方不同制備工藝的比較，還可以研究產品功效機制，為配方的功效在機制上提供支撐。斑馬魚已被證明是食品領域研究中一個有價值的工具。但目前采用斑馬魚進行功效及機制評價的研究多集中于食品提取物，對食品全組分功效學研究篩選的報道較少，缺乏數據支撐。將斑馬魚模型與現有的體外實驗與哺乳動物實驗及人體試驗相結合，將為深入開展食品研究提供更可靠、快速、有效的方法體系，為推動食品、特別是功能性食品研發(fā)進程具有重要意義。