高尿酸血癥及其相關(guān)疾病中miRNAs作用研究進(jìn)展

馬冬艷 孫凱琳 高偉微 王毅鵬

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院內(nèi)分泌科，云南 昆明 650051)

高尿酸血癥(HUA)是指正常嘌呤飲食狀態(tài)下，非同日2次空腹血尿酸水平：男大于420 μmol/L，女大于360 μmol/L〔1〕。隨著人們飲食的結(jié)構(gòu)變化，HUA發(fā)病率不斷升高〔2〕。Qiu等〔3〕研究表明在中國(guó)北部和東北部的健康成年人中HUA患病率高達(dá)13.7%。HUA是因體內(nèi)尿酸生成增多和(或)尿酸排泄減少所致。其中尿酸生成增多約占原發(fā)性HUA病因的10%，主要由嘌呤代謝酶的缺陷引起，包括磷酸核糖焦磷酸(PRPP)合成酶活性增高、磷酸核糖焦磷酸?；D(zhuǎn)移酶(PRPPAT)的活性或者濃度增高、次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)的一部分缺失、黃嘌呤氧化酶(XO)的活性增強(qiáng)〔4～6〕；尿酸排泄減少約占原發(fā)性HUA病因的90%，包括腎小球?yàn)V過(guò)減少、腎小管重吸收增多、腎小管分泌減少及尿酸鹽結(jié)晶沉積〔7〕。HUA可能在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)不會(huì)引起明顯的臨床癥狀，僅有波動(dòng)性或持續(xù)性血尿酸升高，但尿酸鹽沉積可能已經(jīng)損害了組織和內(nèi)臟，實(shí)驗(yàn)證明，HUA不僅僅會(huì)導(dǎo)致痛風(fēng)，而且還是心血管疾病(CVD)和慢性腎臟疾病(CKD)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔8，9〕。

miRNA(microRNA)是一種內(nèi)源性非編碼RNA，被鑒定為基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)因子〔10〕。miRNA大概是19～22個(gè)核苷酸的單鏈RNA，靶信使RNA穩(wěn)定性通過(guò)miRNA選擇性地結(jié)合到特定位點(diǎn)來(lái)調(diào)節(jié)〔11〕。到目前為止，已鑒定出5 000多個(gè)miRNAs，其中miRNAs在多種人類(lèi)疾病中發(fā)揮重要作用，包括癌癥、代謝性疾病和炎癥性疾病。miRNAs主要與目標(biāo)mRNAs的3′-非翻譯區(qū)(3′UTR)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或mRNA翻譯的抑制〔10〕。研究表明miRNAs可以與目標(biāo)mRNAs的其他區(qū)域結(jié)合，從而導(dǎo)致翻譯抑制或激活〔10〕。大約60%的蛋白質(zhì)編碼基因是被miRNAs在單個(gè)或多個(gè)細(xì)胞通路上調(diào)節(jié)的。miRNAs在人體體液中以穩(wěn)定的形式存在，如血漿、唾液和尿液，所以可能是相關(guān)疾病的生物標(biāo)志物〔12〕。

1 HUA發(fā)病過(guò)程中miRNAs的作用

嘌呤的生成與轉(zhuǎn)化主要在肝臟中進(jìn)行，終產(chǎn)物是尿酸，尿酸經(jīng)腎小球的濾過(guò)、腎小管的重吸收、分泌及再吸收等過(guò)程，最終通過(guò)尿液排出。對(duì)于人類(lèi)，近端小管重吸收在調(diào)節(jié)尿酸排泄中起關(guān)鍵作用〔13〕。影響嘌呤代謝和尿酸排泄過(guò)程的任何因素，都有可能導(dǎo)致HUA。

1.1miR-448上調(diào)通過(guò)抑制XO蛋白的表達(dá)降低尿酸的生成 XO是嘌呤核苷酸的一種分解代謝酶，可以催化鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤氧化為黃嘌呤，并能繼續(xù)催化黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸，是體內(nèi)尿酸生成的關(guān)鍵作用酶。以黃嘌呤氧化酶為作用靶點(diǎn)的黃嘌呤氧化酶抑制劑，通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶的作用減少尿酸生成，從而有效降低血尿酸水平。別嘌呤醇是一種嘌呤類(lèi)似物，結(jié)構(gòu)與次黃嘌呤結(jié)構(gòu)相似，只是分子N7與C8的位置發(fā)生了互換，故可抑制XO，從而抑制尿酸的生成，是血清尿酸鹽異常升高的最常見(jiàn)的臨床治療方法〔14〕。Knake等〔15〕在臨床研究中發(fā)現(xiàn)別嘌呤醇和呋塞米(速尿)一起用藥時(shí)別嘌呤醇降尿酸作用減弱，需要加大別嘌呤醇的用藥劑量才能將尿酸降至目標(biāo)值，推測(cè)速尿可能通過(guò)直接與XO作用或阻礙了別嘌呤醇與XO的結(jié)合從而影響了別嘌呤醇的降尿酸作用。首先采用熒光素酶法檢測(cè)XO的活性發(fā)現(xiàn)別嘌呤醇顯示了一種劑量依賴(lài)性的XO活性抑制作用，相反，速尿(高達(dá)1 200 μmol/L)對(duì)XO活性沒(méi)有影響，也不改變別嘌呤醇介導(dǎo)的XO抑制作用，此結(jié)果排除了速尿直接與XO作用影響嘌呤代謝的推測(cè)。其次通過(guò)人肝臟細(xì)胞(HepG2)的培養(yǎng)，并用別嘌呤醇和速尿進(jìn)行干預(yù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，別嘌呤醇干預(yù)HepG2時(shí)XO蛋白表達(dá)有明顯下調(diào)，而速尿單獨(dú)或速尿和別嘌呤醇一起干預(yù)時(shí)XO蛋白表達(dá)沒(méi)有變化，故首次提出別嘌呤醇降尿酸作用，除了已知的直接抑制XO活性的作用，也可能由于抑制XO蛋白的表達(dá)而起作用〔14〕。為了進(jìn)一步探討別嘌呤醇和速尿?qū)O蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，最后使用數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)軟件來(lái)鑒定調(diào)控的miRNAs時(shí)發(fā)現(xiàn)在XO基因3′UTR上有一個(gè)miR-448結(jié)合位點(diǎn)，并通過(guò)驗(yàn)證得出別嘌呤醇或速尿干預(yù)HepG2時(shí)，HepG2 miR-448表達(dá)顯著上調(diào)，而這兩種藥物的聯(lián)合干預(yù)時(shí)miR-448的表達(dá)沒(méi)有顯著變化，故推測(cè)miR-448可能通過(guò)藥物依賴(lài)的方式調(diào)節(jié)XO蛋白表達(dá)從而影響尿酸生成，其機(jī)制為miR-448上調(diào)抑制黃嘌呤氧化酶蛋白的表達(dá)導(dǎo)致嘌呤代謝受抑制從而降低尿酸的生成。

1.2miR-34a上調(diào)通過(guò)抑制尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(URAT)1的表達(dá)減少尿酸的重吸收從而增加尿酸的排泄 尿酸無(wú)法自行通過(guò)細(xì)胞膜，腎臟對(duì)尿酸鹽的清除是依靠專(zhuān)門(mén)的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(OATs)進(jìn)行的。URAT1由SCL22A12基因編碼，是一種電中性的尿酸鹽交換子，不受細(xì)胞內(nèi)外pH值和膜電位的影響完成轉(zhuǎn)運(yùn)尿酸，其功能是負(fù)責(zé)尿酸重吸收〔16〕。Hosoyamada等〔17〕發(fā)現(xiàn)進(jìn)行URAT1基因敲除的小鼠血尿酸的水平比正常小鼠顯著提高，提示了URAT1是尿酸的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體。Enomoto等〔18〕證實(shí)尿酸鹽主要是通過(guò)URAT1與有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)換的，故URAT1是非常重要的尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體。若URAT1蛋白的表達(dá)減少，則減少尿酸的重吸收、增加尿酸的排泄。因此，降低URAT1表達(dá)的藥物可以抑制尿酸的重吸收，促進(jìn)尿酸的排泄，降低血尿酸。Sun等〔19，20〕研究出中藥“泄?jié)岢苑?XZCBD)”，可有效降低血尿酸，并采用miRNA表達(dá)譜分析方法篩選了使用XZCBD藥物的HUA患者的相關(guān)miRNA發(fā)現(xiàn)，miR-34a存在顯著差異，且miR-34a的靶位點(diǎn)位于SLC22A12基因3′UTR的331～338位，即URAT1基因3′UTR的271～277位，其上調(diào)抑制了URAT1的表達(dá)，從而增加了尿酸的排泄。高、中、低劑量的XZCBD均能降低HUA小鼠模型的尿酸水平，各組腎組織中普遍存在URAT1和miR-34a的表達(dá)，但隨著治療劑量的增加，URAT1的mRNA表達(dá)呈下降趨勢(shì)，而miR-34a的表達(dá)呈增加趨勢(shì)，尿酸水平也隨之降低。因此，miR-34a可能通過(guò)藥物劑量依賴(lài)的方式調(diào)節(jié)URAT1的表達(dá)從而影響尿酸排泄〔20〕，其機(jī)制為miR-34a上調(diào)抑制URAT1的表達(dá)導(dǎo)致尿酸的重吸收減少?gòu)亩黾幽蛩岬呐判埂?/p>

2 HUA相關(guān)心血管疾病和腎臟疾病發(fā)病過(guò)程中miRNAs的作用

2.1miRNA可能通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞功能使HUA成為心血管疾病的危險(xiǎn)因素 尿酸升高導(dǎo)致的各種各樣的病理生理改變并不完全依賴(lài)尿酸結(jié)晶鹽的沉積，尿酸本身引起的內(nèi)皮損傷改變也不容小覷。血管內(nèi)皮細(xì)胞具有一系列復(fù)雜的生理功能，如調(diào)節(jié)血管收縮、舒張和維持血液流變學(xué)的穩(wěn)定，是循環(huán)系統(tǒng)發(fā)揮正常的生理功能的重要保證，而內(nèi)皮細(xì)胞損傷則是導(dǎo)致多種心血管疾病發(fā)病的始動(dòng)或促進(jìn)因素。

2.1.1miR-155上調(diào)通過(guò)抑制內(nèi)皮型一氧化氮(NO)合酶(eNOS)的表達(dá)、降低NO的釋放在高尿酸導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞舒張功能障礙的過(guò)程中起到了一定的作用 NO是內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS催化L-精氨酸而生成的，是已知的最強(qiáng)的擴(kuò)張血管因子之一〔21〕。內(nèi)源性NO的產(chǎn)生依賴(lài)于eNOS的活性和表達(dá)，eNOS表達(dá)減少，NO也生成減少，從而影響內(nèi)皮細(xì)胞的舒張。Zhang等〔22〕使用尿酸培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)后比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)尿酸培養(yǎng)組eNOS蛋白的表達(dá)下調(diào)、細(xì)胞上清液中NO含量也下降，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然后通過(guò)分析工具預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)人eNOS mRNA的3′UTR存在miR-155的結(jié)合序列。為了進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)采用雙熒光素酶的報(bào)告系統(tǒng)，又證實(shí)了之前預(yù)測(cè)的結(jié)果：miR-155 能夠直接靶向調(diào)控eNOS的表達(dá)。同時(shí)在高尿酸環(huán)境培養(yǎng)的HUVEC中，miR-155的表達(dá)出現(xiàn)了上升的現(xiàn)象，提示miR-155有可能通過(guò)調(diào)控eNOS的表達(dá)下降導(dǎo)致NO釋放減少在高尿酸導(dǎo)致內(nèi)皮舒張功能障礙的過(guò)程中起到了一定的作用。

2.1.2miR-663上調(diào)通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1的表達(dá)、降低磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)的表達(dá)在高尿酸導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞遷移功能障礙的過(guò)程中起到了一定的作用 于善棟等〔23〕報(bào)道在高尿酸條件下HUVEC中表達(dá)差異最顯著的miRNA是miR-663，高尿酸通過(guò)上調(diào)miR-663調(diào)控TGF-β1的表達(dá)從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移。HUA患者血清中的miR-663水平也顯著高于正常人，表明這種現(xiàn)象也可能發(fā)生在高尿酸患者中。Wang等〔24〕已證明TGF-β1通過(guò)抑制PTEN促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，PTEN是一種多功能磷酸酶，其主要底物為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸脂第二信使分子，磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸激活許多下游分子影響遷移〔25〕。Hong等〔26〕證實(shí)當(dāng)TGF-β1過(guò)表達(dá)時(shí)，PTEN的表達(dá)降低，促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的遷移；當(dāng)PTEN被敲除時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移抑制減弱，然而在高尿酸條件下TGF-β1過(guò)表達(dá)不能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，故提出了一種新的抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的機(jī)制，即miR-663上調(diào)通過(guò)抑制TGF-β1的表達(dá)上調(diào)PTEN的表達(dá)從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。

2.1.3miR-92a下調(diào)通過(guò)促進(jìn)Kruppel樣因子(KLF)2表達(dá)、抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)A表達(dá)在高尿酸導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞生成血管障礙的過(guò)程中起到了一定的作用 血管生成是內(nèi)皮細(xì)胞的一種重要功能。Yu等〔27〕通過(guò)HUVEC在高尿酸的環(huán)境下和正常環(huán)境中培養(yǎng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)高尿酸可抑制血管的形成，如血管長(zhǎng)度和數(shù)目的減少。同時(shí)用微陣列技術(shù)對(duì)高尿酸刺激的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)miR-92a在高尿酸環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)，miR-92a的下調(diào)伴隨著血管生成的抑制，表明miR-92a在高尿酸環(huán)境下可能是血管生成的正調(diào)節(jié)因子。Bhattacharya等〔28〕已證明KLF2具有抑制血管生成的作用，位于KLF2下游編碼的VEGFA基因是一種強(qiáng)促血管生成因子，因此推測(cè)KLF2可能通過(guò)下調(diào)VEGFA而抑制血管生成。然后又進(jìn)一步進(jìn)行miR-92a過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的KLF2表達(dá)降低、VEGFA的表達(dá)增加。KLF2基因敲除、VEGFA過(guò)度表達(dá)等實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)可減輕高尿酸介導(dǎo)的血管生成抑制作用。此外，在檢測(cè)HUA患者和正常人血清VEGFA水平時(shí)發(fā)現(xiàn)HUA患者血清VEGFA水平明顯低于正常人。因此得出結(jié)論高尿酸負(fù)性調(diào)節(jié)miR-92a，增加KLF2的表達(dá)，抑制VEGFA，導(dǎo)致血管生成減少。內(nèi)皮細(xì)胞舒張功能障礙、遷移功能障礙、新生血管功能障礙均可導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生，故miRNA可能參與了HUA相關(guān)心血管疾病的發(fā)病，使HUA成為了心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

2.2miRNA可能通過(guò)影響纖維化因子使HUA成為腎臟疾病的危險(xiǎn)因素

2.2.1miR-519d-3p上調(diào)可能通過(guò)TGF-β信號(hào)通路調(diào)節(jié)了高尿酸腎病的發(fā)生發(fā)展 董利平〔29〕采用miRNA基因芯片技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有顯著差異表達(dá)的miRNAs共11個(gè)，分別為miR-30c-2-3p，miR-1284，miR-519d-3p，miR-4682，miR-5004-3p，這5個(gè)為上調(diào)；miR-5002-3p，miR-487b-3p，miR-374a-5p，miR-30c-5p，miR-589-5p，miR-106b-3p，這6個(gè)為下調(diào)。又使用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)在HUA樣本及正常對(duì)照樣本中進(jìn)行驗(yàn)證顯著上調(diào)的miR-519d-3p及顯著下調(diào)的miR-30c-5p、miR-374a-5p，驗(yàn)證結(jié)果與芯片法保持一致。進(jìn)一步進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNA靶基因富集在細(xì)胞增殖、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物學(xué)基本功能上，其中表達(dá)上調(diào)的miRNA中miR-519d-3p預(yù)測(cè)出的靶基因Smad6、骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制劑(BAMBI)及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2均參與了TGF-β信號(hào)通路。TGF-β1通過(guò)TGF-β1/Smads 信號(hào)通路介導(dǎo)的上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化最終導(dǎo)致腎纖維化的機(jī)制已被公認(rèn)〔30〕，尿酸性腎病的腎臟病理改變以腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化為表現(xiàn)，以腎間質(zhì)纖維化病變?yōu)橹?，因此推測(cè)miR-519d-3p可能通過(guò)TGF-β信號(hào)通路調(diào)節(jié)了高尿酸腎病的發(fā)生發(fā)展。

綜上，miRNA與尿酸的生成、排泄及高尿酸引起心血管、腎臟疾病可能存在密切的關(guān)系，但目前此內(nèi)容在人體實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)等方面均研究較少，其研究前景廣闊。HUA引起心血管疾病、腎臟疾病的具體作用機(jī)制尚不明確，隨著科學(xué)的發(fā)展、HUA中的miRNAs作用的深入研究，能更好地闡明miRNA在HUA中的作用，為HUA的診治提供新的思路，也為HUA引起的心血管疾病和腎臟疾病提供新的治療靶點(diǎn)。