杜仲誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化防治骨質(zhì)疏松癥相關(guān)信號(hào)通路研究進(jìn)展

趙繼榮 楊濤 趙寧 馬同 薛旭 李瑋農(nóng) 張立存

1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730030

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種因骨密度降低和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致的骨骼強(qiáng)度減低而易發(fā)生骨折的慢性骨代謝性疾病[1]?，F(xiàn)已成為全球主要的公共衛(wèi)生問題，具有較高的發(fā)病率和嚴(yán)重的死亡率。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界約2億婦女受其影響，由骨質(zhì)疏松引發(fā)的骨折每年可高達(dá)890萬次以上。而在中國，骨質(zhì)疏松癥影響著近700萬50歲以上的中國人，并且每年會(huì)造成近69萬例髖部骨折[2]。因而對(duì)于OP的發(fā)病機(jī)制及診療方法的探究一直是一個(gè)研究熱點(diǎn)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)OP研究已經(jīng)深入到分子學(xué)水平，認(rèn)為由破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收與成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成的偶聯(lián)平衡被打破致使骨吸收大于骨形成是引發(fā)骨質(zhì)疏松的主要發(fā)病機(jī)制[3]。故上調(diào)骨形成或抑制骨吸收是治療OP的重要原則。中醫(yī)將OP稱之為“骨萎”，根據(jù)經(jīng)典理論“腎主骨生髓”常治療以“補(bǔ)腎益髓”之法。多年來，研究人員在此理論指導(dǎo)下結(jié)合骨組織工程及細(xì)胞培養(yǎng)等高新技術(shù)，在OP的基礎(chǔ)研究及臨床治療方面成果顯著。本文作者查閱大量國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，茲就傳統(tǒng)中藥杜仲誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨細(xì)胞分化從而防治OP的相關(guān)信號(hào)通路研究作以綜述，以期為該病臨床診療提供新思路,從而造福廣大OP患者。

1 杜仲-骨質(zhì)疏松癥相關(guān)研究

杜仲為杜仲科植物杜仲(eucommia u1moides oliv.)的干燥樹皮，性甘溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，安胎之效[4]。作為我國傳統(tǒng)中藥，在臨床實(shí)踐中已使用兩千多年，神農(nóng)本草經(jīng)列為上品，曰其“主治腰膝痛，補(bǔ)中，益精氣，堅(jiān)筋骨”[5]?，F(xiàn)代研究[6]顯示杜仲皮、葉、花、種子不同部位含有木脂素類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類、萜類、甾體類、酚酸及多糖類等大約205種化學(xué)成分，并且現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有預(yù)防骨質(zhì)疏松、降血糖、控血壓、調(diào)血脂、保肝、抗腫瘤、抗炎等多種藥理活性。而近年來研究最多的則是其用于治療骨質(zhì)疏松癥。大量研究表明杜仲的水、醇提取物或者含藥血清能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，激活骨重建，改善骨代謝，防治OP。堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)、骨保護(hù)素(OPG)及Ⅰ型前膠原C-端前肽/N-端前肽(PICP/PINP)均為骨形成標(biāo)志物，能夠反映成骨細(xì)胞的活性[7]。方寧等[8]采用不同濃度梯度的杜仲葉提取物對(duì)大鼠成骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)杜仲葉提取物可以通過促進(jìn)骨鈣素(BGP)的表達(dá)而影響成骨細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)濃度依賴性。翁澤斌等[9]使用杜仲及其鹽制品對(duì)去卵巢雌性大鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)杜仲生品及鹽制品在抑制血鈣降低的同時(shí)能夠升高血磷、ALP和BGP，從而降低高骨轉(zhuǎn)換率，發(fā)揮治療OP的作用，且鹽制杜仲效果更優(yōu)。另外曹旭等[10]采用杜仲不同濃度的含藥血清對(duì)小鼠MC3T3-E1 Subclone 14成骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)杜仲含藥血清能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，增加ALP的分泌，上調(diào)OPG/RANKL系統(tǒng)以改善骨重建和骨平衡。胡倩影等[11]研究發(fā)現(xiàn)杜仲有效成分松脂素二葡萄糖苷能夠促進(jìn)OPG的分泌來抗骨質(zhì)疏松，松脂素則既能通過促進(jìn)OPG分泌又能通過抑制RANKL表達(dá)來發(fā)揮作用。除了上述及大量研究證實(shí)了杜仲可作用于成骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，增加其活性，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用外，還有研究表明杜仲能夠誘導(dǎo)BMSCs增殖及向成骨細(xì)胞定向分化，從而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用，但是其具體分子機(jī)制及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚不清楚，存在爭議。

2 杜仲-BMSCs成骨分化-骨質(zhì)疏松癥相關(guān)信號(hào)通路研究

骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制主要是因?yàn)槌晒羌?xì)胞與破骨細(xì)胞平衡被打破，骨吸收大于骨形成，因而成骨細(xì)胞在抗骨質(zhì)疏松中起至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞主要來源于BMSCs。20世紀(jì)70年代Friedenstein等[12]首次從大鼠骨髓中分離出BMSCs，并發(fā)現(xiàn)此細(xì)胞可以向骨細(xì)胞分化，此后Crapnell等[13]研究發(fā)現(xiàn)BMSCs可以很容易地在體外環(huán)境進(jìn)行擴(kuò)增，Bianco等[14]在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)BMSCs具有較強(qiáng)的自我更新能力。后來研究[15]發(fā)現(xiàn)BMSCs具有多項(xiàng)分化的潛能，在一定誘導(dǎo)條件下，可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。因?yàn)榫哂休^強(qiáng)的自我更新能力，能夠在離體條件下擴(kuò)增且具有多項(xiàng)分化的潛能，BMSCs成為了細(xì)胞治療和組織工程中有用的工具。

近年來，使用中藥制劑誘導(dǎo)BMSCs 向成骨細(xì)胞分化來防治OP受到廣泛的關(guān)注，成為臨床研究和實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)之一。誘導(dǎo)BMSCs分化為成骨細(xì)胞是一個(gè)高度復(fù)雜且程序化的過程，在多種信號(hào)分子的共同作用下，BMSCs首先產(chǎn)生骨前體細(xì)胞，隨后依次形成骨原細(xì)胞、前成骨細(xì)胞、功能性骨形成細(xì)胞，最后形成成熟骨細(xì)胞[16]。臨床多使用地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C組合作為成骨誘導(dǎo)劑。而近年來研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)補(bǔ)腎中藥杜仲提取物或其含藥血清可以作為BMSCs成骨分化的誘導(dǎo)劑，而其發(fā)揮作用的機(jī)制涉及Wnt/β-catenin、MAPK、RhoA/ROCK等多種信號(hào)通路，下面對(duì)其進(jìn)行闡述。

2.1 杜仲對(duì)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路調(diào)控研究

Wnt信號(hào)通路為目前骨代謝相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。Wnt參與的信號(hào)通路包括經(jīng)典的Wnt/β-catenin途徑以及非經(jīng)典的 Wnt/PCP與 Wnt/Ca2+途徑[17]。其中經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育和維持骨骼內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要信號(hào)調(diào)節(jié)通路[18]。該信號(hào)通路由Wnts蛋白、低密度脂蛋白相關(guān)受體蛋白5/6(LPR5/6)、卷體蛋白(frizzled,Frz)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、散亂蛋白 (dishevelled, Dsh)、β-鏈蛋白 (β-catenin)、結(jié)直腸腺瘤性息肉蛋白 (APC)、軸蛋白(Axin)和核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子(TCF)/淋巴樣增強(qiáng)因子(LEF)等幾種蛋白質(zhì)構(gòu)成[19]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路主要通過調(diào)控成骨細(xì)胞定向分化和特異性基因的表達(dá)，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的礦化，促進(jìn)骨形成，調(diào)控骨重建。

研究發(fā)現(xiàn)杜仲可以誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化來治療OP。張賢等[20]用杜仲醇提取物對(duì)第3代SD大鼠BMSCs進(jìn)行干預(yù)，采用熒光定量PCR法檢測(cè)杜仲誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化過程中Wnt信號(hào)通路中多種相關(guān)因子的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)與陰性對(duì)照組比較，誘導(dǎo)3 d后Fzd2表達(dá)升高11.86倍，F(xiàn)zd3升高達(dá)到2倍；誘導(dǎo)7 d后，F(xiàn)zd2表達(dá)升高5.12倍，F(xiàn)zd3恢復(fù)到正常水平；β-catenin 在誘導(dǎo)3 d 時(shí)表達(dá)升高達(dá)2倍；WIF1在誘導(dǎo)3 d和7 d后表達(dá)顯著下降，說明杜仲誘導(dǎo)BMSCs成骨分化主要與上調(diào)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路中的Fzd2、Fzd3、β-catenin蛋白受體，下調(diào)Wnt蛋白抑制因子WIF1因子相關(guān)。湯軍等[21]采用杜仲醇提取物對(duì)大鼠BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)Fzd受體參與了杜仲誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的過程，響應(yīng)時(shí)間出現(xiàn)在第3天。綜上所述，杜仲誘導(dǎo)BMSCs成骨分化主要是通過對(duì)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的調(diào)控，主要與Fzd2及Fzd3受體、β-catenin蛋白、WIF1因子有關(guān)。

2.2 杜仲對(duì)MAPK信號(hào)通路調(diào)控研究

絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是存在于一系列哺乳動(dòng)物中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞外刺激到細(xì)胞核的重要傳遞者，是參與細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等多方面的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶[22]。其家族包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular-signal regulated kinase,ERK1/2)、c-Jun 氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38MAPK三種蛋白激酶[23]。ERK是最早被發(fā)現(xiàn)的MAPK信號(hào)通路，包括ERK1及ERK2兩種亞型，兩種均在成骨細(xì)胞中表達(dá)，p38MAPK具有p38α、p38β、p38γ和p38δ四種亞型，JNK信號(hào)通路共有JNK1、JNK2、JNK3三種亞型，其中JNK1和JNK2普遍表達(dá)，而JNK3的表達(dá)較局限，主要存在于神經(jīng)元中[24]。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要是通過三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行，首先MAP3K磷酸化MAP2K，被磷酸化激活的MAP2K中存在針對(duì)下游MAPK128的MAPK對(duì)接結(jié)構(gòu)域，確保了MAP2K磷酸化激活MAPK的特異性，被活化的MAPK磷酸化激活下游多種靶基因的表達(dá)[25]。近年來，多項(xiàng)研究表明MAPK信號(hào)通路在促進(jìn)BMSCs成骨分化改善OP的過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。Yang等[23]研究發(fā)現(xiàn)葛根中的主要異黃酮類化合物葛根素能夠使ERK1/2和p38磷酸化，從而誘導(dǎo)BMSCs成骨分化。Song等[26]研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿主要活性黃酮苷即淫羊藿苷可迅速誘導(dǎo)ERK和JNK活化，從而使成骨細(xì)胞增殖。

研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎中藥杜仲誘導(dǎo)BMSCs成骨分化與MAPK信號(hào)通路密切相關(guān)。張立超等[27]研究發(fā)現(xiàn)杜仲葉提取物可以激活MAPK/ERK磷酸化活性來促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞增殖。陳林攀等[28]用杜仲葉提取物槲皮素對(duì)SD 大鼠第三代BMSCs進(jìn)行干預(yù)，Western blot結(jié)果顯示槲皮素能夠提高ERK的磷酸化水平，在促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的同時(shí)，激活Shp2，活化ERK信號(hào)通路從而促進(jìn)大鼠 BMSCs 增殖和成骨分化。

2.3 杜仲對(duì)RhoA/ROCK信號(hào)通路研究

在BMSCs成骨分化的進(jìn)程中，細(xì)胞骨架會(huì)發(fā)生改變，而Ras同源基因/Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶(RhoA/ROCK)信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞骨架的關(guān)鍵信號(hào)通路之一。Rho蛋白包括Rho A、Rho B、Rho C、Rho D、Rho E五種亞型，屬于小G蛋白家族，其中Rho(A-C)具有高度同源性。當(dāng)Rho與鳥嘌呤二核苷酸磷酸(GDP)結(jié)合時(shí)處于失活狀態(tài)，與鳥嘌呤三核苷酸磷酸結(jié)合時(shí)被激活，ROCK是Rho的主要下游靶基質(zhì)，包括ROCK1和ROCK2兩種亞型，多項(xiàng)研究表明RhoA/ROCK信號(hào)通路在BMSCs成骨分化過程中發(fā)揮著重要作用。Zhang等[29]研究發(fā)現(xiàn)二甲氧甘氨酸通過激活RhoA/ROCK信號(hào)通路能夠促進(jìn)BMSCs成骨分化。Yang等[30]研究表明RhoA/ROCK信號(hào)通路可能通過介導(dǎo)細(xì)胞骨架變形來促進(jìn)BMSCs的成骨分化。Saidova 等[31]認(rèn)為RhoA/ROCK信號(hào)通路無論是通過增加張力還是通過從動(dòng)態(tài)微管中釋放出的FGF-H1的激活都有利于成骨，并抑制BMSCs向軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化。

研究發(fā)現(xiàn)中藥杜仲可通過RhoA/ROCK信號(hào)通路誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化。林奇生等[32]用杜仲醇提取物對(duì)OP大鼠模型進(jìn)行灌胃干預(yù)，發(fā)現(xiàn)杜仲中高劑量組大鼠ROCK1、RhoA mRNA表達(dá)量、BMSCs成骨誘導(dǎo)后骨橋蛋白 (OPN)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 (Runx2)、骨鈣素 (OCN) mRNA表達(dá)顯著升高，這表明杜仲醇提取物能夠促進(jìn)BMSCs增殖及成骨分化。

3 總結(jié)與展望

OP作為全世界面臨的重大公共衛(wèi)生健康問題，現(xiàn)代分子生物學(xué)研究認(rèn)為由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收形成的偶聯(lián)平衡被打破致使骨吸收大于骨形成是其主要發(fā)病機(jī)制，故而促使成骨細(xì)胞增殖可有效防治OP。而BMSCs作為一種多潛能干細(xì)胞，是成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，在一定誘導(dǎo)條件下可向成骨細(xì)胞定向分化。中國醫(yī)藥學(xué)是一個(gè)偉大的寶庫，中醫(yī)學(xué)稱OP為“骨萎、骨枯、骨極”，在中醫(yī)經(jīng)典理論“腎主骨生髓”指導(dǎo)下，常用以補(bǔ)腎中藥來治療OP。近年來，研究人員將此理論與骨組織工程及細(xì)胞培養(yǎng)等高新技術(shù)相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)補(bǔ)腎中藥杜仲能夠有效防止OP，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)BMSCs增殖及向成骨細(xì)胞定向分化，重新建立骨吸收與骨形成的偶聯(lián)平衡相關(guān)。而其誘導(dǎo)BMSCs成骨分化機(jī)制涉及Wnt/β-catenin、MAPK及RhoA/ROCK等多種復(fù)雜的信號(hào)通路。目前研究發(fā)現(xiàn)杜仲能夠上調(diào)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路中的Fzd2、Fzd3、β-catenin蛋白受體，下調(diào)Wnt蛋白抑制因子WIF1因子，能夠激活Shp2，活化ERK信號(hào)通路，并且能夠影響RhoA/ROCK信號(hào)通路中ROCK1、RhoA mRNA表達(dá)量、BMSCs成骨誘導(dǎo)后骨橋蛋白 (OPN)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 (Runx2)、骨鈣素 (OCN) mRNA表達(dá)，從而誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞定向分化，發(fā)揮防治OP的作用。

許多傳統(tǒng)的中草藥已經(jīng)在臨床實(shí)踐中使用了數(shù)千年，它們被證明有效，適應(yīng)癥廣泛，安全性高，但是其復(fù)雜的化學(xué)成分導(dǎo)致其物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制不明確，這成為制約中藥走向世界的瓶頸問題。杜仲皮、葉、花、種子不同部位含有大約205種化學(xué)成分，其防治OP物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索，這就需要結(jié)合現(xiàn)代科技手段，融合生物、化學(xué)、信息等多學(xué)科，發(fā)現(xiàn)其在治療OP中的新靶點(diǎn)、新物質(zhì)及新機(jī)制，讓其走向世界，造福于人類。