基于組學檢測的結核病發(fā)病風險研究進展

周崇興, 林定文

結核病(tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tb)引起的感染性疾病，嚴重危害人類健康[1]。全球估計有17億人感染了結核分枝桿菌，因此面臨罹患該病的危險[2]。在感染結核分枝桿菌之后，5%的感染者可發(fā)展為原發(fā)性結核病，若同時伴有人類免疫缺陷病毒(HIV)感染，這種概率可高達10%，而近90%的感染者可無癥狀長期攜帶結核分枝桿菌成為潛伏結核感染者(Latent Tuberculosis Infection，LTBI)[3]。中國是全球結核病潛伏感染負擔最重的國家之一[4]，結核病防制形勢嚴峻[5]。近年，基于統(tǒng)計模型的預測，中國估計有3.6億人感染結核分枝桿菌[6]。高磊等[7]在中國開展的目前全球最大規(guī)模的結核分枝桿菌感染的流行病學調查和隊列研究表明，IGRA陽性率為19%(不同地區(qū)為7%～25%)。相對于結核潛伏感染者，現(xiàn)癥的結核病人只是冰山一角。在短期內疫苗研發(fā)難以實現(xiàn)突破的前提下，消除結核病，除了目前的提高患者發(fā)現(xiàn)，控制傳染源外，積極開展結核潛伏感染高危人群的預防性治療是實現(xiàn)發(fā)病率快速下降的有效途徑。研究證實，成功的預防性化療可以有效的減少結核潛伏感染人群發(fā)病，保護效果可以達到60%～90%[8]，是直接降低發(fā)病率的重要手段。如不對LTBI進行治療，2年內發(fā)展到活動性結核病(Active Tuberculosis, ATB)的機會為5%，還有5%～10%可在感染2年后任何時間發(fā)病[9]。而抗結核藥物有較大副作用，對潛伏感染者實施全程藥物干預的治療依從性一直處于較低水平[10-12]，對所有LTBI患者進行治療干預還不太現(xiàn)實。因此，從眾多結核潛伏感染者中快速準確的篩查出可能發(fā)病的檢測標志物，對結核病防治工作具有重要現(xiàn)實意義。本文從轉錄組學、蛋白組學和免疫組學三方面對LTBI進展到ATB的研究進展作一綜述。

1 轉錄組學研究

轉錄組學是從RNA水平研究基因表達情況，主要是通過檢測篩選出與疾病相關的特異性差異性基因表達，從而發(fā)現(xiàn)可用于疾病診斷或風險預測的生物標志物。近年來，隨著高通量測序技術的發(fā)展，將測序應用于結核感染人群相關標志物的研究越來越多，全血中檢測基因轉錄組的研究方法成為熱點。一些研究小組結合轉錄組學的方法探索LTBI到ATB的進展，成功發(fā)現(xiàn)不少LTBI進展到ATB的生物標志物。Berry等[13]通過系統(tǒng)深入的研究，報道了一種86基因的TB標志物檢測組合，它主要是中性粒細胞驅動的1型干擾素，通過監(jiān)測血液中干擾素誘導的相關基因表達來評定活動性肺結核患者的治療效果，發(fā)現(xiàn)LTBI和ATB的差異基因表達，同時驗證其可靠性。Kaforou等[14]對TB、LTBI和其他疾病患者的血液轉錄生物標志進行了研究，并在一項病例對照研究中鑒定出44個轉錄本標志物，其敏感性為100%，特異性為96%。Costa等[15]則發(fā)現(xiàn)GZMA、GBP5和FCGR1A (CD64)基因的表達譜能夠將TB與非肺結核病肺炎及哮喘區(qū)分開來，敏感性為93%，特異性為95%。Bloom等[16]發(fā)現(xiàn)144份標本轉錄標志物能將結核與結節(jié)病、肺炎、肺癌和健康對照組患者區(qū)分開來，其敏感性超過80%，特異性超過90%。Sutherland[17]的研究在比較了4個不同非洲國家的患者后發(fā)現(xiàn)，CD64是診斷患者是否感染結核桿菌的一個有用標志物，它與艾滋病毒感染和研究地點無關。Anderson等[18]評估了來自南非，肯尼亞和馬拉維的疑似結核病兒童的mRNA轉錄特征，并將其與潛伏性結核病感染和其他疾病兒童的概況進行了比較，驗證診斷為結核病陽性的51份轉錄本，靈敏度為82.9%，特異性為83.6%。Zak DE等[19]前瞻性觀察研究南非6 363例12～18歲LTBI青春期隊列，每6個月采血監(jiān)測比較結核病的進展，通過對46例進展為ATB和匹配對照107列仍然是LTBI的全血RNA進行測序，鑒定了發(fā)展為ATB病人的16個基因標志物，用于預測從LTBI發(fā)展為ATB的敏感性為66.1%，特異性為80.6%；研究者又用獨立的2個隊列進行驗證，隨訪2年，分別有43例及30例進展為ATB，通過實時熒光定量PCR驗證轉錄組的16個基因表達，12個月時該16個基因的表達譜用于預測LTBI進展到ATB的靈敏度為53.7%，特異度82.8%[19]。Sweeney 等[20]發(fā)現(xiàn)3個基因(GBP5, DUSP3和KLF2)組合用于活動性結核的診斷,然后在11個數(shù)據(jù)庫驗證該組合在診斷結核病的效能, 結果發(fā)現(xiàn)該基因組合在鑒別診斷結核患者和健康對照或潛伏感染的效果較好, AUC分別為0.9 (敏感性85%, 特異性93%)和0.88(敏感性80%, 特異性86%)。Sara Suliman等[21]人發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)如南非和岡比亞血液轉錄組基因表達具有地域特異性結核病進展標志物，進而研究適用于部分非洲地區(qū)四基因(RISK4：GAS6、SEPT4、CD1C、BLK)表達譜可以預測結核病高風險人群患病的方法, 此法在南非、岡比亞和埃塞爾比亞三個非洲國家驗證，結果顯示隊列中結核病進展的風險預測較好。隨后作者將RISK4基因表達與Sweeney 等[20]發(fā)表的轉錄標志物DIAG3(3基因診斷標志物)、Maertzdorf等[22]發(fā)表的轉錄組標志物DIAG4(4基因診斷標志物，敏感性為88%，特異性為75%)和之前發(fā)表的16個基因標志物[19]進行比較，這些標志物的準確性接近，差異沒有統(tǒng)計學意義，但DIAG3、DIAG4和發(fā)表的16個基因標志物在預測性能上表現(xiàn)出了隊列的差異性，且未在不同地區(qū)不同人群驗證，這表明RISK4是一個更大眾化更全面的預測標志物。LV L等[23]報道了ATB與LTBI患者血清中外泌體的RNA系列，鑒定出20個頂端差異性表達基因(DEGS)可提供ATB和LTBI的鑒別，建立了LTBI和ATB高表達的DEGS 6個表達類型。陳獻雄等[24]在驗證所篩選的基因轉錄組發(fā)現(xiàn)HBB和TNFRSF10C-在結核患者比對照組表達高,而且經(jīng)抗結核治療后有顯著下降,其中HBB基因在診斷健康對照和結核患者, AUC為0.98,敏感性為100%,特異性為95%;在診斷潛伏感染和結核患者,AUC為0.985,敏感性為100%,特異性為95%.TNFRSF10C基因在診斷健康對照和結核患者,AUC為1.00,敏感性為100%, 特異性為100%;在診斷潛伏感染和結核患者, AUC為0.9775,敏感性為95%,特異性為100%。Jennifer R等[25]在英國一項隊列研究中發(fā)現(xiàn)新型三基因轉錄信號(BATF2、GBP5、SCARF1)用于預測LTBI發(fā)展為ATB的效果，333個HIV陰性結核病患者新隊列中，平均隨訪346 d陽性預測值(PPV)為50%(95%置信區(qū)間：15.7%～84.3%)，陰性預測值(NPV)為99.3%(97.5%～99.9%)。這些研究從轉錄組學的角度闡述了LTBI發(fā)展為ATB的變化過程，也篩選出部分差異表達的基因標記物，這些標記物敏感性和特異性各異，在不同人群和不同地區(qū)準確性不同，表明用于預測LTBI發(fā)展為ATB的基因標記物存在人群和地域的差異性。這些結果為將來標記物的進一步研究和臨床應用提供了科學依據(jù)。

2 蛋白組學研究

蛋白組學是針對生物所能表達的所有蛋白質，是尋找疾病分子標記物有效的方法之一。結核分枝桿菌在進入機體潛伏感染并轉化成為ATB的過程中，會引發(fā)機體內各種細胞因子及相關蛋白發(fā)生一系列的動態(tài)變化，這些變化的檢測就為預測LTBI轉化成為ATB的診斷提供了可能。而且蛋白組學可檢測樣本類型多樣，有血漿、血清、尿液、單細胞、外泌體[26]等，有利于樣本點采集和普及。有研究發(fā)現(xiàn)在血清中LTBI相較于正常人白介素-2、單核趨化蛋白2、干擾素誘導蛋白-10、干擾素-10、腫瘤壞死因子超家族成員14、顆粒酶B等蛋白出現(xiàn)顯著性差異[27]。Young BL等[28]發(fā)現(xiàn)在尿液當中有10種分枝桿菌蛋白僅在明確的結核病患者的尿液中發(fā)現(xiàn)，而有6種分枝桿菌蛋白僅在假定的LTBI患者的尿液中發(fā)現(xiàn)。Xu等[29]先對活動性肺結核患者和健康人的血清進行iTRAQ技術耦合雙向液相色譜與串聯(lián)質譜技術分析，篩選出100個差異蛋白，對其中載脂蛋白C Ⅱ、類CD5抗原、透明質酸結合蛋白2、視黃醇結合蛋白4、血清淀粉樣蛋白A4和血漿酶原結合蛋白進行Western Blot及Elisa方法驗證。ATB和LTBI外泌體結核分枝桿菌多肽也已經(jīng)被證實能檢測出20種[30]。ATB相較于LTBI和正常對照組的粗血漿總蛋白表達譜在11 kDa和在5 kDa區(qū)域出現(xiàn)明顯的上調[31]。Sigal等[32]發(fā)現(xiàn)SAA1，PCT，IL-1l，IL- 6、CRP，PTX-3，MMP-8共7個蛋白與結核病的疾病進程有密切關系。SunH等[33]檢測出LTBI和ATB的31個差異顯著蛋白，Western Blot檢測其中8個蛋白的結果與之100%一致,有6個能夠被ELISA檢驗出顯著性差異。Li C等[34]的研究發(fā)現(xiàn)：健康對照組和肺結核病人組的蛋白表達相比，肺結核病人血清中有26種蛋白表達水平發(fā)生顯著的變化。國內有研究表明Rv0494蛋白可能下調了結核桿菌的生理活性相關基因的表達，從而減緩了結核桿菌在壓力環(huán)境下的生長速率[35]，感染者以潛伏狀態(tài)存在。Yoon等[36]報道的一項即時臨床C反應蛋白(CRP)試驗，用于篩查HIV感染者中的結核病人，診斷結果經(jīng)培養(yǎng)證實的結核病，敏感性為89%，特異性為72%。CRP與其他六種蛋白質結合可在疑似患有肺結核的個體中診斷出肺結核，在5個非洲國家研究結果敏感性為93.8%，特異性為73.3%。De Groote等[37]通過SOMAscan(定量生物標志物檢測)技術發(fā)現(xiàn)了6種蛋白質生物特征可作為結核病的篩查工具，在來自各種結核病流行地區(qū)的700多個樣本測試中，其敏感性為90%，特異性為80%。Chegou NN等[38]在非洲5個國家的流行病學研究，從716名參與者的血清中檢測到7種宿主血清蛋白生物標志物，可在不同地區(qū)用于診斷結核病，不受是否感染HIV影響，敏感性為93.8%，特異性為73.3%，陽性和陰性預測值分別為60.6%和96.4%。這些研究為診斷區(qū)分LTBI和ATB提供了一定的理論基礎。

3 免疫組學研究

免疫組學是利用組學技術研究免疫系統(tǒng)的全套分子庫及作用的靶分子等。結核桿菌感染后，會誘發(fā)機體產(chǎn)生一些列復雜的免疫應答，T 細胞介導的細胞免疫應答在其感染及發(fā)病過程中發(fā)揮關鍵作用，T細胞亞群比例及相關細胞因子是決定細胞免疫強弱的主要因素，了解其致病機制和宿主免疫反應之間的相互作用，有助于找到感染各階段合適的免疫學標記物。目前公認的 LTBI 的診斷需依靠結核菌素皮試(tuberculin skin test，TST)及γ-干擾素釋放試驗(interferon-γ release assay，IGRA)，通過體內、體外及離體檢測特異性抗原刺激后記憶T細胞的免疫應答，但尚無證據(jù)表明TST及IGRA可鑒定結核病從感染到發(fā)病的不同階段和發(fā)展趨勢，不能鑒別LTBI和ATB，因此TST和IGRA是當前可接受但不完善的診斷方法。Diel R等報道TST和IGRA在感染清除后檢測仍可陽性，預測LTBI到ATB進展能力較差，陽性預測值分別為1.5%和2.7%[39]。有研究發(fā)現(xiàn)活動性結核病患者體內分泌TNF的特異性 CD4+T細胞有助于區(qū)分活動性結核病和潛伏結核感染[40]。部分趨化因子及細胞因子已經(jīng)被證實和結核病先天性免疫應答相關[41]。KEGG pathway分析結果則提示細胞因子在結核發(fā)病起了重要的作用[42]。La Manna MP等[43]研究發(fā)現(xiàn)外周血中單核細胞與淋巴細胞的比率是評價感染條件下免疫反應效能的重要指標，其比值增加可能與活動性結核的嚴重程度有關，可用于預測ATB的風險。Barcellini L等[44]評估增加刺激CD4+和CD8+T細胞新抗原TB2的QFT-Plus檢測(新型干擾素釋放實驗QuantiFERON-TB Gold Plus)，QFT-GIT(γ-干擾素釋放試驗,QuantiFERON-TB gold In-Tube)與QFT-Plus總符合率為80%，CD8+應答與結核桿菌暴露量增加有關，提示可鑒定近期感染。Rozot V等[45]發(fā)現(xiàn)LTBI和ATB中，特異CD8+T細胞(主要為效應性記憶細胞)功能和表型不同，分別占15%和60%。Ruhwald M等[46]在979例C-TB皮試安全性研究中，皮試結果與QFT的結果符合率為94%(785/834)，硬結≥5 mm時，ATB陽性率為67%。Petruccioli E等[47]研究檢測6種細胞因子區(qū)分LTBI和ATB，發(fā)現(xiàn)Ag85A-Ab和IFNγ特異性T細胞增高與ATB風險降低有關，CD27-IFNγ+CD4+T細胞可能是結核病預測的標志物。楊永林等[48]評價γ干擾素誘導蛋白10(IP-10)可能是鑒別 ATB和LTBI的有效工具，鑒別ATB和LTBI的敏感度為80% ，特異度為90%。而KEGG pathway分析結果則提示細胞因子在結核發(fā)病過程中起了重要的作用[49]， IL-1, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IL-17, IFN-γ,TNF-α等細胞因子和結核密切關系已獲得證實[50]。Sen W等[51]分析確定了經(jīng)結核抗原刺激的IFN-γ，IP-10和IL-1Ra的六細胞因子生物特征，以及未經(jīng)刺激的IP-10，VEGF和IL-12(p70)的生物特征，并進一步評估，結果顯示靈敏度為85.7%，特異性為91.3%，總準確度為88.7%，可以準確區(qū)分ATB和LTBI，這種方法有望用于ATB的早期快速診斷檢測。LTBI宿主體內的免疫系統(tǒng)能夠控制結核桿菌的活躍復制而不發(fā)展為結核病，但在免疫力低下時，結核桿菌能夠重新復制而發(fā)展為結核病人并出現(xiàn)相應的臨床癥狀。對LTBI宿主和結核患者體內細胞免疫反應差異深入的分析，將為區(qū)分ATB和LTBI提供可能的標志物，如研究較多的細胞因子、特異性T細胞等，均表現(xiàn)出了免疫反應的差異性。

4 LTBI進展到ATB研究展望

綜上所述，在研究LTBI進展到ATB的生物學標志物中，免疫組學和蛋白組學的研究較多，主要是分析組學中各種標志物的差異，但真正用于診斷區(qū)分LTBI和ATB的報道較少。免疫組學主要分析出IP-10等[52]細胞因子的生物特征，可以區(qū)分LTBI和ATB，但沒有得到進一步驗證和推廣。蛋白質組學研究仍停留在一個基礎的水平，沒有深入探討差異蛋白在結核病發(fā)病機制中的作用，檢測出一些差異蛋白但標本量較少，缺乏評估和驗證。轉錄組學的研究最多，也獲得了比較重要的標志物，很多標志物很有希望應用于臨床(準確性>80%)，部分標志物也通過RT-qPCR方法進行驗證[20-22]，局限性在于研究在多個地點進行，只采用了回顧性病例對照研究，均使用了案例控制設計，處于第二階段的診斷研究，靈敏度和特異度仍有待提高。

現(xiàn)有的研究和進展有一定的局限性，但也為今后更多更加深入的生物標志物研究提供了方向和理論基礎。結核桿菌致病機制與宿主免疫反應之間的相互作用關系較為復雜，更好地理解潛伏性結核感染的發(fā)病機制是未來重要的研究內容，這些研究有助于發(fā)現(xiàn)免疫生物標志物，進而提升發(fā)病預測能力。一些免疫因子的變化情況與機體自身免疫狀況乃至地域性差異有一定聯(lián)系，針對多種免疫因子的復合診斷方法或許成為今后研究的方向。蛋白質組學中結核桿菌對人體宿主的致病機制取決于蛋白質或蛋白質-核酸的相互作用，了解差異蛋白質在結核病病程中的變化，有助于探討機體的病理變化和活動性結核病的發(fā)病機制，多種目標蛋白標志物組合建立診斷方法已成為發(fā)展趨勢。轉錄組學是基于結核桿菌感染后引起機體的基因表達發(fā)生一系列變化，上調或下降，高通量測序技術可以準確的分析基因表達差異，為結核病特異性發(fā)病機制提供潛在思路?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)的差異基因比較多，不同國家不同地區(qū)的標志物在性能上表現(xiàn)出了隊列差異，聯(lián)合篩選出適合本地區(qū)的基因標志物，采用前瞻性、大樣本量的研究方法，并通過整合分析和分子生物學驗證其可靠性，建立LTBI發(fā)展為ATB的診斷模型是轉錄組學的研究方向。

5 結 語

世界衛(wèi)生組織提出的2035年終止全球結核病的流行總目標，我國在結核病防制中還面臨著諸多挑戰(zhàn)，而篩選出比較明確的生物學標志物用于預測LTBI轉化成為ATB，將能從源頭精準進行預防性服藥，大幅抑制結核病的發(fā)展，也將是踐行“預防為主”，向終止結核病的流行總目標邁出重要一步。阻斷LTBI發(fā)展為ATB是結核病防制努力的方向，我們期待能盡早的研究發(fā)現(xiàn)鑒定LTBI發(fā)展為ATB的生物學標志物，并應用于實際的結核病防制工作中。目前結核病發(fā)病風險預測的研究還處在初級階段，轉錄組學領域有一定的成果，別的幾個領域暫時沒有顯著的成果報道。而如何提高發(fā)病風險生物學標記物的靈敏度和特異度，是今后研究需要改善的地方。

鑒于不同人群不同地區(qū)，生物學標志物可能不一樣，單一的組學或技術有其局限性?？梢钥紤]多個組學組合的方式進行研究，組學與其他學科交叉應用，多種技術方法整合互補，通過海量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學和相關性分析，篩選和驗證最適合本地區(qū)的生物學預警標記物，并且將檢測方法優(yōu)化，尋找出一種更為簡便、易于操作和經(jīng)濟的實驗方法，從而在臨床應用中推廣和普及。

利益沖突：無