青蝦源維氏氣單胞菌雙重PCR檢測方法的建立

劉曉丹，肖自東，孫 威，李席席，周一凡，張曉君

(揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州 225009)

維氏氣單胞菌的檢測以往主要采用形態(tài)分類、生理生化分析等方法，這些方法不僅較為繁瑣，而且對血清型復雜、生化特征不穩(wěn)定的病原菌容易誤判。而分子生物學檢測技術的發(fā)展為病微生物快速檢測提供了新的技術方案，PCR技術具有快捷、準確等優(yōu)點，已大量應用于病原菌檢測。其中最為常見的是16S rRNA基因序列的常規(guī)PCR檢測，雖然其最低可檢測pg/μL級別的基因組DNA，但16S rRNA 序列對原核生物具有高度保守性，較難區(qū)分親緣關系較近的細菌，存在漏檢和假陽性的可能性，相比之下，雙重PCR檢測因其特異性更強，靈敏度更高，廣泛應用于細菌檢測[17-18]。

青蝦，學名日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)。在中國、日本、朝鮮半島以及東南亞都有著廣泛分布，具有生長速度快，繁殖能力強，經(jīng)濟價值高等特點。近年來青蝦養(yǎng)殖面積及其產(chǎn)量穩(wěn)步提高，但在青蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中一直遇到病原微生物感染的難題，影響其健康養(yǎng)殖以及水產(chǎn)品的安全。其中維氏氣單胞菌是引起青蝦病害的主要致病菌之一[14]，快速、準確地檢測青蝦源維氏氣單胞菌對該菌引起的青蝦病害對疾病的預防、治療以及水產(chǎn)品安全性顯得尤為重要。本試驗利用分子生物學檢測方法，根據(jù)NCBI已發(fā)表的維氏氣單胞菌CB51菌株基因組序列、促旋酶B亞單位基因gyrB和編碼細菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的保守序列設計引物，設定合適的反應體系及反應條件，建立了一種青蝦源維氏氣單胞菌的雙重PCR快速檢測方法，為青蝦源維氏氣單胞菌感染的臨床診斷、疾病治療、調(diào)查研究等提供重要參考資料。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

試驗用維氏氣單胞菌Y3-1菌株由本試驗室從發(fā)病青蝦中分離鑒定。嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)G3菌株、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)LJ-1菌株、哈維弧菌(V.havveyi)DY-1菌株、 副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)LNX-2菌株、需鈉弧菌(V.natriegens)XA-1菌株、非O1霍亂弧菌(non-O1V.cholerae)GXFL1-4菌株、陰溝腸桿菌(E.cloacae)XL3-1菌株、產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)WF1-1菌株均由本試驗室保存。

1.2 主要試劑

細菌DNA提取試劑盒、GelStain(全式金產(chǎn)品)；瓊脂糖(Biowest Agarose)；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(青島海博公司生產(chǎn))；Premix Taq(Takara Taq Version 2.0 plus dye)、DL2000 DNA Marker(Takara生物公司生產(chǎn))。

1.3 引物設計與合成

根據(jù)NCBI已報道的維氏氣單胞菌CB51菌株(NZ_CP015448.1)的gyrB和rpoD基因，通過Primer primer 5.0軟件設計引物序列，利用細菌16S rRNA基因通用引物進行普通PCR檢測，序列及擴增片段長度見表1。引物由南京擎科生物公司合成，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 模板DNA制備

將分離菌株在瓊脂培養(yǎng)基上劃線隔夜培養(yǎng)，挑取單菌落，接種于液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)16 h，細菌DNA的獲得參照試劑盒所述方法提取，以此為檢測模板，-20 ℃保存。

1.5 分離菌的鑒定

為了鑒定分離菌株Y3-1，以分離菌的DNA作為模板，16S rRNA的通用引物為擴增引物(表1)。試驗使用20 μL體系，其中2×Premix Taq 10 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min的預變性；94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸7 min。PCR反應完成后用1% 瓊脂糖凝膠進行電泳分析，將擴增產(chǎn)物送南京擎科生物公司進行測序，測序后所得到的16S rRNA基因序列利用BLAST進行同源性分析。

同時，將分離菌分別接種于細菌理化特性鑒定用生化管中，測定分離菌理化特性，并對照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》[19]對分離菌進行種屬判定。

1.6 雙重PCR檢測方法的建立

以雙重PCR的兩對引物對模板進行擴增，通過比較不同引物濃度、退火溫度及反應體系下PCR的擴增結(jié)果，優(yōu)化維氏氣單胞菌雙重PCR最佳反應體系。最佳反應體系為20 μL，其中DNA模板1 μL、 Premix Taq 10 μL、ddH2O 7 μL、 gyrB-F、R(10 μmol/L)各0.5 μL，rpoD-F、R(10 μmol/L )各0.5 μL；同時用ddH2O設置陰性對照。最佳反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s、35循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。配置1.0%TAE緩沖液和1.0 % 凝膠，PCR產(chǎn)物5 μL，DL2000 Marker 5 μL，電泳110 V，35 min。

1.7 雙重PCR擴增的特異性

以菌株維氏氣單胞菌Y3-1、哈維弧菌DY-1、弗氏檸檬酸桿菌LJ-1、副溶血性弧菌LNX-2、需鈉弧菌XA-1、霍亂弧菌GXFL1-4、陰溝腸桿菌XL3-1、產(chǎn)氣腸桿菌WF1-1、嗜水氣單胞菌樣品G3菌株的DNA為檢測模板，同時設置ddH2O作為模板的陰性對照組，按照1.6中建立的反應條件進行雙重PCR擴增，檢測其特異性。

1.8 雙重PCR擴增的靈敏性

將上述試驗制備的維氏氣單胞菌(A.veronii)Y3-1 DNA模板，分光光度計測定濃度后，用滅菌的去離子水進行10倍倍比(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7)稀釋，以該稀釋液作為PCR模板，按上述建立的反應條件進行雙重PCR擴增。擴增完成后，取5 μL擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，記錄結(jié)果。

1.9 送檢樣品的檢測

對10份疑似維氏氣單胞菌(A.veronii) Y3-1感染的青蝦幼蝦送檢樣本，用無菌的生理鹽水對蝦體表進行多次沖洗，將幼蝦體表面細菌沖洗干凈，再用75%的酒精棉球?qū)η辔r幼體體表進行消毒。在無菌操作臺內(nèi)，將蝦體制備成勻漿液，劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取優(yōu)勢單菌落移接于普通LB培養(yǎng)基斜面上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，獲得純培養(yǎng)的細菌。之后將其接種到LB液體培養(yǎng)基中28 ℃，180 r/min，16 h擴大培養(yǎng)。取1 mL菌液，用試劑盒提取細菌DNA，以此為雙重PCR模板，用上述所建立的檢測方法，對送檢樣品分離的細菌DNA進行檢測。同時按照常規(guī)鑒定方法如生理生化及PCR檢測，對所分離細菌鑒定，以檢驗雙重PCR檢測方法的可靠性。

2 試驗結(jié)果

2.1 分離菌鑒定結(jié)果

在NCBI將分離菌Y3-1所擴增的16S rRNA序列進行Blast，其序列與多株維氏氣單胞菌的相似性為100%，表明Y3-1與維氏氣單胞菌的親緣關系非常近。分離菌的主要理化特性(表2)與《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》[19]中標準菌株維氏氣單胞菌的理化特性相符。因此，綜合理化特性以及分子鑒定結(jié)果，菌株Y3-1為維氏氣單胞菌。

表2 分離菌理化特性Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of the isolates

注：“+”示陽性，“-”示陰性，上標*表示數(shù)據(jù)來自文獻[19]

2.2 雙重 PCR 反應結(jié)果

將維氏氣單胞菌(A.veronii)Y3-1分離培養(yǎng)后，提取DNA，以此為PCR模板，利用設計的gyrB，rpoD兩對引物進行PCR擴增。成像結(jié)果表明，建立的雙重PCR檢測方法擴增出了兩條特異性帶，大小分別為815 bp、554 bp，ddH2O對照組未擴增條帶，呈陰性(圖1)。

圖1 維氏氣單胞菌雙重PCR檢測Fig.1 Duplex PCR detection for A.veronii

CK:對照組；M：DL2000 DNA Marker；1：rpoD；2：gyrB；3：rpoD和gyrB

2.3 雙重PCR擴增的特異性結(jié)果

利用建立的維氏氣單胞菌雙重PCR檢測方法對維氏氣單胞菌Y3-1菌株DNA以及8份不同樣品菌株DNA進行檢測。結(jié)果顯示，維氏氣單胞菌Y3-1擴增出了兩條目的條帶，大小分別為815 bp、554 bp，呈陽性；其它菌株DNA以及ddH2O未擴增出特異性條帶(圖2)。

圖2 維氏氣單胞菌雙重PCR特異性檢測Fig.2 Duplex PCR specificity of detection for A.veroniiM：DL2000 DNA Marker；1：維氏氣單胞菌Y3-1；2：哈維弧菌DY-1；3：嗜水氣單胞菌G3；4：副溶血性弧菌LNX-2；5：需鈉弧菌XA-1；6：霍亂弧菌GXFL1-4；7：陰溝腸桿菌XL3-1；8：產(chǎn)氣腸桿菌WF1-1；9:弗氏檸檬酸桿菌LJ-1；10：ddH2O。

2.4 雙重 PCR 擴增的靈敏性結(jié)果

靈敏性檢測結(jié)果顯示，在1.8×10-2ng/μL 時仍能檢測到gyrB和rpoD的目的條帶，在1.8×10-3ng/μL 時只能檢測gyrB的目的條帶，所以該方法的靈敏度可達1.8×10-2ng/μL，靈敏度良好(見圖3)。

圖3 維氏氣單胞菌雙重PCR靈敏度檢測Fig.3 The sensitivity detection of duplex PCR for A.veroniiM:DL 2000 DNA Maker；1-8：1.8 ng/μL-1.8×10-7 ng/μL

2.5 送檢樣品雙重PCR檢測結(jié)果

應用建立的雙重PCR方法檢測送檢樣品，結(jié)果檢出陽性9份，1份樣本和對照組呈陰性(圖4)，檢測結(jié)果與生理生化、分子生物學鑒定的結(jié)果相符合。表明本試驗方法準確性高，適用于臨床檢測。

圖4 送檢樣品及陰性對照雙重PCR檢測結(jié)果Fig.4 Results of detection by duplex PCR for A.veroniiM:DL 2000 DNA Maker；1-10：送檢樣品；11:ddH2O

3 討論

潘曉藝等[20]、邊宇等[21]選擇16S rRNA和氣溶素(Aer)基因運用于維氏氣單胞菌的快速檢測，這兩種檢測方法的靈敏度分別為1.35×10-3ng/μL 和1.58×10-3ng/μL，本實驗建立的雙重PCR檢測方法最低檢測的基因組DNA濃度為1.8×10-2ng/μL，從靈敏度的角度，選擇維氏氣單胞菌16S rRNA和氣溶素(Aer)基因建立的雙重PCR檢測方法能夠檢測出更低濃度的模板。但是該檢測方法的檢測范圍只局限于攜帶氣溶素(Aer)基因的維氏氣單胞菌菌株，對于非致病菌株以及未攜Aer基因的菌株檢測效果不佳。且有調(diào)查顯示，不同來源的維氏氣單胞菌菌株毒力基因氣溶素攜帶率為93.8%[22]，毒力基因攜帶情況不同，致病性也會有較大差異[23]，因此選用氣溶素等毒力基因作為PCR檢測對象不利于維氏氣單胞菌的流行病學調(diào)查。gyrB基因是編碼促旋酶B亞單位基因，該基因具有較高的堿基替換率，在氣單胞菌種間堿基最大差異為15.2 %，分辨率高，更適合親緣關系近的細菌鑒定[19,24]。朱成科等[25]利用gyrB基因和黏附素基因(Aha)建立了黃顙魚源維氏氣單胞菌雙重PCR檢測方法，該檢測方法對于維氏氣單胞菌標準菌株ATCC35624及黃顙魚源分離菌株具有很好的檢測效果，細菌黏附素是細菌表面的一些大分子物質(zhì)，和細菌粘附密切相關，但鑒于細菌黏附素有很多種，因此并不是細菌分類鑒定的優(yōu)選基因。rpoD 是編碼細菌RNA聚合酶σ70因子基因，能夠?qū)Υ蟛糠謿鈫伟M行準確而一致的區(qū)分[26]，廣泛應用于氣單胞菌屬的單基因分型[27]。管家基因gyrB和rpoD因其較保守，且具有一定變異的可能，通過分析其序列可以更好地區(qū)別同屬不同種[28]。因此本研究將gyrB和rpoD基因結(jié)合起來分析，分別設計了一對特異性引物，采用雙重PCR方法，以提高檢測準確率。對青蝦源維氏氣單胞菌Y3-1擴增出兩條大小分別為851 bp (gyrB)和554 bp(rpoD)的特異性條帶(圖1)，而對嗜水氣單胞菌等常見水產(chǎn)動物病原菌檢測無交叉反應，表明本試驗建立的雙重PCR方法特異性良好(圖2)，且該檢測方法對DNA模板的最低檢測濃度為1.8×10-2ng/μL，也顯示出較好的靈敏性(圖3)，其臨床樣品檢測結(jié)果與生理生化鑒定結(jié)果保持一致(圖4)，表明本研究建立的雙重PCR檢測方法適用于青蝦源維氏氣單胞菌的檢測。

試驗建立的青蝦致病株維氏氣單胞菌雙重PCR檢測方法，具有靈敏性較高、特異性較強等特點，能夠快速、準確地檢測出青蝦源維氏氣單胞菌。