銀杏葉提取物治療肺纖維化的作用機(jī)制

潘玲，盧岳虹，宋策，譚玉萍，梁愛武，楊益寶，楊紅梅， 梁煒，姚平，馮玉青，羅美群，蘇齊鑒

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

纖維化是一種原因不明的慢性間質(zhì)性肺疾病。其病理特征主要為肺成纖維細(xì)胞的不斷增生及細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，造成肺組織結(jié)構(gòu)的破壞，最終導(dǎo)致慢性呼吸衰竭[1-2]。目前,肺纖維化無確切有效的治療方法。銀杏葉提取物（ginkgo biloba extract, GBE）是從銀杏葉中提取的一種化合物，具有抗氧化、清除自由基、抗炎及抑制細(xì)胞凋亡等多種作用[3-4]。本文通過對(duì)近年來有關(guān)GBE治療肺纖維化的研究進(jìn)行綜述，探討GBE治療肺纖維化的作用機(jī)制。

1 GBE通過改善氧化應(yīng)激發(fā)揮抗纖維化作用

肺臟由于其結(jié)構(gòu)位置及生理功能的特點(diǎn)，極易受到氧化應(yīng)激的外源性影響。越來越多的研究表明，氧化應(yīng)激與肺纖維化的形成密切相關(guān)，氧化與抗氧化失衡是肺纖維化重要發(fā)病機(jī)制之一[5]?；钚匝酰╮eactive oxygen species, ROS）作為氧化應(yīng)激的重要產(chǎn)物，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和生長因子的表達(dá)，降低抗氧化防御能力，促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞凋亡，引發(fā)炎癥；進(jìn)而沉積膠原，導(dǎo)致纖維化產(chǎn)生。還原型煙酰胺嘌呤二核苷酸氧化酶（non-phagocytic cell oxidase, Nox）是調(diào)節(jié)初級(jí)ROS產(chǎn)生的一類獨(dú)特的酶。Nox-2、Nox-4在纖維化患者中選擇性上調(diào)。負(fù)調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（NFE2-related factor 2, Nrf2）是氧化應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，Nrf2缺失促進(jìn)纖維化的發(fā)生。谷胱甘肽過氧化物酶減少也會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]。脂質(zhì)過氧化物丙二醛（malondialdehyde, MDA）是脂質(zhì)過氧化損傷后的最終產(chǎn)物之一，其含量可反映細(xì)胞和機(jī)體受氧化的程度。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）是重要的抗Nox，具有清除氧自由基、保護(hù)細(xì)胞質(zhì)膜免受損傷的作用，其含量可間接反映機(jī)體抗氧化的能力[7]。 因此，清除氧自由基，提高肺組織抗氧化能力，可作為防治肺纖維化發(fā)展的重要措施之一。

GBE中黃酮類作為天然的抗氧化劑，具有清除氧自由基以及清除超氧陰離子及一氧化氮等藥理作用。李無雙等[8]和宋軍等[9]的研究表明，GBE可抑制大鼠中MDA的產(chǎn)生，使含量降低；同時(shí)使SOD活力增強(qiáng)，抑制氧自由基反應(yīng)，阻止脂質(zhì)過氧化，直接發(fā)揮抗氧化作用；還可增加谷胱甘肽水平，下調(diào)環(huán)Nox-2基因表達(dá)，激活抗氧化應(yīng)激因子Nrf2的表達(dá)。這些結(jié)果證明GBE具有抗氧化應(yīng)激作用，對(duì)肺間質(zhì)纖維化具有一定的預(yù)防和治療作用。

2 GBE通過抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗肺纖維化 作用

細(xì)胞凋亡是機(jī)體細(xì)胞受到一系類刺激后，在基因的調(diào)控下所發(fā)生的一種死亡。凋亡發(fā)生時(shí)，細(xì)胞發(fā)生收縮，細(xì)胞質(zhì)及染色質(zhì)濃縮，胞膜內(nèi)陷形成凋亡小 體[10]。細(xì)胞凋亡通路包括內(nèi)源性途徑和外源性途徑：內(nèi)源性途徑最重要的環(huán)節(jié)為線粒體中釋放出來的細(xì)胞色素C；此外，線粒體還釋放ROS、凋亡誘導(dǎo)因子等相關(guān)分子，共同參與細(xì)胞凋亡。當(dāng)接受凋亡信號(hào)后，導(dǎo)致跨膜電位下降甚至喪失，最終崩解線粒體；外源性途徑中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartic acid specific protease-3,Capase-3）被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過程中必不可少的基因，當(dāng)Caspase-3被激活后，細(xì)胞凋亡則不可避免[11]。有研究證實(shí)，肺泡上皮細(xì)胞及支氣管上皮細(xì)胞的過度凋亡，阻礙正常上皮化生，成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞不斷增生，以及清除肺凋亡細(xì)胞時(shí)持續(xù)的炎性狀態(tài)導(dǎo)致清除機(jī)制障礙，這些都是造成膠原蛋白沉積的原因，在肺纖維化的形成過程中有著重要作用[12]。因此，促進(jìn)細(xì)胞凋亡對(duì)抗肺纖維化有重要意義。

艾衛(wèi)敏等[13]研究發(fā)現(xiàn)，GBE能通過增加線粒體膜電位和降低ROS水平改善細(xì)胞的線粒體功能損傷。袁風(fēng)菊等[14]研究發(fā)現(xiàn)，EGB可通過調(diào)節(jié)Caspase-3減少心肌細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮作用。GBE有保護(hù)線粒體功能，可能主要源于抗氧化作用，而GBE對(duì)肺纖維化中改善線粒體功能及調(diào)節(jié)Caspase-3需進(jìn)一研究。通過探討GBE干預(yù)肺纖維化模型大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡的變化，結(jié)果顯示GBE干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（alveolar typeⅡ cell, AT-Ⅱ細(xì)胞）凋亡率低于模型組。說明GBE可能通過抑制AT-Ⅱ細(xì)胞的過度凋亡抑制肺纖維化[15]。在體外培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，GBE可通過干預(yù)肺FB的增殖與凋亡，起到減緩和阻斷肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的作用，有利于肺纖維化恢復(fù)[16]。重度慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）常合并肺纖維化改變。筆者的前期研究中，電鏡下發(fā)現(xiàn)GBE能改善COPD大鼠的肺間質(zhì)纖維化進(jìn)展[17]。

3 GBE通過調(diào)控細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮抗肺纖維化作用

3.1 轉(zhuǎn)化生長因子-β1

轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）主要分布在支氣管上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、增生的肺泡上皮細(xì)胞（Ⅱ型）及間質(zhì)細(xì)胞，廣泛參與肺纖維化的發(fā)展，是肺纖維化形成和發(fā)展的關(guān)鍵性因子之一。其可觸發(fā)成纖維細(xì)胞向成肌細(xì)胞分化，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的遷移、增殖及向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的過度分泌，逐漸使纖維組織取代正常的肺組織，對(duì)肺功能造成不可逆的破壞[18-19]。TGF-β1能誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞-上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition, EMT），而EMT是肺纖維化的重要組成部分。此外，TGF-β1可以直接激活下游的促纖維化因子或者幾個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)促進(jìn)纖維化的發(fā)展，比如結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor, CTGF）或者TGF-β/Smad信號(hào)通路等[2，20]。丁明橋等[21]在探討GBE對(duì)肺纖維化大鼠模型血清PDGF及TGF-β1影響的研究中發(fā)現(xiàn)，GBE能有效降低血清中血小板源性生長因子（platelet derived growth factor, PDGF）和TGF-β1水平，說明降低PDGF和TGF-β1等細(xì)胞因子水平可能是GBE防治肺纖維化的機(jī)制之一。潘勇軍等[22]的研究結(jié)果顯示，糖皮質(zhì)激素聯(lián)合GBE治療后，肺纖維化患者血清TGF-β1降低，治療可阻斷肺纖維化進(jìn)程。有文獻(xiàn)稱GBE可通過抑制纖維化早期肺泡巨噬細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)和增殖期非炎癥細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)，抑制大鼠肺損傷和纖維化[23]。GBE可通過調(diào)控TGF-β1抑制肺纖維化的發(fā)展。

3.2 腫瘤壞死因子-α

腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的分化和增殖，刺激膠原蛋白合成，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，從而加速肺纖維化進(jìn)程[24]。纖維化的病理標(biāo)志是間質(zhì)性肺炎，慢性炎癥被證實(shí)是肺纖維化發(fā)展過程中的重要因素。當(dāng)肺組織發(fā)生炎癥刺激時(shí)巨噬細(xì)胞釋放TNF-α，TNF-α促使氧化物陰離子增加、促進(jìn)中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞黏附而加重炎癥反應(yīng)。多個(gè)研究表明，TNF-α不僅有促炎屬性，而且具有促纖維化等特征[25]。TNF-α在肺纖維化中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α還可促進(jìn)白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2, IL-2）、IL-6等因子生成，IL-6不僅可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，而且可引起B(yǎng)細(xì)胞前體轉(zhuǎn)化，并抑制纖維母細(xì)胞的凋亡[26]。邢彬等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，GBE聯(lián)合潑尼松可更好地抑制TNF-α及IL-10的表達(dá)從而減緩肺纖維化的進(jìn)展。GBE在早期肺泡炎階段可抑制TNF-α、IL-6的表達(dá)，在肺纖維化進(jìn)展中GBE的抑制效果優(yōu)于強(qiáng)的松[28]。因此，GBE可通過抑制TNF-α、IL-6的表達(dá)延緩肺纖維進(jìn)展。

3.3 其他細(xì)胞因子

其他細(xì)胞因子可能單獨(dú)或者與其他細(xì)胞因子聯(lián)合影響肺纖維化發(fā)展，如CTGF是一種重要的致纖維化因子。CTGF可直接調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞活性，刺激成纖維細(xì)胞增殖和分泌膠原，聯(lián)合其他細(xì)胞因子促進(jìn)成纖維細(xì)胞變成肌成纖維細(xì)胞及膠原合成，最終導(dǎo)致纖維化。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，CFGF的表達(dá)水平與纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[29]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factorκB, NF-κB）是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥、細(xì)胞凋亡和分化過程中起重要作用。其可激活TGF-β的表達(dá)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)，介導(dǎo)肺纖維化。實(shí)驗(yàn)表明，使用抑制NF-κB表達(dá)的藥物，可抑制器官纖維化的進(jìn)展[30]。血小板衍化生長因子是由血小板前體細(xì)胞產(chǎn)生的多肽生長因子，可促進(jìn)淋巴細(xì)胞因子和炎癥因子釋放，加重炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖，參與促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原，影響細(xì)胞外基質(zhì)代謝，從而參與肺纖維化形 成[31]。研究表明，GBE可抑制肺纖維化模型肺組織中的CTGF、PDGF高表達(dá)，從而抑制肺纖維化[32，21]；GBE可通過多種途徑抑制NF-κB的表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮損傷和炎癥反應(yīng)。因此推測，GBE可通過減少NF-κB的表達(dá)抑制肺纖維化發(fā)展[33]。

4 GBE通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶-9/金屬蛋白酶組織抑制劑-1系統(tǒng)平衡發(fā)揮抗肺纖維化作用

基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要一員，正常肺組織中含量較少，肺纖維化患者中MMP-9基因表達(dá)升高。MMP-9可降解細(xì)胞外基質(zhì)，改變細(xì)胞外基質(zhì)成分與間質(zhì)膠原的比例，導(dǎo)致肺損傷進(jìn)而啟動(dòng)肺纖維。早期肺纖維化中MMP-9可為成纖維細(xì)胞、炎癥細(xì)胞移行觸發(fā)肺纖維化創(chuàng)造條件。MMP-9通過多種途徑參與肺纖維化的發(fā)病過程?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（tssue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs）是由成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生的多功能分子，TIMPs反映氣道的修復(fù)過程，是氣道纖維化的標(biāo)志。TIMPs可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生及膠原合成，使細(xì)胞外基質(zhì)沉積并抑制其降解。研究發(fā)現(xiàn)，金屬蛋白酶組織抑制劑-1（tissue inhibitors of metalloproteinase-1, TIMP-1）在纖維化過程中呈較高水平并持續(xù)上升；且TIMP-1是MMP-9的天然抑制劑，能抑制MMPs活性，造成細(xì)胞外基質(zhì)沉積。在肺纖維化發(fā)展過程中，肺組織早期以炎癥損傷為主，MMP-9表達(dá)增多，MMP-9/TIMP-1比值偏高；而TIMP-1在整個(gè)肺組織損傷過程持續(xù)增多，后期MMP-9表達(dá)減少。TIMP-1抑制MMP-9對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，導(dǎo)致MMPs/TIMPs比例失衡，促進(jìn)肺纖維化發(fā)展。MMPs/TIMPs平衡在肺纖維化發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[34]。因此，通過平衡MMPs/TIMPs比例可能抑制肺纖維化發(fā)展。有實(shí)驗(yàn)表明，通過GBE治療后，大鼠肺組織中MMP-9和TIMP-1的陽性細(xì)胞表達(dá)率下降，GBE能調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1系統(tǒng)，使之趨于平衡，從而延緩或抑制肺纖維化的發(fā)生[35]。

肺纖維化的發(fā)病機(jī)制并不明確，但肺纖維化發(fā)病呈持續(xù)上升趨勢，且目前無安全有效的治療方法。因此，尋找高效且不良反應(yīng)少的藥物，對(duì)于肺纖維化患者提高生活質(zhì)量及生存率具有重要意義。銀杏葉作為我國傳統(tǒng)中藥用于治療肺部疾病已有多年歷史，GBE在肺纖維化的防治中有重要意義。GBE作為中藥有效成分安全性高且價(jià)格低廉，對(duì)于防治肺纖維化有良好的應(yīng)用前景。目前，GBE用于治療肺纖維化的臨床報(bào)道較少，且不能完全解釋GBE治療肺纖維化的作用機(jī)制。因此，需要加大科研力度及開展更多的臨床研究證明GBE對(duì)肺纖維化治療的作用，這將為肺纖維化患者帶來新的希望。