黃芪甲苷緩解對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝臟氧化應(yīng)激損傷

劉 暢, 張 樂， 朱耀輝， 孫克誠， 何亞蘭， 王守開， 丁艷梅，胡閃閃， 賀 焱， 李 磊

(安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

對(duì)乙酰氨基酚(Acetaminophen，APAP)在臨床上是一種常用的解熱鎮(zhèn)痛類非處方藥[1]，正常劑量范圍內(nèi)服用APAP具有良好的治療作用，但長期或過量服用APAP則會(huì)造成嚴(yán)重的藥物性肝損傷[2]。在我國，許多患者對(duì)其安全性的認(rèn)識(shí)存在著誤解，故在使用方面存在較大的隨意性，從而過量或者長時(shí)間服用含該成分的藥物，導(dǎo)致一系列的不良反應(yīng)。其中,最不容忽視的是造成急性藥物性肝損傷甚至肝功能衰竭，危及生命[3-4]。

近年來，隨著不斷深入的研究，氧化應(yīng)激與APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷的發(fā)生息息相關(guān)，但APAP造成急性肝損傷的作用機(jī)理目前尚未明確。AS-IV為中藥黃芪的主要活性成分之一，具有提高免疫力、抗自由基、抗炎、抗氧化、降低血糖與心血管保護(hù)等藥理作用[5-7]。隨著對(duì)AS-IV研究不斷深入，它的藥理活性和作用機(jī)制相繼被發(fā)現(xiàn)，尤其在治療肝損傷方面具有廣泛的藥理作用[8-10]，其保肝作用主要與抗氧化作用相關(guān)。但對(duì)于AS-IV是否能夠預(yù)防治療APAP所誘導(dǎo)的藥物性急性肝損傷，目前研究較少。本試驗(yàn)旨在通過建立APAP急性肝損傷小鼠模型，探討AS-IV對(duì)APAP誘導(dǎo)小鼠的急性肝損傷的保護(hù)作用以及其作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性清潔級(jí)ICR小鼠40只購于南京青龍山動(dòng)物繁殖場，合格證編號(hào)：No.201710241，體重20±2 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 AS-IV和APAP均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羧甲基纖維素鈉購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)試劑盒(批號(hào)：20170428)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)試劑盒(批號(hào)：20170420)，SOD測定試劑盒(批號(hào)：20170513)，GSH測定試劑盒(批號(hào)：20170510)與丙二醛(Malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(批號(hào)：20170520)均購于南京建成生物工程研究所；NF-κB p65抗體，Nrf2抗體均購于Abbkine公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理 將40只清潔級(jí)ICR健康小鼠隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組、APAP模型組(400 mg/kg)、AS-IV低劑量組(20 mg/kg)、AS-IV高劑量組(40 mg/kg)，每組10 只?？瞻讓?duì)照組和模型組灌胃0.2 mL的5%羧甲基纖維素鈉，而低劑量組和高劑量組分別灌胃20 mg/kg和40 mg/kg的AS-IV，每天1次，連續(xù)灌胃7 d后，除空白對(duì)照組外，余下三組按照400 mg/kg的劑量灌胃APAP，染毒4 h后摘眼球采血后頸椎脫臼處死小鼠，血液于室溫靜置1～2 h，待血液充分凝固后，4 000 r/min離心15 min分離血清。分離肝臟，于相同位置取大小合適的一塊肝組織置于4%多聚甲醛中固定，其余組織迅速置于-80 ℃儲(chǔ)存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 血清轉(zhuǎn)氨酶的測定 按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書測定小鼠血清ALT與AST的活力。

1.2.3 肝臟組織抗氧化指標(biāo)測定 準(zhǔn)確稱取30 mg肝臟取出解凍，加入9倍體積的生理鹽水，置于冰上研磨，制成10%肝臟勻漿液，2 500～3 000 r/min離心10 min，取上清，按照試劑盒說明書操作檢測小鼠肝臟GSH和MDA的含量與SOD的活力。

1.2.4 免疫組化檢測Nrf2、NF-κB p65的表達(dá) 分離小鼠肝臟經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)方法進(jìn)行組織包埋并制備組織切片，封閉后按照NF-κB p65(1∶200)，Nrf2(1∶200)孵育一抗過夜，PBS洗滌3次后，37 ℃孵育二抗1 h，然后DAB顯色，二甲苯透明，中性樹膠封片后，鏡檢觀察免疫組化染色結(jié)果。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 使用IBM SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AS-IV對(duì)APAP誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

圖1 AS-IV對(duì)APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷血清中ALT、AST的活力影響

如圖1所示，與空白對(duì)照組相比，APAP(400 mg/kg)誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠血清中ALT和AST顯著增高(P<0.01)，表明造模成功。與模型組相比，AS-IV(20 mg/kg)和AS-IV(40 mg/kg)極顯著的抑制了APAP誘導(dǎo)肝損傷所造成的ALT和AST升高的現(xiàn)象(P<0.01)，提示AS-IV對(duì)于APAP誘導(dǎo)的肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

2.2 AS-IV對(duì)APAP誘導(dǎo)肝損傷小鼠GSH、MDA的含量與SOD活力的影響

表1 AS-IV對(duì)肝臟組織GSH含量、SOD活力與MDA含量的影響

注：與空白對(duì)照組相比：**表示P<0.01,***表示P<0.001；與模型組相比：##表示P<0.01，###表示P<0.001。

如表1所示，模型組小鼠肝臟中GSH的含量與SOD的活力均低于空白對(duì)照組(P<0.01，P<0.001)，而MDA則高于空白對(duì)照組(P<0.001)，說明APAP可以造成肝臟的氧化應(yīng)激。而AS-IV(20 mg/kg)和AS-IV(40 mg/kg)的GSH、SOD均高于模型組(P<0.01，P<0.001)，MDA低于模型組(P<0.001)，且AS-IV(40 mg/kg)組數(shù)據(jù)顯示尤為明顯。從而不難看出，在APAP誘導(dǎo)急性肝損傷的過程中，AS-IV對(duì)于GSH，SOD的降低和MDA的升高有著明顯的抑制作用，通過抗氧化對(duì)肝臟起到一定的保護(hù)作用。

2.3 AS-IV對(duì)Nrf2、NF-κB p65表達(dá)的影響

如圖2所示，APAP模型組與空白對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)APAP模型組中Nrf2的表達(dá)明顯受到了抑制(圖2B)，而在給予AS-IV后，肝靜脈周圍組織中Nrf2的表達(dá)情況逐漸升高(圖2C)，并且隨著AS-IV濃度的增加，升高趨勢(shì)越明顯。這表明在APAP誘導(dǎo)的急性藥物肝損傷中，AS-IV能夠激活Nrf2通路，使其表達(dá)情況顯著升高，進(jìn)而通過抗氧化的作用改善藥物性肝損傷。

NF-κB是一個(gè)由p50、p65兩種亞基組成的一個(gè)蛋白二聚體，存在于多種細(xì)胞且是多條信號(hào)通路的匯集點(diǎn)，有著至關(guān)重要的作用。據(jù)研究表明，NF-κB p65的高表達(dá)與急性肝損傷有著密切的聯(lián)系[11]。而在圖3中，與空白組(圖3A)相比，APAP模型組(圖3B)NF-κB p65的表達(dá)情況顯著增高，在給予AS-IV后，AS-IV低劑量組(圖3C)的NF-κB p65表達(dá)情況未發(fā)生明細(xì)的變化，但AS-IV高劑量組(圖3D)的NF-κB p65表達(dá)情況受到了顯著抑制。結(jié)果表明了AS-IV對(duì)于APAP誘導(dǎo)的NF-κB p65高表達(dá)有一定的抑制作用。

圖2 AS-IV對(duì)肝臟組織Nrf2表達(dá)的影響

圖3 AS-IV對(duì)肝臟組織NF-κB p65表達(dá)的影響

3 結(jié)論與討論

大量的研究表明Nrf2轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的信號(hào)通路在機(jī)體的抗氧化損傷方面起到重要的作用[21]。作為最重要的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2在防止APAP誘導(dǎo)的肝毒性中發(fā)揮關(guān)鍵作用[22]，一般情況下，Nrf2主要與Keap1結(jié)合為無活性的復(fù)合物存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)受到外界的刺激后Nrf2-Keap1復(fù)合物解偶聯(lián)，Nrf2與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，調(diào)控下游抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷[23]。我們的結(jié)果顯示AS-IV預(yù)處理增強(qiáng)了Nrf2的表達(dá)(圖2)。大量研究表明，氧化應(yīng)激是可激活NF-κB促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)[24]，而具有代表性的亞基p65(NF-κB p65)在炎癥反應(yīng)調(diào)控中具有關(guān)鍵作用，高表達(dá)的NF-κB p65與急性肝損傷有著密切的聯(lián)系，在被ROS觸發(fā)后，NF-κB p65從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，從而激活參與炎癥過程的促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[25]，研究結(jié)果表示當(dāng)Nrf2激活并與抗氧化劑相關(guān)元素結(jié)合時(shí)NF-κB p65表達(dá)量降低(圖3)，說明Nrf2通路可以作為APAP誘導(dǎo)肝損傷的有效途徑。說明黃芪甲苷在抗氧化方面具有很強(qiáng)的作用，為該藥物臨床上用于緩解APAP誘導(dǎo)的肝損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。