細(xì)菌III型分泌系統(tǒng)及其效應(yīng)蛋白致病性研究進(jìn)展

陸彭磊，蔡少平

近年來，人們發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌為了適應(yīng)宿主體內(nèi)的生存環(huán)境，更好地在宿主體內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，通常需要分泌一些毒力因子或毒力相關(guān)性蛋白以創(chuàng)造適宜自身生存的環(huán)境。細(xì)菌因此進(jìn)化出許多不同的分泌系統(tǒng)以分泌毒力因子或毒力相關(guān)性蛋白[1]。細(xì)菌III型分泌系統(tǒng)(Type III secretion system，T3SS)是其中之一。在分泌系統(tǒng)中，與病原體存活及毒力相關(guān)的蛋白質(zhì)稱為效應(yīng)蛋白(effector protein)。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡(Pryoptosis)是宿主細(xì)胞清除致病菌、維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的兩種主要途徑，也是部分革蘭陰性菌的 T3SS 效應(yīng)蛋白操縱宿主細(xì)胞死亡的兩個(gè)主要方面[2]，但是不同的效應(yīng)蛋白在該過程中發(fā)揮的功能不同。隨著研究的不斷拓展和深入，現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)T3SS在致病過程不僅具有復(fù)雜的分子裝置，也是蛋白質(zhì)的一種運(yùn)輸工具，同時(shí)還能反向抑制信號(hào)通路，從而調(diào)控信號(hào)的傳遞強(qiáng)度。本文就針對(duì)T3SS效應(yīng)蛋白分泌機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 細(xì)菌分泌系統(tǒng)概述

革蘭陰性菌有許多分泌蛋白和外露蛋白，但在發(fā)育和進(jìn)化過程中是通過相對(duì)較少的分泌機(jī)制分泌蛋白的。目前認(rèn)為的革蘭陰性菌分泌系統(tǒng)有9個(gè)，I～I(xiàn)X型[3]。其中T3SS是一個(gè)多組分蛋白形成的復(fù)合體跨膜通道。目前對(duì)副溶血弧菌[4]、銅綠假單胞菌[5]等革蘭陰性菌的T3SS效應(yīng)蛋白致病機(jī)理和鑒定方法的研究比較廣泛。遺傳和分子學(xué)分析表明T3SS組裝和分泌的效應(yīng)物在蛋白質(zhì)分泌的過程中起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)的作用。同時(shí)作為必需的毒力因子，T3SS是疫苗和治療的有效靶標(biāo)[6]。T3SS其結(jié)構(gòu)部件由20多種不同的蛋白質(zhì)組成，形成基部、細(xì)胞外針、尖端復(fù)合體和一個(gè)易位蛋白[7-8]。Nans A通過用低溫電子斷層掃描和亞層斷層掃描獲得沙眼衣原體T3SS的超微完整結(jié)構(gòu)，證實(shí)T3SS通過形成類似于泵樣的構(gòu)象變化來與宿主產(chǎn)生聯(lián)系[9]。由此可見，部分革蘭陰性菌在與宿主接觸中存在一種跨膜通道用于傳輸效應(yīng)物，該跨膜通道的作用和傳輸方式需進(jìn)一步通過其與細(xì)菌致病的機(jī)制結(jié)合研究。

2 T3SS分泌系統(tǒng)在細(xì)菌致病過程中作用

細(xì)菌III型分泌系統(tǒng)是許多革蘭陰性致病菌中存在的復(fù)雜的分子裝置，T3SS通過分泌蛋白將毒力蛋白直接注入宿主細(xì)胞以達(dá)到致病目的。首先從結(jié)構(gòu)上，T3SS的核心結(jié)構(gòu)包括固定在細(xì)菌膜表面的基本結(jié)構(gòu)，這一基本結(jié)構(gòu)由3種蛋白質(zhì)齊聚成環(huán)組成。其中蛋白質(zhì)SctD和SctJ形成環(huán)狀組成空心內(nèi)壁(Inner membrane，IM)，蛋白質(zhì)SctC形成獨(dú)立外部環(huán)狀外壁(Outer membrane，OM)。IM和OM組合形成整個(gè)T3SS結(jié)構(gòu)，其中SctD、SctJ和SctC的結(jié)構(gòu)的完整性對(duì)于T3SS的活性起到至關(guān)重要的作用[10]。同時(shí)，Halder, PK研究中將PscN定義為T3SS的ATP酶，將PscL定義為其未表征的調(diào)節(jié)因子，并指出PscL和PSCN在1∶2的比例下ATP酶活性即可達(dá)到80%。因此PscL不僅是PSCN的調(diào)節(jié)器，并且可以形成三維模型相互作用[11]。所以，T3SS的結(jié)構(gòu)模型完整性在致病過程中起關(guān)鍵作用，同時(shí)其中的調(diào)節(jié)因子也可以調(diào)節(jié)致病菌注入宿主細(xì)胞的程度。可見，T3SS結(jié)構(gòu)完整性使得T3SS可以通過激活酶類活性或特異性抑制酶類活性來達(dá)到調(diào)控毒力蛋白注入宿主細(xì)胞的目的。

與此同時(shí)，T3SS作為一種運(yùn)輸工具，通常是通過其跨膜通道的特性，來完成其致病的目的。Cameron EA研究顯示，腸道中擬桿菌屬T3SS會(huì)自身水解從而反向抑制疾病進(jìn)程，同時(shí)通過與腸出血性大腸埃希菌形成一種共生病原體的關(guān)系，提供給腸出血性大腸埃希菌適合定植的微環(huán)境，幫助腸出血性大腸埃希菌自身內(nèi)源性蛋白酶在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中形成T3SS孔，促進(jìn)T3SS將毒力因子易位到宿主細(xì)胞內(nèi)，從而引起腸道疾病[12]。Kim SI研究顯示沙門菌致病因子編碼的細(xì)菌III型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白，通過外膜囊泡(Outer membrane vesicles，OMV一種革蘭陰性菌釋放的球形膜狀結(jié)構(gòu))分泌。鼠傷寒沙門菌可以利用OMV作為運(yùn)輸工具將這種效應(yīng)蛋白遞送到宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，而不依賴于細(xì)菌與宿主細(xì)胞的相互作用[13]。

另外，T3SS上基因簇編碼和對(duì)非致病因子編碼的調(diào)控也反映出與細(xì)菌毒性上的相關(guān)作用。張秀彩研究顯示當(dāng)菌株轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子表達(dá)水平較高時(shí)，效應(yīng)蛋白編碼基因表達(dá)水平相對(duì)偏低，存在負(fù)相關(guān)性[14]。Kassa EG通過流式細(xì)胞儀的檢測(cè)和成像技術(shù)跟蹤感染細(xì)胞效應(yīng)物的動(dòng)力學(xué)和膜運(yùn)輸。發(fā)現(xiàn)腸致病性大腸埃希菌效應(yīng)物控制上皮宿主細(xì)胞的內(nèi)吞和轉(zhuǎn)胞吞。影響了機(jī)體內(nèi)循環(huán)機(jī)制，使宿主質(zhì)膜蛋白發(fā)生錯(cuò)誤定位和富集，這些現(xiàn)象被證實(shí)與細(xì)菌定植和毒性存在一定的聯(lián)系[15]。

同時(shí)，T3SS可以通過去磷酸化或去乙?；瘉泶龠M(jìn)病原菌的生長(zhǎng)。Desveaux研究發(fā)現(xiàn)T3SS通過將丁香假單胞菌乙酰轉(zhuǎn)移酶遞送到宿主細(xì)胞中以促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)。丁香假單胞菌乙酰轉(zhuǎn)移酶的生物學(xué)活性能導(dǎo)致宿主細(xì)胞觸發(fā)其免疫應(yīng)答。研究結(jié)果表明丁香假單胞菌乙酰轉(zhuǎn)移酶可以乙?；荏w細(xì)胞質(zhì)激酶，并通過激酶結(jié)構(gòu)構(gòu)象改變來促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)[16]。Dortet L研究顯示病原菌在感染早期就已經(jīng)出現(xiàn)了誘導(dǎo)T3SS去磷酸化和去乙酰化。細(xì)菌病原體可以通過影響表位遺傳因子來重新編碼靶細(xì)胞。由易位蛋白操縱組蛋白，形成孔狀毒素分泌到細(xì)胞外環(huán)境中，繼而引發(fā)病原菌破壞宿主細(xì)胞[17]。其次，T3SS中結(jié)構(gòu)部件易位蛋白在轉(zhuǎn)運(yùn)中也起到了關(guān)鍵作用。George Z研究發(fā)現(xiàn)沙眼衣原體可以利用T3SS中的易位蛋白(肌動(dòng)蛋白招募磷蛋白 the Translocated Actin-Recruiting Phosphoprotein，TRAP)刺激宿主細(xì)胞的細(xì)胞骨架重組以達(dá)到入侵和進(jìn)行性發(fā)展的目的。同時(shí)肌球蛋白輕鏈激酶、TARP低聚和肌球蛋白ATP酶的特異性抑制能顯著降低未折疊蛋白應(yīng)答反應(yīng)的激活和衣原體的復(fù)制[18]。Romano Fabian B研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌中的易位蛋白PopB和PopD。PopD在膜中形成六聚體結(jié)構(gòu)，通過與PopB的相互作用，形成一種獨(dú)特的由8個(gè)PopB和8個(gè)PopD分子組成的異源寡聚體組裝結(jié)構(gòu)蛋白模型[19]。Armentrout E I也從遺傳的角度識(shí)別到蛋白與蛋白之間接觸由易位蛋白形成跨膜通道來完成，其中PopD是必須存在的并且積極參與到易位孔構(gòu)象改變的易位蛋白[20]。

3 T3SS分泌系統(tǒng)反向抑制作用

細(xì)菌分泌系統(tǒng)不僅可以通過調(diào)控其通道的輸送功能完成其毒力作用，研究發(fā)現(xiàn)缺失部分毒力相關(guān)致病因子也會(huì)影響感染發(fā)病。趙凱英研究顯示T3SS有助于致病菌在組織中大量增殖，其中如果遲緩愛德華菌缺失eseC基因，可影響效應(yīng)蛋白分泌到宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)，影響了遲緩愛德華菌的致炎作用[21]。另有研究發(fā)現(xiàn)在T3SS中，沙門菌致病因子可以阻止主要組織相容性II類復(fù)合物通過沙門菌感染抗原提呈給宿主細(xì)胞[22]。原因之一是缺失編碼分子伴侶對(duì)致病產(chǎn)生了直接影響，另外磷脂酰膽堿缺失也影響膜蛋白在細(xì)胞膜內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和組裝，最終導(dǎo)致組裝后的T3SS裝置不能正常發(fā)揮T3SS的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能[23]。

其次，在T3SS跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中將轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的組裝進(jìn)行一定的構(gòu)象改變，也會(huì)對(duì)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過程形成一定的影響。Tang Y研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在膜中組裝成二聚體，形成特殊構(gòu)象后，可將編碼N`末端區(qū)域暴露于宿主細(xì)胞中，利于功能性蛋白與宿主接觸[24]。Belyy A研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌分離株含有ExoY變體，其突變改變了該效應(yīng)子的C`末端。這些天然存在的ExoY變體表現(xiàn)出顯著降低的酶活性和毒性的作用[25]。因此可以看出T3SS缺失部分關(guān)鍵性編碼分子、關(guān)鍵酶類或形成構(gòu)象改變可以影響其毒力的輸送功能。

4 T3SS分泌系統(tǒng)的競(jìng)爭(zhēng)和協(xié)同作用

外膜蛋白在T3SS系統(tǒng)中也起到了一些間接作用。Chowdhury R研究顯示外膜蛋白協(xié)同T3SS使小鼠傷寒菌致病，外膜蛋白可以粘附在T3SS的粘連蛋白層來達(dá)到間接入侵宿主的目的[26]。同時(shí)細(xì)胞中的外膜蛋白通過其自身的20個(gè)氨基酸與酪氨酸激酶相互作用，抑制酪氨酸激酶活性以限制體內(nèi)傷寒沙門菌的腸道入侵和全身感染[27]?？梢娡饽さ鞍卓梢酝ㄟ^T3SS對(duì)細(xì)菌的致病起到間接的影響。

5 T3SS分泌系統(tǒng)的人為干預(yù)和相關(guān)藥物應(yīng)用

現(xiàn)階段的研究顯示靶向抑制劑可以通過關(guān)閉3型分泌蛋白分泌的高度抗原性蛋白質(zhì)來清除和關(guān)閉志賀氏菌的免疫記憶的呈現(xiàn)，這項(xiàng)研究也給用非菌藥物療法對(duì)抗T3SS的ATP酶提供了可能性[28]。也有研究顯示5種植物的乙醇提取物(三葉雞矢藤、布奇漢姆屬、楊梅竹柏藤、欖仁黃花菜、百里香屬和甜樟屬)對(duì)T3SS中的蛋白質(zhì)有抑制鼠傷寒沙門菌活性的作用，同時(shí)顯示夏枯草對(duì)金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的抗菌活性可能也與T3SS系統(tǒng)有關(guān)[29]?？梢娝幬飳?duì)T3SS也有關(guān)閉T3SS蛋白分泌通道和消除免疫記憶的呈現(xiàn)來抑制細(xì)菌活性的作用。

6 總結(jié)與展望

綜上，T3SS與細(xì)菌運(yùn)輸毒力因子或毒力相關(guān)性蛋白息息相關(guān)。T3SS通過形成復(fù)雜的分子裝置作為運(yùn)輸工具。同時(shí)通過去磷酸化或去乙?；龠M(jìn)病原菌的生長(zhǎng)，通過分子裝置結(jié)構(gòu)構(gòu)象改變影響細(xì)菌的毒力作用。T3SS組裝件之一易位蛋白也對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)起到了關(guān)鍵作用，同時(shí)基因表達(dá)的缺失也能一定程度影響T3SS的轉(zhuǎn)運(yùn)。其次，藥物應(yīng)用上有部分藥物甚至像夏枯草等中藥在抗菌活性上也可能與T3SS有關(guān)。在實(shí)際應(yīng)用中，有文獻(xiàn)顯示腸出血性大腸埃希菌和腸致病性大腸埃希菌T3SS分泌的EspY3(一種新的非致病因子編碼的腸出血性大腸埃希菌T3SS效應(yīng)物)與沙門菌的效應(yīng)蛋白具有同源性[30]。還可以使用基因組的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具來分類檢索革蘭陰性菌中T3SS的基因，以增大細(xì)菌致病基因的檢出率[31-32]。對(duì)T3SS分泌系統(tǒng)的藥物干預(yù)為臨床通過非抗菌藥物療法或研究新型抗菌藥物提供了理論依據(jù)，同時(shí)用基因組學(xué)的檢索工具來分類T3SS基因組的生物學(xué)信息也進(jìn)一步加大了細(xì)菌致病基因的檢出效率。

T3SS在細(xì)菌胞質(zhì)分泌過程中起到了起承轉(zhuǎn)合的作用，對(duì)于了解細(xì)菌毒性和預(yù)測(cè)臨床預(yù)后具有重要的意義。T3SS作為分泌蛋白，具有分泌蛋白性質(zhì)毒力因子的能力，是革蘭陰性菌相對(duì)較少的幾種分泌機(jī)制之一，也是革蘭陰性菌為了適應(yīng)其在宿主細(xì)胞內(nèi)生存環(huán)境，而向外分泌的具有重要功能的蛋白。細(xì)菌分泌系統(tǒng)在近年來細(xì)菌致病機(jī)制研究中進(jìn)展迅速，并且成為新的耐藥性研究熱點(diǎn)。希望本文能為制定和研究T3SS在宿主細(xì)胞中的作用機(jī)制提供參考依據(jù)。

利益沖突：無