藥物誘導(dǎo)聯(lián)合流出道縮窄構(gòu)建兔腹主動(dòng)脈瘤模型的實(shí)驗(yàn)研究

趙夢(mèng)婕，任玥穎，胡璇，孫安強(qiáng)，陳增勝,3，徐在品

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100083；3.北京航空航天大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083）

腹主動(dòng)脈瘤（abdominal aortic aneurysms，AAA），是指腹主動(dòng)脈的某一段的異常擴(kuò)張或局限性膨脹，最終使得管壁無(wú)法承受血流沖擊而破裂的一種高危性疾病，當(dāng)擴(kuò)張的腹主動(dòng)脈直徑超過(guò)正常腹主動(dòng)脈直徑1.5倍以上時(shí)即可診斷為AAA[1]。該病目前尚無(wú)可靠的治療方法，可選擇的僅有開(kāi)放修復(fù)術(shù)（open repair）或介入修復(fù)（endovascular aortic aneurysm repair，EVAR）[2-3]，這兩種主動(dòng)干預(yù)措施對(duì)患者而言都是昂貴且危險(xiǎn)的[4-5]。為尋找潛在的治療方案，必須對(duì)AAA的發(fā)生和發(fā)展加以理解，而動(dòng)物模型是用于研究AAA發(fā)生和發(fā)展機(jī)制的重要工具。過(guò)去常用的AAA動(dòng)物模型再現(xiàn)了炎癥、彈力纖維降解、細(xì)胞外基質(zhì)的破壞和主動(dòng)脈擴(kuò)張[6]等被預(yù)測(cè)為人類主動(dòng)脈瘤發(fā)展的決定因素。2016年，Crawford等[7]發(fā)現(xiàn)小直徑AAA的破裂或與流出道阻塞有關(guān)，這意味著除了腹主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的破壞以外，其壁面壓應(yīng)力的改變同樣影響AAA的形成和發(fā)展?；诖?，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)藥物浸潤(rùn)破壞動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)聯(lián)合腹主動(dòng)脈流出道縮窄增大血管壁面壓應(yīng)力，觀察不同藥物、不同壓力下AAA形成時(shí)間及血管病理變化的差異。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

無(wú)水氯化鈣（CaCl2）（生工生物工程上海股份有限公司）；1:250胰蛋白酶（生工生物工程上海股份有限公司）；普通外科器械包（上海醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司手術(shù)器械廠）；SSW-3顯微外科器械包（上海醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司手術(shù)器械廠）；貓用導(dǎo)尿管（古氏貿(mào)易上海有限公司，規(guī)格1.0/1.3）；VINNO 6獸用彩超診斷儀（飛依諾科技蘇州有限公司）；犬眠寶（青島漢河動(dòng)植物藥業(yè)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康新西蘭大白兔24只，雌性，體質(zhì)量2～3 kg，隨機(jī)分為4組，每組6只，AAA造模方法分別采用CaCl2浸潤(rùn)（CaCl2組）、CaCl2浸潤(rùn)聯(lián)合流出道縮窄（CaCl2+縮窄組）、胰蛋白酶浸潤(rùn)（胰蛋白酶組）、胰蛋白酶 浸潤(rùn)聯(lián)合流出道縮窄（胰蛋白酶+縮窄組）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 AAA模型的制備肌肉注射犬眠寶進(jìn)行全身麻醉（0.1 mL/kg），仰臥固定，術(shù)部無(wú)菌準(zhǔn)備。取臍下腹白切口，切開(kāi)腹腔后用無(wú)菌紗布將腸管包裹推向腹腔上方及右側(cè)，顯露腹主動(dòng)脈及伴行的腔靜脈[8]。顯微鑷鈍性分離腎下腹主動(dòng)脈前壁、側(cè)壁、后壁脂肪組織及其與腔靜脈之間間隙，游離出腎動(dòng)脈水平以下髂動(dòng)脈水平以上腹主動(dòng)脈段約1 cm，以游標(biāo)卡尺測(cè)量血管直徑。分別用寬1 cm，浸有0.75 mol/L CaCl2溶液或0.04 g/mL胰蛋白酶溶液的棉條包裹游離的腹主動(dòng)脈段，再用等寬橡皮條包裹棉條，以保護(hù)腔靜脈及周圍組織。30 min后去除棉條及橡皮條，生理鹽水反復(fù)沖洗3次，以防周圍組織粘連。藥物+縮窄組根據(jù)血管直徑，選擇型號(hào)1.0（直徑0.075 cm）或1.3（直徑0.105 cm）的貓導(dǎo)尿管于浸潤(rùn)段遠(yuǎn)心端同腹主動(dòng)脈平行結(jié)扎，后撤出導(dǎo)尿管，使之形成約50%～60%的縮窄。逐層關(guān)腹，術(shù)后連續(xù)使用青霉素3 d（40萬(wàn)U/只）。

1.3.2 彩超診斷儀檢測(cè)術(shù)后每周使用VINNO 6獸用彩超診斷儀，F(xiàn)4-12L探頭，將頻率調(diào)至3.2 MHz，對(duì)實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行腹主動(dòng)脈超聲檢查，觀察并測(cè)量浸潤(rùn)段腹主動(dòng)脈直徑變化。

1.3.3 組織病理學(xué)觀察2周后，犧牲實(shí)驗(yàn)兔，取腹主動(dòng)脈損傷段固定、包埋、切片，分別行HE染色觀察主動(dòng)脈壁組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞組成變化、EVG染色觀察動(dòng)脈瘤管壁彈力纖維破壞的程度。使用CaseViewer軟件于掃描圖上每組各取10處測(cè)量?jī)?nèi)膜、中膜厚度，取平均值。每組內(nèi)每張切片挑選3個(gè)200倍視野進(jìn)行拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件分別對(duì)每張照片測(cè)量黑色彈力纖維面積和視野內(nèi)組織總面積，并求出各個(gè)視野的彈力纖維比。

1.3.4 計(jì)算機(jī)模擬血管壁應(yīng)力假設(shè)血液為牛頓流體，密度為1 060 kg/m3[7]，動(dòng)態(tài)黏度為2.18 mPa·s[9]，假設(shè)每單位時(shí)間進(jìn)入腎下主動(dòng)脈的血液量是恒定的并且等于0.12 L/min[10]，輸入腹主動(dòng)脈術(shù)前直徑、狹窄后直徑和成瘤后直徑，使用ANSYS 15.0模擬AAA并計(jì)算不同情況下腹主動(dòng)脈管壁所受峰值壁應(yīng)力（peak wall stress，PWS）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 AAA超聲圖像及各組直徑、成瘤率比較

造模2周后，各組均無(wú)實(shí)驗(yàn)兔死亡。CaCl2組損傷段血管管壁呈強(qiáng)回聲影像、管壁增厚，血管直徑與未損傷段對(duì)比略有擴(kuò)張；CaCl2+縮窄組血管明顯擴(kuò)張，呈梭形；胰蛋白酶組管徑較未損傷段略有擴(kuò)張，管壁無(wú)明顯增厚；胰蛋白酶+縮窄組損傷段血管顯著擴(kuò)張，管壁變薄，較CaCl2+縮窄組瘤體形態(tài)更圓（圖1）。兩個(gè)單純藥物組血管擴(kuò)張均未達(dá)1.5倍，無(wú)AAA形成；CaCl2+縮窄組4只（4/6）成瘤，血管平均擴(kuò)張1.61倍；胰蛋白酶+縮窄組5只（5/6）成瘤，血管平均擴(kuò)張1.89倍。胰蛋白酶+縮窄組成瘤率及血管擴(kuò)張倍數(shù)均大于CaCl2+縮窄組（表1）。

2.2 組織病理學(xué)觀察

正常腹主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)由內(nèi)向外依次為內(nèi)膜、內(nèi)彈性膜（呈波浪狀，為內(nèi)、中膜分界線）、中膜（主要為中層平滑肌細(xì)胞和彈力纖維）、外膜，HE染色可見(jiàn)血管壁結(jié)構(gòu)清晰，中膜平滑肌排列整齊，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，EVG染色示彈力纖維完整連續(xù)，層次清晰，曲度明顯，內(nèi)膜極??；CaCl2組HE染色可見(jiàn)外膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，管壁正常結(jié)構(gòu)破壞，EVG染色示內(nèi)膜增厚，內(nèi)彈性膜曲度變直，中膜彈力纖維出現(xiàn)斷裂、碎片；CaCl2+縮窄組HE染色見(jiàn)外膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，中膜層結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，EVG染色見(jiàn)內(nèi)彈力膜與內(nèi)膜分離，形成腔隙，中膜層裂解；胰蛋白酶組HE染色見(jiàn)管壁結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，EVG染色示內(nèi)膜增厚，彈力纖維結(jié)構(gòu)完整，原有曲度改變，仍可見(jiàn)連續(xù)性；胰蛋白酶+縮窄組HE染色見(jiàn)管壁結(jié)構(gòu)疏松，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，EVG染色示彈力纖維層次不清，可見(jiàn)斷裂、變細(xì)及空泡形成（圖2）。

圖1 腹主動(dòng)脈超聲圖像（血流方向均為從右向左，箭頭指向?yàn)樗幬飺p傷段；圈內(nèi)為動(dòng)脈縮窄處） A：CaCl2組；B：CaCl2+縮窄組；C：胰蛋白酶組；D：胰蛋白酶+縮窄組Figure 1 Ultrasound image of the abdominal aorta(the right-to-left direction of blood fl ow,the arrow showing the drug injured segment,and inside the circle showing the coarctation of abdominal aorta)A:CaCl2 group；B:CaCl2 plus coarctation group；C:Trypsin group；D:Trypsin plus coarctation group

表1 各組腹主動(dòng)脈直徑變化及成瘤率比較（n=6）Table 1 Comparison of diameter changes and AAA formation rates of abdominal aorta in each group(n=6)

圖2 腹主動(dòng)脈HE（×100；標(biāo)尺：100 μm）、EVG（×400；標(biāo)尺：50 μm）染色結(jié)果Figure 2 HE(×100；scale bar:100 μm)and EVG(×400；scale bar:50 μm)staining results of abdominal aorta

2.3 內(nèi)膜、中膜厚度及各組彈力纖維面積百分比變化

正常腹主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度約為3.2 μm，藥物損傷使血管內(nèi)膜增厚，且CaCl2損傷后的血管內(nèi)膜厚度明顯大于胰蛋白酶損傷后的血管（均P＜0.05）。正常腹主動(dòng)脈血管中膜厚度約為134.83 μm，CaCl2組與CaCl2+縮窄組中膜較正常腹主動(dòng)脈增厚33.65%、150.14%，且均明顯高 于胰蛋白酶組與胰蛋白酶+縮窄組（均P＜0.05）；胰蛋白酶組與胰蛋白酶+縮窄組中膜厚度較正常腹主動(dòng)脈增加10.68%、13.55%，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。正常腹主動(dòng)脈彈力纖維面積約為血管總面積的41.48%，藥物損傷后各組彈力纖維面積百分比較正常腹主動(dòng)脈均明顯降低（均P＜0.05），相同藥物組間差異不明顯（均P＞0.05），CaCl2組明顯低于胰蛋白酶組，與胰蛋白酶+縮窄組差異不明顯（P＞0.05）；CaCl2+縮窄組明顯低于胰蛋白酶組與胰蛋白酶+縮窄組（P＜0.05）（表2）。

表2 腹主動(dòng)脈壁厚度變化及各組彈力纖維面積百分比（n=6，±s）Table 2 Changes in vessel wall thickness of abdominal aorta and percentage of elastic fiber area in each group(n=6,±s)

表2 腹主動(dòng)脈壁厚度變化及各組彈力纖維面積百分比（n=6，±s）Table 2 Changes in vessel wall thickness of abdominal aorta and percentage of elastic fiber area in each group(n=6,±s)

注：與正常腹主動(dòng)脈比較，P＜0.05Note:P＜0.05 vs.normal abdominal aorta

參數(shù) 正常腹主動(dòng)脈 CaCl2組 CaCl2+縮窄組 胰蛋白酶組 胰蛋白酶+縮窄組內(nèi)膜（μm） 3.20±1.00 91.20±8.181) 91.60±4.591) 77.73±5.33 58.20±5.20中膜（μm） 134.83±5.68 180.23±13.271) 337.27±21.721) 153.10±3.031) 149.23±7.051)彈力纖維面積百分比（%） 41.48±13.11 5.37±0.821) 2.80±0.701) 24.21±3.061) 15.59±3.381)

2.4 計(jì)算機(jī)模擬血管壁面壓應(yīng)力

正常狀態(tài)下血管壁面壓應(yīng)力約為13.342 kPa（1 mmHg=0.133 kPa），將腹主動(dòng)脈流出道縮窄后，縮窄處近心端的血管壁面壓應(yīng)力增大為13.397 kPa；成瘤后，流出道未縮窄的AAA壁面壓應(yīng)力約為13.384 kPa，而流出道縮窄的AAA壁面壓應(yīng)力約為13.436 kPa（圖3）。

圖3 縮窄與未縮窄的腹主動(dòng)脈壁面壓應(yīng)力示意圖（箭頭指向?yàn)檠鞣较颍?A：正常腹主動(dòng)脈；B：縮窄后的腹主動(dòng)脈；C：流出道未縮窄的AAA；D：流出道縮窄后形成的AAAFigure 3 Wall pressure stress of abdominal aorta with coarctation and without coarctation(arrow showing the direction of blood fl ow)A:Normal abdominal aorta；B:Abdominal aorta with coarctation；C:AAA without outfl ow coarctation；D:AAA with outfl ow coarctation

3 討論

AAA是一種動(dòng)脈退行性疾病，多發(fā)生于65歲以上人群[11-12]。在AAA形成中有4個(gè)主要過(guò)程：蛋白水解，氧化應(yīng)激，炎癥免疫反應(yīng)和血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）凋亡，每次脈動(dòng)后導(dǎo)致動(dòng)脈壁彈性和阻力喪失并阻礙正常動(dòng)脈直徑恢復(fù)的過(guò)程[13]。

鈣化是人體AAA的特征之一，約80%的AAA都顯示相當(dāng)大程度的主動(dòng)脈壁鈣化[14]。1988年Gertz等[15]使用CaCl2應(yīng)用于兔頸動(dòng)脈外膜誘導(dǎo)動(dòng)脈瘤形成，3周后，與對(duì)側(cè)頸動(dòng)脈相比，用CaCl2處理的動(dòng)脈段管腔直徑平均增加了61%，組織學(xué)檢查顯示，動(dòng)脈擴(kuò)張伴有彈性蛋白鈣化，VSMC缺失，炎性細(xì)胞明顯浸潤(rùn)，這是人類動(dòng)脈瘤新模型的第一份報(bào)告，其作用機(jī)制在于沉積的鈣鹽與彈性蛋白結(jié)合，直接破壞彈性纖維層；鈣鹽可以損傷內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，分泌基質(zhì)金屬蛋白酶降解彈性纖維，從而導(dǎo)致腹主動(dòng)脈擴(kuò)展，形成AAA。Freestone等[16]在1997年發(fā)表的研究中用0.25 mol/L CaCl2作用于新西蘭兔腹主動(dòng)脈，術(shù)后12周內(nèi)未誘導(dǎo)AAA形成；2001年Chiou等[17]用0.68 mol/L CaCl2應(yīng)用于C57 BL/6小鼠的腹主動(dòng)脈10 min，手術(shù)后3周形成AAA；2011年張明芳等[18]用0.75 mmol/L CaCl2溶液包裹浸潤(rùn)腹主動(dòng)脈，于術(shù)后6周直徑擴(kuò)張124.12%。本實(shí)驗(yàn)使用0.75 mol/L CaCl2溶液作用于兔腹主動(dòng)脈，聯(lián)合動(dòng)脈流出道縮窄，于術(shù)后2周使其動(dòng)脈擴(kuò)張達(dá)原來(lái)的1.61倍。

1990年，Anidjars等[19]首次通過(guò)灌注彈性蛋白酶誘導(dǎo)兔腎下AAA，由于其病理生理狀態(tài)較符合人類AAA特征，如內(nèi)側(cè)彈性蛋白退化和外膜巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)等[20]，成為AAA的經(jīng)典模型之一。彈力蛋白酶具有破壞大動(dòng)脈中層彈力蛋白結(jié)構(gòu)的特性，此法也用于大鼠、犬[21]、豬[22]的AAA模型中，在這些研究中，均發(fā)現(xiàn)了如內(nèi)膜增厚、中膜彈性層受損和破碎、中膜和外膜明顯的炎性浸潤(rùn)等特征。本實(shí)驗(yàn)從外膜包裹浸潤(rùn)，使胰蛋白酶滲透進(jìn)而消化中膜彈力層，同樣觀察到上述病理變化，相較傳統(tǒng)的胰蛋白酶灌注法，本實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便易行，術(shù)后2周血管擴(kuò)張達(dá)1.89倍。

Laplace定律和最大AAA直徑長(zhǎng)期用于指導(dǎo)AAA破裂的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和選擇修復(fù)的閾值建議[23]，最新的美國(guó)和歐洲對(duì)AAA的臨床實(shí)踐指南建議對(duì)AAA直徑≥5.5 cm的無(wú)癥狀患者進(jìn)行修復(fù)[24-25]，但這一標(biāo)準(zhǔn)過(guò)于單一且準(zhǔn)確性不高，有報(bào)道[26-27]顯示，通過(guò)研究AAA的生物力學(xué)或結(jié)構(gòu)特征可有助于提高破裂預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。有研究證明流出道阻塞的AAA與普通AAA相比PWS顯著增高[7]，當(dāng)PWS超過(guò)主動(dòng)脈壁強(qiáng)度時(shí)，AAA極有可能發(fā)生破裂[28]。通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬發(fā)現(xiàn)，流出道縮窄同樣使成瘤前后的血管壁應(yīng)力增大，因此將流出道縮窄與藥物損傷聯(lián)合，通過(guò)增大PWS加速血管擴(kuò)張，在相同時(shí)間、相同條件下，縮窄后的血管獲得直徑更大的AAA。這意味著通過(guò)藥物損傷聯(lián)合腹主動(dòng)脈流出道縮窄可以在更短的時(shí)間內(nèi)獲得AAA，為研究提供便利。

總之，藥物損傷聯(lián)合腹主動(dòng)脈流出道縮窄能成功構(gòu)建兔AAA模型，縮短造模時(shí)間，胰蛋白酶浸潤(rùn) 聯(lián)合流出道縮窄造模效果優(yōu)于CaCl2浸潤(rùn)聯(lián)合流出道縮窄造模，且較符合臨床AAA特征。