三氯生對斑馬魚卵巢抗氧化和凋亡相關(guān)基因表達的影響

王 凡，牛曉瑩，劉 飛，袁金翠，李聰歌，馬雅雯，孟祥杰

(洛陽師范學(xué)院，河南洛陽 471022)

三氯生(Triclosan，TCS)是一種廣譜抗菌劑，被廣泛應(yīng)用于洗漱用品、化妝品、醫(yī)療用品和清潔用品中。隨著TCS的廣泛應(yīng)用，在很多類型的水體(在污水處理廠的進、出水的濃度高達86.2 μg/L和2.7 μg/L，自然河水中的濃度高達2.3 μg/L)，沉積物及水生生物體，甚至人體的血漿和母乳中均能被檢測到TCS的存在，因此，TCS對人體的潛在危害及毒理學(xué)研究引起了廣大研究者的關(guān)注[1-2]。

由于水環(huán)境是TCS主要分布領(lǐng)域，因此，研究TCS對水生生物的影響顯得至關(guān)重要。已有研究表明，TCS對水絲蚯(Limnodrilushoffmeisteri)、斑馬魚(Daniorerio)產(chǎn)生了致死效應(yīng)[3]；對蝌蚪、鯉(Cyprinuscarpio)產(chǎn)生了內(nèi)分泌干擾性[4，5]；對斑馬魚、鯽、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)等產(chǎn)生了免疫和遺傳毒性[6-8]；對海膽產(chǎn)生了生殖毒性[9]。迄今為止，TCS對水生生物生殖毒性的分子機制研究較少。斑馬魚是一種重要的模式水生生物，因基因與人類基因高度同源，從而經(jīng)常被應(yīng)用于毒理學(xué)和藥理學(xué)研究中。本研究以斑馬魚為實驗材料，探究TCS對其卵巢抗氧化和凋亡相關(guān)基因表達的影響，旨在揭示TCS對硬骨魚類生殖毒性的分子機制，同時為水環(huán)境治理和水生生物保護提供技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

試驗所用斑馬魚購自上海誠信漁場，體長為1.5～2.1 cm，選用健康狀況良好、行為敏捷、大小均勻的斑馬魚為實驗對象，暫養(yǎng)于60 L的水族箱中，水量20 L，溫度為(22±3 ) ℃，pH值為6.9±0.2，連續(xù)不間斷充氧。每天投喂2次，用曝氣72 h的自來水及時替換養(yǎng)殖用水，并清理缸內(nèi)斑馬魚殘餌及糞便，暫養(yǎng)7 d后開始正式實驗。

1.2 試驗設(shè)計

查閱相關(guān)資料可知，TCS對斑馬魚的96 h LC50為0.34 mg/L[10]，在此基礎(chǔ)上，再根據(jù)TCS在環(huán)境水體中的相關(guān)濃度，設(shè)置2個TCS處理組，其暴露濃度分別是1/10 LC50(0.034 mg/L)、1/5 LC50(0.068 mg/L)，每組設(shè)置兩個平行，并設(shè)置空白對照組。隨機選取暫養(yǎng)后大小均勻的斑馬魚600尾，平均放在6個裝有20 L上述TCS處理液的水族箱中。每天更換TCS處理液1/2，持續(xù)暴露42 d。

1.3 樣本的制備

暴露實驗結(jié)束后，選取大小基本均勻且健康雌性斑馬魚進行解剖，每個濃度取5個樣本，每個樣本是由3尾斑馬魚卵巢的混合樣組成。然后把樣本迅速轉(zhuǎn)移到-80 ℃超低溫低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

宗教是出世的，還是入世的？這取決于我們對世俗化的理解。 從宗教與世俗社會分離的一面來說，宗教是出世的； 從宗教與世俗社會結(jié)合的一面來說，宗教是入世的。 宗教與世俗社會的分離與結(jié)合變幻莫測，所以每一種宗教往往既具有世俗化的特質(zhì)，又具有遠(yuǎn)離世俗化的特質(zhì)。 判斷宗教是否世俗不僅僅要看宗教與現(xiàn)實社會的結(jié)合程度，更要看宗教所追求的根本目標(biāo)，從這個角度而言，所有宗教的本質(zhì)都是出世的，也因此是非世俗的。

1.4 抗氧化和凋亡相關(guān)基因表達的檢測

將反轉(zhuǎn)錄后得到的各樣本的cDNA、目的基因或內(nèi)參基因的上下游引物、Bestar SybrGreen qPCR mastermix(德國DBI公司)制備成20 μL的RT-qPCR反應(yīng)體系，放入RT-qPCR儀中進行擴增。反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性2 min；循環(huán)條件：95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，同時檢測熒光信號，40個循環(huán)反應(yīng)；融解曲線95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，55～98 ℃(10 s/循環(huán)0.5 ℃/循環(huán))86個循環(huán)。PCR擴增完成后提取Cq值，并用2-ΔΔt法計算目的基因的相對表達結(jié)果。

TCS對斑馬魚卵巢凋亡相關(guān)基因的相對表達量的影響如2所示。TCS暴露斑馬魚42 d 后，與空白對照組相比，Bcl-2 mRNA的相對表達量在0.034 mg/L TCS濃度組中輕微上調(diào)，上調(diào)了7.3%，在0.068 mg/L TCS組中顯著下調(diào)，下調(diào)了33.8%。Bax mRNA表達量在兩組處理中顯著上調(diào)，分別上調(diào)了85.4%和52.4%。MDM2 mRNA表達量在 0.034 mg/L TCS組中上調(diào)了23.1%，在0.068 mg/L TCS 濃度中下調(diào)了12.5%，但與對照組相比較無顯著差異。p53 mRNA表達量在0.034 mg/L TCS濃度組時呈極顯著上調(diào)，且上調(diào)了283.3%。與對照組相比，0.068 mg/L TCS 濃度組的Bcl/Bax比值顯著降低。

表1 PCR所用基因的特異性引物及其序列Tab.1 Primers used for PCR

1.4.2 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

在正常生理環(huán)境下，動物體組織內(nèi)活性氧(ROS)和抗氧化防御物質(zhì)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)動物受到外界刺激后其組織內(nèi)ROS產(chǎn)生量可能會超過機體負(fù)荷量，從而打破這一動態(tài)平衡，就會對生物體內(nèi)組織產(chǎn)生氧化損傷[13]。

[27] G. John Ikenberry and Darren J. Lim, “China’s Emerging Institutional Statecraft: The Asian Infrastructure Investment Bank and the Prospects for Counter-Hegemony,” Project on International Order and Strategy at Brookings, April 2017, p. 12.

1.4.1 引物序列

為了驗證目的基因(SOD、GPx1a、CAT、sMT-B、MT-2、Bcl-2、Bax、p53、MDM2)的擴增效率與內(nèi)參基因(β-actin)的擴增效率是否滿足RT-qPCR相對定量2-ΔΔct法的要求，將目的基因引物與內(nèi)參基因引物同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線分析。

1.4.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

城市規(guī)劃是用預(yù)測的眼光來對城市的空間建設(shè)、社會管理以及經(jīng)濟構(gòu)建進行科學(xué)的構(gòu)想，制定完善的方案來服務(wù)于未來城市建設(shè)的一個過程。城市規(guī)劃是城市建設(shè)之前的一個重要階段，對于城市的整體建設(shè)有著指導(dǎo)與引領(lǐng)的作用，它屬于城市管理的一部分。城市規(guī)劃需要綜合考慮多方面的因素來制定城市規(guī)劃方案，因為城市本身處于一個動態(tài)變化的過程中，城市本身內(nèi)在的因素具有高度的復(fù)雜性，同時城市面臨復(fù)雜的外部環(huán)境，這就要求城市規(guī)劃方案制定要全面。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)來表示，采用Dunnett’s法來分析各TCS濃度組與空白對照組之間的差異，若P<0.05，則為差異顯著；P<0.01則為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 TCS對斑馬魚卵巢抗氧化相關(guān)基因表達的影響

大數(shù)據(jù)發(fā)展拓展了學(xué)習(xí)的時間和空間，使教育形式發(fā)生巨大變化。以大數(shù)據(jù)為依托，“互聯(lián)網(wǎng)+”時代的到來，豐富多彩的教學(xué)軟件，便捷的手機APP，為學(xué)習(xí)提供便利，提升了教學(xué)質(zhì)量。這對大學(xué)英語教學(xué)既是發(fā)展的機遇，也是生存的危機。隨著新生入學(xué)英語水平的提高，大學(xué)英語學(xué)分比例開始下降，由原來的16分壓縮到9分或6分；越來越多的大學(xué)新生只需要學(xué)習(xí)一年的大學(xué)英語，甚至有些學(xué)生英語成績優(yōu)秀者可以免修。

圖1 TCS對斑馬魚卵巢抗氧化相關(guān)基因mRNA表達的影響Fig.1 Effect of TCS on mRNA expression of antioxidation-related genes in ovary of D.Rerio

2.2 TCS對斑馬魚卵巢凋亡相關(guān)基因表達的影響

β-actin(內(nèi)參)、抗氧化相關(guān)基因(SOD、GPx1a、CAT、sMT-B和MT-2)和凋亡相關(guān)基因(Bcl-2、Bax、p53和MDM2)的引物序列來自相關(guān)研究報道[11,12]。

圖2 TCS對斑馬魚卵巢凋亡相關(guān)基因mRNA表達的影響Fig.2 Effect of TCS on mRNA expression of apoptosis-related genes in ovary of D.Rerio

3 討論

3.1 TCS對斑馬魚卵巢抗氧化相關(guān)基因表達的影響

按照總RNA 極速抽提試劑盒(上海飛捷生物技術(shù)有限公司)提供的方法及步驟，提取斑馬魚卵巢中的RNA。對提出的RNA用凝膠電泳分析其質(zhì)量，并用超微量分光光度計檢測其純度。選取28s/18s約為2∶1且OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0的RNA樣本，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(東洋紡生物科技有限公司)的步驟進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

TCS對斑馬魚卵巢抗氧化相關(guān)基因的相對表達量的影響如圖1所示。與空白對照組相比，SOD基因和sMT-B基因在TCS處理組中的表達水平均出現(xiàn)了下調(diào)趨勢，且SOD基因在0.068 mg/L濃度組極顯著下調(diào)，下調(diào)了60.8%，而sMT-B基因表達無顯著差異。GPx1a基因和CAT基因在0.034 mg/L濃度組中的表達水平表現(xiàn)為上調(diào)，而在0.068 mg/L濃度組中的表達水平表現(xiàn)為下調(diào)，且GPx1a基因在0.034 mg/L濃度組顯著上調(diào)，上調(diào)了44.5%，在0.068 mg/L濃度組顯著下調(diào)，下調(diào)了55.5%，而CAT基因在0.068 mg/L濃度組表現(xiàn)為顯著下調(diào)，下調(diào)了54.3%。MT-2基因在兩種TCS濃度組中的表達水平都出現(xiàn)了上調(diào)趨勢，且在0.034 mg/L濃度組表現(xiàn)為顯著上調(diào)，上調(diào)了84.1%。

春暖花開的日子里，我?guī)W(xué)生去觀賞校園，每看到一處有特色的景物，學(xué)生都會圍上去，看一看，摸一摸，聞一聞，然后七嘴八舌地議論不休，而我則適時地問一問，引導(dǎo)學(xué)生觀察。一圈逛下來，學(xué)生對校園里的景物有了大致的印象?；氐浇淌?，我讓學(xué)生選擇自己最喜歡的最有特色的景物作為寫作對象，他們的腦海里就有了選擇的依據(jù)。在明確寫作對象后，作文的題目也做了相應(yīng)的修改，不再是固定模式的《我的校園》《春天的校園》等，而是變成了《神奇的變色樹》《五針?biāo)伞贰睹利惖挠裉m花》等。

sMT-B和MT-2同屬于MT基因家族，MT-2是蛋白還原性的活性位點，能與機體氧自由基反應(yīng)，消除機體中游離的ROS，減輕細(xì)胞氧化損害，并廣泛參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)[18]，本研究中，MT-2基因在0.034 mg/L處理組mRNA顯著上調(diào)，MT-2蛋白表達可能會增高，可以直接消除TCS對斑馬魚產(chǎn)生氧自由基來有效保護斑馬魚的卵巢，這與在低溫脅迫下凡納濱對蝦肝胰腺MT-2基因表達上調(diào)[19]的結(jié)果相一致，進一步證實了該濃度下，TCS對斑馬魚卵巢產(chǎn)生了氧化應(yīng)激。sMT-B的活性與硒的高富積有著密切關(guān)系[20]，硒為GPx的重要組成成分，所以sMT-B也與生物體的抗氧化相關(guān)，在研究中，sMT-B在TCS處理組表達有下調(diào)趨勢，且與濃度呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，故硒元素富集程度在高濃度TCS時降低更為明顯，并且CAT、SOD和GPx在高濃度組顯著下調(diào)，這進一步表明斑馬魚在0.068 mg/L時抗氧化能力降低。

學(xué)校始終堅持以提高教學(xué)質(zhì)量為第一宗旨，以服務(wù)學(xué)生為第一要務(wù)。建校以來，學(xué)校高考升學(xué)人數(shù)逐年增加，升學(xué)率逐年提高。在學(xué)生藝體專業(yè)素質(zhì)的挖掘和培養(yǎng)方面，接連取得較好成績，學(xué)校在各級各類藝術(shù)競賽中不斷創(chuàng)造佳績的基礎(chǔ)上，每年向高校輸送了一定數(shù)量的藝體特長生。

綜上，TCS影響了斑馬魚卵巢的抗氧化相關(guān)基因的表達，低濃度表現(xiàn)為上調(diào)，高濃度表現(xiàn)為下調(diào)，表明低濃度產(chǎn)生了氧化應(yīng)激，高濃度產(chǎn)生了氧化損傷。

3.2 TCS對斑馬魚卵巢凋亡相關(guān)基因表達的影響

Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最主要的調(diào)控基因，下調(diào)Bcl-2或上調(diào)Bax則促進細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Bax比例與凋亡的作用機制密切相關(guān)[21]，比值越大，說明抗凋亡能力越強，比值降低可能會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[22]。污染物可以改變Bcl-2/Bax比值，從而介導(dǎo)細(xì)胞色素C，而引發(fā)細(xì)胞凋亡[23]。本研究顯示Bcl-2在0.068 mg/L TCS時顯著下調(diào)，Bax在0.68 mg/L TCS濃度組顯著上調(diào)，Bcl-2/Bax比值在0.068 mg/L TCS時顯著下調(diào)，表明TCS能夠促進卵巢組織的細(xì)胞發(fā)生凋亡。劉林等[11]研究的納米氧化鋅對斑馬魚鰓的Bcl-2的表達下調(diào)及Bcl-2/Bax比值下降，表明納米氧化鋅能夠促進斑馬魚鰓細(xì)胞的凋亡，魯疆等[24]的研究發(fā)現(xiàn)CdCl2使斑馬魚胚胎Bcl-2的表達及Bcl-2/Bax比值顯著下降。董瑞娜等[25]研究DEHP對小鼠精原細(xì)胞的影響發(fā)現(xiàn)DEHP能抑制Bcl-2表達及促進Bax表達，從而實現(xiàn)誘導(dǎo)精原細(xì)胞凋亡。上述研究結(jié)果和本研究結(jié)果一致，進一步證實環(huán)境污染物可以促進動物組織細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在0.068 mg/L濃度組時，TCS對斑馬魚卵巢也產(chǎn)生了氧化損傷，推測此時TCS對斑馬魚產(chǎn)生了生殖毒性，氧化損傷可能是促進卵巢細(xì)胞凋亡發(fā)生的主要機制之一。

p53是調(diào)節(jié)細(xì)胞通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，與細(xì)胞凋亡、血管生成等機制密切相關(guān)[26]，已知p53基因的表達量提高，可以促進細(xì)胞凋亡。p53可以激活MDM2的轉(zhuǎn)錄。本研究發(fā)現(xiàn)p53在0.034 mg/L TCS處理濃度極顯著上調(diào)，而MDM2無明顯差異，表明TCS能夠提高p53的相對表達量來促進細(xì)胞凋亡的發(fā)生。而TCS在此濃度下Bax的表達也顯著升高，推測這兩種基因在促進卵巢細(xì)胞凋亡過程中可能存在某種聯(lián)系。但此濃度下，Bcl-2/Bax比值并沒顯著降低，且TCS對斑馬魚產(chǎn)生了氧化應(yīng)激。由于細(xì)胞凋亡的發(fā)生涉及到的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)較為復(fù)雜，TCS在低濃度下對卵巢細(xì)胞凋亡影響的分子機制還有待進一步探討。