磷脂酶D的純化及催化制備磷脂酰絲氨酸研究

夏 禹，張 濤，江 波

(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

磷脂酰絲氨酸作為一種新資源食品，具有改善阿爾茨海默病、治療抑郁癥和緩解精神壓力等作用[1-9]，市場前景十分廣闊。隨著人們生活節(jié)奏的加快，生活壓力加大，再加上我國逐漸步入老齡化社會，未來人們對磷脂酰絲氨酸的需求也會越來越大，實(shí)現(xiàn)其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)也變得更加重要。

目前市售的磷脂酰絲氨酸產(chǎn)品大多是從豆類或動物肝臟組織中提取的，成本較高，安全性也存在問題[10-11]。利用磷脂酶D酶法制備磷脂酰絲氨酸具有條件溫和、產(chǎn)品得率高和生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)[12]，具有重要的研究和生產(chǎn)價(jià)值。酶法合成磷脂酰絲氨酸主要取決于起催化作用的磷脂酶D，但目前市售的磷脂酶D主要是從植物中提取，種類少、轉(zhuǎn)酯活力低、價(jià)格高，限制了磷脂酶D的應(yīng)用。

本文通過對廣島鏈霉菌所產(chǎn)磷脂酶D進(jìn)行純化，并將其用于制備磷脂酰絲氨酸，以期為磷脂酶D和磷酯酰絲氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與試劑

廣島鏈霉菌SK43.001-11，由本實(shí)驗(yàn)室誘變篩選獲得；L-絲氨酸、蛋黃卵磷脂、乙醚、乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷、二氯甲烷、環(huán)己烷等，購自國藥化學(xué)試劑有限公司；磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰絲氨酸(PS)標(biāo)準(zhǔn)品，購自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；甲醇、異丙醇、正己烷、三乙胺均為色譜純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

HYL-B型恒溫?fù)u床，AKTA avant 25、AKTA purifier 10蛋白純化系統(tǒng)，Waters1525型高效液相色譜儀，ELSD3300蒸發(fā)光散射檢測器。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖15 g/L，麥芽糖10 g/L，酵母提取物2 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0～7.4，115℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母提取物20 g/L，蛋白胨5 g/L，K2HPO4·3H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.0～7.4，115℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，牛肉浸膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，K2HPO4·3H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.0～7.4，115℃滅菌30 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶液制備

(1)斜面制備：將廣島鏈霉菌SK43.001-11接種于試管斜面，28℃培養(yǎng)7 d。

(2)種子液制備：從斜面上用接種環(huán)挑取1環(huán)單菌落接入種子培養(yǎng)基中，裝液量50 mL/250 mL，在28℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)1.5 d。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)：按4%的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量50 mL/250 mL，在28℃、200 r/min的搖床中發(fā)酵培養(yǎng)7 d。

(4)粗酶液制備：將發(fā)酵液于4℃、6 000 r/min離心20 min，棄去沉淀，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液即為粗酶液。

1.2.2 粗酶液的純化

向粗酶液中加入硫酸銨至體系飽和度為40%，4℃靜置2 h后，離心除去沉淀，再向上清中加入硫酸銨至體系飽和度達(dá)到60%，4℃靜置2 h后，離心收集沉淀，復(fù)溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(50 mmol/L，pH 5.0)中，4℃透析脫鹽。將透析液上樣于Hitrap SP HP陽離子交換柱，用含1 mol/L NaCl的同種緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，測定各洗脫峰的酶活，收集有磷脂酶D活力的洗脫峰，用超濾離心管濃縮。再將濃縮液上樣于Superdex 200 10/300 GL凝膠層析柱，用含0.5 mol/L NaCl的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(50 mmol/L，pH 5.0)洗脫，測定各洗脫峰的酶活，收集有磷脂酶D活力的洗脫峰。

1.2.3 酶活測定

取0.5 g蛋黃卵磷脂溶于1 mL乙醚中，加入10 mL去離子水振蕩形成乳液。依次向離心管中加入100 μL乳液、100 μL檸檬酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 6.0)、150 μL 7.5%曲拉通X-100、50 μL 0.1 mol/L CaCl2和100 μL酶液，充分混勻后，37℃水浴10 min。加入200 μL含有50 mol/L EDTA的Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L，pH 8.0)，沸水浴5 min終止反應(yīng)[13-14]。室溫冷卻后，加入2 mL由Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L，pH 8.0)配制的顯色劑(含2 mg/mL 4-氨基安替比林、0.5 mg/mL苯酚和10 mg/mL曲拉通X-100)，再加入20 μL 100 U/mL膽堿氧化酶和10 μL 200 U/mL過氧化酶，混勻后置于37℃水浴中反應(yīng)20 min，于500 nm處測定吸光度?？瞻捉M采用去離子水代替酶液，同樣操作下測定。酶活定義：將37℃、1 min內(nèi)生成1 μmol膽堿所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.4 蛋白含量的測定

按Lorry法對酶液的蛋白含量進(jìn)行檢測。

1.2.5 PS的初始制備反應(yīng)體系

20 mg磷脂酰膽堿溶于10 mL乙醚中，0.35 gL-絲氨酸溶于4 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液中(20 mmol/L，pH 5.5)，加入1 mL酶液(4 U)，混合后置于具塞錐形瓶中，28℃恒溫振蕩反應(yīng)2 h后停止反應(yīng)。

1.2.6 磷脂酰膽堿和PS的檢測

取0.5 mL 1.2.5反應(yīng)結(jié)束后有機(jī)相，通風(fēng)櫥室溫?fù)]發(fā)，用同等體積甲醇-三氯甲烷(體積比2∶1)復(fù)溶后，經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾，用高效液相-蒸發(fā)光散射檢測器檢測磷脂酰膽堿和PS的含量。

色譜分析條件：Sepax HP-Silica色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，流動相A為甲醇-水-醋酸-三乙胺(體積比85∶15∶0.5∶0.05)，流動相B為異丙醇-流動相A-正己烷(體積比20∶32∶48)。色譜柱溫40℃，流速1.0 mL/min，檢測器漂移管溫度70℃，氣體流速1.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，洗脫程序如表1所示。

表1 HPLC-ELSD梯度洗脫程序

1.2.7 PS生成率的計(jì)算

PS生成率=PS產(chǎn)量/磷脂酰膽堿初始添加量×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 磷脂酶D的純化

磷脂酶D的分步純化結(jié)果如表2所示。

由表2可知：粗酶液經(jīng)硫酸銨分級沉淀初步純化后，比酶活提高到2.58 U/mg，被純化了2.84倍；Hitrap SP HP陽離子交換層析除去了溶液中的大量雜蛋白，比酶活達(dá)到40.67 U/mg，將磷脂酶D純化了44.69倍；最后經(jīng)Superdex 200 10/300 GL凝膠層析純化后，得到了純化倍數(shù)為54.37、回收率為32.31%、比酶活為49.48 U/mg的電泳純的磷脂酶D。

表2 廣島鏈霉菌產(chǎn)磷脂酶D的純化結(jié)果

2.2 PS的酶法合成工藝

2.2.1 有機(jī)溶劑的影響

由于磷脂酶D是親水性的，而其作用的磷脂底物卻是親油性的，因此這類反應(yīng)大多在由水相和有機(jī)相組成的雙液相體系中進(jìn)行。在這樣的反應(yīng)體系中，有機(jī)溶劑不可避免會對磷脂酶D的催化反應(yīng)有所影響。有機(jī)溶劑對酶的催化反應(yīng)的影響體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①由于極性的差異，有機(jī)溶劑會影響兩相中底物和產(chǎn)物的分配和擴(kuò)散，使反應(yīng)的平衡常數(shù)和速率常數(shù)發(fā)生變化；②有機(jī)溶劑直接與酶必需的水化層發(fā)生作用，間接影響酶的活力；③有機(jī)溶劑直接作用于酶分子，改變維持蛋白質(zhì)構(gòu)型的氫鍵和疏水作用等，導(dǎo)致酶活性的降低甚至失活[15]。

為了找出有利于轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的有機(jī)相，僅改變有機(jī)溶劑的種類，其他條件見1.2.5，考察有機(jī)溶劑對PS生成率的影響，結(jié)果如圖1所示，各有機(jī)溶劑的極性如表3所示。

圖1 不同有機(jī)溶劑對PS生成率的影響

表3 不同有機(jī)溶劑的極性

由圖1可看出，有機(jī)相為石油醚時(shí)，基本無PS生成，正己烷和環(huán)己烷為有機(jī)相時(shí)，PS生成率在6%左右，二氯甲烷、三氯甲烷和乙酸乙酯為有機(jī)相時(shí)，PS生成率在30%左右，乙醚為有機(jī)相時(shí)，PS生成率最高，達(dá)57.2%。結(jié)合表3可以看出，PS的生成率隨著有機(jī)相溶劑的極性增大呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，因此選擇乙醚作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的有機(jī)相，這與張憶雪[16]的選擇一致。

2.2.2 pH的影響

酶的催化反應(yīng)需要一定的pH條件，否則導(dǎo)致反應(yīng)不發(fā)生或有副反應(yīng)發(fā)生，不利于目的反應(yīng)進(jìn)行。每種酶都有其最適pH，偏離最適pH時(shí)，酶分子的極性基團(tuán)發(fā)生不同程度的解離，酶活性降低。當(dāng)pH偏離較大時(shí)，酶的三級結(jié)構(gòu)也會發(fā)生變化，引起酶的變性。為探究pH對PS生成率的影響，調(diào)節(jié)緩沖液pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，其他條件見1.2.5，結(jié)果如圖2所示。

圖2 pH對PS生成率的影響

從圖2可以看出，隨著pH的增大，PS生成率先升高后降低，反應(yīng)適宜在偏酸性條件下進(jìn)行。pH低于5.5時(shí)，PS生成率隨pH變化明顯，pH高于7.5時(shí)，PS生成率隨pH升高而出現(xiàn)下降趨勢，在pH 5.5～7.5范圍內(nèi)，pH對PS生成率的影響不大，PS生成率在55%左右，pH 6.5時(shí)PS生成率最高，達(dá)58.1%。因此，選擇pH 6.5進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)優(yōu)化。

2.2.3 反應(yīng)溫度的影響

反應(yīng)溫度對酶催化反應(yīng)的影響比較復(fù)雜，反應(yīng)溫度既可以影響酶的催化反應(yīng)速率，也對酶蛋白的穩(wěn)定性有所影響。隨著反應(yīng)溫度的升高，反應(yīng)物的能量被提高，底物與酶的碰撞加劇，反應(yīng)速度加快。當(dāng)反應(yīng)溫度高于酶催化反應(yīng)最適溫度后，部分酶蛋白會發(fā)生變性，降低了酶催化反應(yīng)效率。不僅如此，隨著反應(yīng)溫度的升高，酶的活性中心結(jié)構(gòu)會發(fā)生一定變化，影響底物和酶的結(jié)合，從而影響酶催化反應(yīng)速度及選擇性。

由于選用乙醚作為有機(jī)相，考慮到乙醚的沸點(diǎn)(35℃)較低，實(shí)驗(yàn)選擇了5個(gè)不同的反應(yīng)溫度進(jìn)行PS生成率考察。調(diào)節(jié)緩沖液pH為6.5，其他條件見1.2.5，結(jié)果如圖3所示。

圖3 反應(yīng)溫度對PS生成率的影響

從圖3可以看出，隨著反應(yīng)溫度的升高，PS生成率增大，當(dāng)反應(yīng)溫度為30℃時(shí)，PS生成率最高，當(dāng)反應(yīng)溫度繼續(xù)升高后，PS生成率則出現(xiàn)下降趨勢。由此可以判定，30℃為此體系催化合成PS的最適反應(yīng)溫度。

2.2.4 底物質(zhì)量比的影響

有機(jī)相選用乙醚，緩沖液pH為6.5，反應(yīng)溫度為30℃，固定有機(jī)相中磷脂酰膽堿的濃度，改變水相中L-絲氨酸用量，其他條件見1.2.5，底物質(zhì)量比對PS生成率的影響如圖4所示。

圖4 底物質(zhì)量比對PS生成率的影響

從圖4可以看出，當(dāng)L-絲氨酸與磷脂酰膽堿質(zhì)量比較低時(shí)，PS生成率較低，隨著質(zhì)量比的增大，PS生成率增大，這是由于L-絲氨酸作為反應(yīng)的底物之一，其用量增大，可促進(jìn)PS的生成。繼續(xù)提高底物質(zhì)量比，PS生成率變化不大。考慮原料成本，控制反應(yīng)體系中L-絲氨酸與磷脂酰膽堿質(zhì)量比為15∶1。

2.2.5 有機(jī)相與水相體積比的影響

有機(jī)相選用乙醚，緩沖液pH為6.5，反應(yīng)溫度為30℃，L-絲氨酸添加量為0.3 g，僅改變有機(jī)相的體積，其他條件見1.2.5，有機(jī)相與水相體積比對PS生成率的影響如圖5所示。

圖5 有機(jī)相與水相體積比對PS生成率的影響

從圖5可以看出，當(dāng)有機(jī)相與水相體積比小于1∶1時(shí)，PS生成率隨兩相體積比的增大而增大，這是因?yàn)殡S著兩相體積比的增大，兩相界面面積增大，水相中的酶與有機(jī)相中底物的接觸概率增大，從而提高了PS生成率。兩相體積比繼續(xù)增大時(shí)，雖然底物和磷脂酶D的接觸概率提高，但酶更容易與有機(jī)溶劑接觸，酶的活性降低，因此PS生成率逐漸下降。所以調(diào)整反應(yīng)體系中有機(jī)相與水相體積比為1∶1。

2.2.6 PS的合成反應(yīng)進(jìn)程

對雙液相體系酶法制備PS工藝進(jìn)行優(yōu)化后，得到最優(yōu)反應(yīng)條件：有機(jī)相為乙醚，pH 6.5，反應(yīng)溫度30℃，L-絲氨酸與磷脂酰膽堿質(zhì)量比15∶1，有機(jī)相與水相體積比1∶1。在最優(yōu)條件下進(jìn)行PS合成，定時(shí)取樣檢測各磷脂組分含量，結(jié)果如圖6所示。

圖6 磷脂酰絲氨酸合成反應(yīng)進(jìn)程

由圖6可以看出：底物在2.5 h后幾乎被完全消耗；在合成PS的過程中，有副產(chǎn)物磷脂酸(PA)產(chǎn)生，這表明轉(zhuǎn)酯反應(yīng)過程中有水解反應(yīng)發(fā)生；產(chǎn)物PS含量在反應(yīng)2.5 h后變化不大，即最佳反應(yīng)時(shí)間為2.5 h，此時(shí)PS生成率為74.8%。本實(shí)驗(yàn)廣島鏈霉菌所產(chǎn)磷脂酶D的PS生成率略低于嚴(yán)明等[17]的固定化磷脂酶D 78.6%的生成率，但與張憶雪[16]、Hosokawa[18]等相比，PS生成率提高了約40%，高于已報(bào)道的大多數(shù)磷脂酶D[19-21]，說明可以應(yīng)用于PS的酶法合成。

3 結(jié) 論

胞外粗酶液通過硫酸銨沉淀、Hitrap SP HP陽離子交換層析和Superdex 200 10/300 GL凝膠層析純化后，磷脂酶D比酶活由0.91 U/mg提高到49.48 U/mg，是粗酶液的54.37倍，回收率為32.31%。雙液相體系酶法制備磷脂酰絲氨酸工藝研究表明，在以乙醚為有機(jī)相、pH 6.5、反應(yīng)溫度30℃、L-絲氨酸與磷脂酰膽堿質(zhì)量比15∶1、有機(jī)相與水相體積比1∶1條件下反應(yīng)2.5 h，底物基本被消耗完，此時(shí)磷脂酰絲氨酸生成率達(dá)到74.8%。