類器官模型在前列腺癌異質(zhì)性研究中的應(yīng)用

周麗桂，張永斌，師長宏

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，廣州 510000； 2.空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，西安 710032)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是全球第二大最常見的男性癌癥，在2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)[1]中報告了127萬多新病例和將近36萬死亡病例。高度異質(zhì)性是其主要特征，目前PCa臨床上的常規(guī)治療方案仍然是雄激素剝奪治療法(androgen deprivation therapy，ADT)。然而，大部分原發(fā)性PCa患者經(jīng)過一段時期的ADT治療后，會逐漸對ADT產(chǎn)生耐藥性進(jìn)而從激素依賴性前列腺癌(hormone na?ve prostate cancer，HNPC)轉(zhuǎn)化為去勢抵抗性前列腺癌(castration- resistant prostate cancer，CRPC)[2]。由于CRPC具有侵襲性和高度異質(zhì)性，致使不同PCa患者對同一治療藥物常表現(xiàn)出不同的反應(yīng)，導(dǎo)致藥物臨床試驗(yàn)的成功率大大下降。因此，盡管已經(jīng)開發(fā)出許多PCa細(xì)胞系和動物模型，但均未能充分體現(xiàn)PCa的異質(zhì)轉(zhuǎn)化特征，導(dǎo)致對其病因和發(fā)病機(jī)制的了解仍然相當(dāng)有限，迫切需要異質(zhì)性模型來概括PCa獨(dú)特的臨床表型和基因型。

人源性類器官(patient-derived organoids，PDOs)是指來源于多能干細(xì)胞或分離的器官祖細(xì)胞在體外通過三維(3D)培養(yǎng)技術(shù)分化出具有多種細(xì)胞類型，并形成與體內(nèi)器官相似的器官樣結(jié)構(gòu)[3]。2014年，Gao等[4]成功利用活檢組織標(biāo)本和循環(huán)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)出體現(xiàn)PCa特異性改變的類器官模型，推動了類器官參與PCa相關(guān)醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)展。與人源化異種移植(patient-derived xenograft，PDX)、2D細(xì)胞系培養(yǎng)等模型相比，PDOs這種體外培養(yǎng)的三維微器官模型不但簡化了動物實(shí)驗(yàn)的繁雜性，還在一定程度上還原了細(xì)胞或組織在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過程。同時它在培養(yǎng)過程中能較好的維持遺傳穩(wěn)定性，反映親代腫瘤的特征。類器官可再現(xiàn)腫瘤的異質(zhì)性并與患者原發(fā)瘤對藥物的反應(yīng)具有較高相關(guān)性的特點(diǎn)，可用于模擬并間接觀察處于不同臨床階段且具有不同特異性突變的PCa患者對各種抗腫瘤藥物的反應(yīng)，并評價其敏感性。同時，PDOs模型便于體外進(jìn)行大規(guī)模高通量藥物篩選，在PCa異質(zhì)性研究中顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢。

1 前列腺癌類器官的培養(yǎng)

1.1 前列腺癌類器官培養(yǎng)條件探索

傳統(tǒng)的PDX模型是將從病人身上得到的新鮮腫瘤組織注射到免疫缺陷小鼠體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，而PDOs模型則是將分離出的多能干細(xì)胞或器官祖細(xì)胞置于基質(zhì)膠中進(jìn)行三維培養(yǎng)。與2D細(xì)胞系培養(yǎng)相比，PDOs的培養(yǎng)方式不僅可以為腫瘤細(xì)胞或組織提供類似在腫瘤患者體內(nèi)生長、發(fā)育的環(huán)境，還可通過調(diào)整培養(yǎng)基配方中的生長因子、激素等篩選不同特異性改變的腫瘤細(xì)胞并培育為類器官。Sato等[5]首個開發(fā)出類器官通用培養(yǎng)基“ENR”：即Advanced DMEM/F12培養(yǎng)基中加入表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、Noggin及Wnt激動劑R-spondin1。在此基礎(chǔ)上，Karthaus等[6]額外添加了Alk3/4/5抑制劑A83-01、二氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)、成纖維細(xì)胞生長因子10(fibroblast growth factor-10，F(xiàn)GF10)、FGF2、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、煙酰胺及p38抑制劑SB202190用于人前列腺類器官的培養(yǎng)。其中R-spondin1、Noggin分別通過促進(jìn)Wnt信號傳導(dǎo)[7]和調(diào)節(jié)BMP信號通路[8]進(jìn)而促進(jìn)類器官細(xì)胞增生，且去除R-spondin1或Noggin會導(dǎo)致雄激素受體(androgen receptor, AR)表達(dá)的消失[6]。EGF是前列腺類器官增殖和分化所必需的生長因子，F(xiàn)GF2、FGF10和PGE2有助于促進(jìn)前列腺細(xì)胞的增殖[6,9]。A83-01可通過抑制TGF-β信號通路促進(jìn)細(xì)胞持續(xù)增殖，與SB202190協(xié)同作用有助于延長類器官的培養(yǎng)時間，煙酰胺的加入也有助于提高類器官的培養(yǎng)效率，有趣的是，A83-01、SB202190、煙酰胺均具有相同的抑制細(xì)胞分化作用[5-6]，DHT為類器官生長的非必需因子，但其有明顯提高類器官形成效率的作用且能保持前列腺類器官AR信號的完整性[6]。這些生長因子、激素等構(gòu)成了支持前列腺(癌)細(xì)胞在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中生存和長期培養(yǎng)的基本條件。由于不同亞型的PCa突變背景不同，所需要的添加物組合也相應(yīng)有所不同。有研究發(fā)現(xiàn)B27、Rho激酶抑制劑Y-27632和N-乙酰半胱氨酸可為人前列腺(癌)類器官的培養(yǎng)提供一定的支持[10]。目前前列腺(癌)類器官的培養(yǎng)條件還在不斷探索和改進(jìn)中，如Richards等[11]最新發(fā)現(xiàn)在前列腺癌上皮細(xì)胞中加入原發(fā)性前列腺基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)不僅可通過維持PCa的特異性分子標(biāo)記物AMCAR(α-methylacyl- CoA racemase，α-甲基?；?輔酶A消旋酶)的表達(dá)，提高腫瘤類器官的生存率和形成效率，還能引導(dǎo)上皮類器官分支的形成并表達(dá)調(diào)控分支的因子，如骨形成蛋白、FGF等，促進(jìn)類器官表達(dá)出與原組織相似的表型，提高了類器官對組織特征的概括能力并保持了PCa患者間的異質(zhì)性。這些研究表明前列腺(癌)類器官是在培養(yǎng)基中添加前列腺特異性生長因子培養(yǎng)出來的，可通過調(diào)整培養(yǎng)基修飾進(jìn)一步優(yōu)化類器官培養(yǎng)條件，構(gòu)建不同亞型的PCa類器官。

1.2 前列腺癌類器官模型的建立

前列腺癌類器官來源廣泛，目前已成功利用正常組織、腫瘤活檢樣本、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、PCa細(xì)胞系、前列腺癌PDXs模型等分別建立相應(yīng)的類器官模型。Karthaus等[6]利用小鼠前列腺上皮細(xì)胞和人正常前列腺標(biāo)本培育出由完全分化的CK5+基底細(xì)胞和CK8+管腔細(xì)胞組成的前列腺類器官，發(fā)現(xiàn)該類器官保留了完整的AR信號、前列腺特異性轉(zhuǎn)錄因子Nkx3.1、基底細(xì)胞標(biāo)記物p63和CK5、管腔細(xì)胞標(biāo)記物CK8的表達(dá)，同時將構(gòu)建的Pten敲除、TMPRSS2-ERG融合基因等小鼠的原組織進(jìn)行類器官培養(yǎng)后，其表型與原組織的表型一致。同時,Gao等[4]將來自轉(zhuǎn)移性PCa患者的活檢組織標(biāo)本、循環(huán)腫瘤細(xì)胞成功培育出7個概括了PCa亞型的分子多樣性的類器官，充分體現(xiàn)了PCa的臨床異質(zhì)性，包括TMPRSS2-ERG融合、ETS易位、SPOP突變、SPINK1過表達(dá)、FOXA1和PIK3R1突變、CHD1缺失、Pten缺失和AR表達(dá)等，較好保留了原發(fā)瘤的基因組特征。這表明PCa類器官能很好地重現(xiàn)PCa原發(fā)瘤組織的異質(zhì)性，為PCa研究提供了一種體現(xiàn)腫瘤患者表觀遺傳性和異質(zhì)性的體外模型。人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、C4-2B細(xì)胞及單腔上皮祖細(xì)胞也能通過類器官培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生PCa類器官[12-13]，前者為雄激素依賴模型，后者為非依賴模型，分別代表了不同的臨床特征。此外，最近報道了一種結(jié)合類器官和PDXs優(yōu)點(diǎn)的新型體外建模系統(tǒng)，這種PDX-類器官模型比單獨(dú)的PDXs模型更節(jié)省時間和成本，為類器官的建立提供了充足的組織來源。LuCaP系列是來自PCa轉(zhuǎn)移灶的外科手術(shù)標(biāo)本，包括了21種前列腺癌的PDX模型。Beshiri等[14]將來自LuCaP系列具有轉(zhuǎn)移性CRPC(metastatic CRPC，mCRPC)特征的PDX模型組織樣本進(jìn)行類器官培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其相應(yīng)的類器官模型保留了mCRPC的基因組異質(zhì)性和對AR信號的依賴性，成功建立了一個具有代表性的、臨床前PDX衍生類器官平臺，與激素依賴型PCa和非轉(zhuǎn)移性CRPC形成鮮明的對比，為mCRPC的發(fā)病機(jī)制、藥物篩選和個性化治療方案的研究提供了一個良好的遺傳學(xué)平臺。

2 前列腺癌類器官模型的應(yīng)用

2.1 前列腺癌發(fā)病機(jī)制研究

驅(qū)動前列腺癌發(fā)病和一系列臨床異質(zhì)性轉(zhuǎn)化的機(jī)制并不是很清楚，其相應(yīng)的類器官與原發(fā)組織相似度較高，并保持基因組表達(dá)的穩(wěn)定性和原代腫瘤組織的異質(zhì)性，為PCa發(fā)病機(jī)制及不同階段的臨床特征研究提供了良好模型。有研究已通過動物模型和PDX模型實(shí)驗(yàn)[15-16]證實(shí)了新生兒期暴露于雙酚A(bisphenol A，BPA)會增加成年后前列腺癌的易感性。為了檢測人胎兒前列腺是否同樣受到類似的影響，Calderon-Gierszal等[17]將人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell，hESC)定向分化為前列腺類器官，并在整個分化培養(yǎng)過程中暴露于低劑量BPA。期間對該類器官進(jìn)行前列腺上皮基因和多種前列腺標(biāo)志物檢測以驗(yàn)證前列腺的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)CK8/18、AR、p63、TMPRSS2蛋白、PSA、NKX3.1、層粘連蛋白和波形蛋白，證實(shí)了hESC可分化為具有與人類前列腺相似的結(jié)構(gòu)和功能特性的前列腺類器官，而BPA顯著提高該類器官波形蛋白、NANOG、CD49f、TROP2的表達(dá)和減少其分支的形成，證明低水平的BPA可以靶向hESC，干擾人前列腺形態(tài)，特別是前列腺干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，這表明發(fā)育中的人前列腺可能易受子宮內(nèi)BPA的干擾，由此提出暴露于低劑量BPA可能會增加人胎兒前列腺在以后生活中癌變的幾率。另外McCray等[18]利用單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)技術(shù)對人原發(fā)性前列腺類器官模型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與單層細(xì)胞培養(yǎng)相比，類器官培養(yǎng)含有更多不同中間類型的前列腺上皮細(xì)胞，并鑒定出10個細(xì)胞群，有效展現(xiàn)前列腺癌的異質(zhì)性，其中包括一種罕見的以角蛋白13(Keratin 13，KRT13)、淋巴細(xì)胞抗原6D(Lymphocyte Antigen 6D，LY6D)、LYPD3(Ly6/PLAUR domain containing3)和前列腺干細(xì)胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA)高表達(dá)為特征的前列腺干細(xì)胞群。這表明了scRNA-seq分析和PCa類器官培養(yǎng)技術(shù)的結(jié)合可更深入地了解存在于PCa模型系統(tǒng)中不同的細(xì)胞群種類，創(chuàng)建PCa細(xì)胞群圖集。此外，PCa類器官體外培養(yǎng)的易操作性也為利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)等對特定基因進(jìn)行編輯提供便利性，通過基因編輯可觀察不同基因突變對PCa發(fā)生、發(fā)展和異質(zhì)性轉(zhuǎn)化的影響。

2.2 藥物篩選和個體化治療

由于PCa類器官在保持遺傳穩(wěn)定性的同時還保持著異質(zhì)性，已成為腫瘤藥物毒性篩選、藥效評價研究和個體化治療研究的理想模型。Gao等[4]為探索CRPC衍生的類器官是否適合藥物測試，用培育出的PCa類器官對恩雜魯胺、依維莫和BKM-120進(jìn)行藥物敏感性測試，發(fā)現(xiàn)AR擴(kuò)增的MSK-PCa2細(xì)胞系對恩雜魯胺敏感而對其他藥物耐藥，同時存在PTEN缺失和PIK3R1突變的MSK-PCa2對依維莫和BKM-120均敏感，這與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，證明其對藥物敏感性的效果與臨床試驗(yàn)結(jié)果相似。另外Beshiri等[14]發(fā)現(xiàn)，BRCA2突變的PCa類器官對奧拉帕尼敏感，該結(jié)果與在BRCA2突變的CRPC患者臨床治療觀察到的反應(yīng)一致。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示運(yùn)用類器官進(jìn)行藥物篩選和個體化治療具有一定的可操作性。同時PDXs-類器官平臺結(jié)合了PDXs模型優(yōu)點(diǎn)(展現(xiàn)疾病遺傳和表型多樣性)和類器官(易于體外大規(guī)模培養(yǎng))的特點(diǎn)，可用于擴(kuò)大體外CRPC模型的數(shù)量和多樣性，同時，還為運(yùn)用高通量篩選技術(shù)在體外大規(guī)模篩選用于mCRPC的治療藥物和相應(yīng)的個體化治療方案提供可能。值得注意的是，2018年發(fā)表的一項(xiàng)關(guān)于類器官模擬轉(zhuǎn)移性胃腸道癌癥的治療反應(yīng)的研究中[19]，運(yùn)用高通量藥物篩選技術(shù)測試了類器官對靶向藥物和化療藥物的敏感性，結(jié)果表明類器官對抗腫瘤藥物具有高度敏感性和特異性，這表明PDOs模型可以高效預(yù)測個別患者的藥物反應(yīng)，針對不同的病人實(shí)現(xiàn)個體化治療。因此將不同PCa患者的新鮮腫瘤樣品制備成PCa類器官培養(yǎng)物并進(jìn)行個體化建模，通過靶向或高通量的單藥和組合藥物篩選，可進(jìn)一步指導(dǎo)精準(zhǔn)個體化治療和促進(jìn)新的抗腫瘤藥物的研發(fā)。

2.3 耐藥機(jī)制

大部分PCa患者會對藥物的治療出現(xiàn)不同程度的耐藥進(jìn)而發(fā)展為CRPC，導(dǎo)致治療難度增加，理想的PDOs模型可以動態(tài)展示CRPC的轉(zhuǎn)化?；蚪M學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，mCRPC可能存在三種耐藥機(jī)制[20]：一是基因突變(如AR、ETS、TP53和PTEN基因等突變)導(dǎo)致AR信號通路的激活[21]；二是旁路信號GR(glucocorticoid receptor，糖皮質(zhì)激素受體)通路的激活促進(jìn)GR的表達(dá)[22]；三是在治療過程中，腫瘤細(xì)胞從依賴于藥物靶標(biāo)轉(zhuǎn)換為不依賴于藥物靶標(biāo)，從而獲得耐藥性[23-24]。上述耐藥機(jī)制需要在模擬PCa表型和基因型的模型系統(tǒng)中進(jìn)行驗(yàn)證，相應(yīng)的異質(zhì)性PDOs模型需要展示各自的耐藥機(jī)制。目前雄激素敏感的PCa和CRPC類器官模型均已建立，也有通過誘導(dǎo)產(chǎn)生CRPC轉(zhuǎn)化的模型，同時利用CRISPR/Cas9或慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)對PCa類器官的特定基因進(jìn)行基因編輯操作，可使PCa類器官成為快速檢測不同特異性突變對抗腫瘤藥物影響的平臺，為研究PCa耐藥的分子機(jī)制提供支持。Pappas等[20]利用前列腺癌類器官模型發(fā)現(xiàn)p53基因的缺失不會引起對雄激素分子的抵抗，Pten基因的缺失則增加了對抗雄激素藥物的抗性，而p53和Pten的雙重缺失導(dǎo)致了對第二代抗雄激素的完全抵抗。另外，還發(fā)現(xiàn)了前列腺類器官培養(yǎng)基組成會影響藥物反應(yīng)，如EGF是小鼠和人類前列腺類器官培養(yǎng)基的組成部分，但它可以大大降低對抗雄激素的敏感性，影響PCa耐藥機(jī)制的研究。因此，類器官培養(yǎng)有助于在體外通過構(gòu)建異質(zhì)性PCa模型，并借助基因編輯技術(shù)研究特定基因?qū)Ca耐藥的影響，從而促進(jìn)一線治療藥物的改進(jìn)，或是尋找出新的治療靶點(diǎn)提高新藥研發(fā)效率。

3 展望

PCa類器官作為一種新型的體外臨床前疾病模型，具有廣闊的應(yīng)用前景。從疾病模型的角度看，PCa類器官模型不僅便于體外操作，還具有遺傳穩(wěn)定性和異質(zhì)性，可結(jié)合PDX動物模型對PCa的發(fā)病機(jī)理、藥物篩選等研究進(jìn)行多模型驗(yàn)證[25-27]。從疾病研究角度來看，PCa類器官可以在體外直觀觀察腫瘤細(xì)胞或組織的生長、發(fā)育變化以及不同突變背景對疾病發(fā)生、發(fā)展的影響，為研究PCa的異質(zhì)性轉(zhuǎn)化機(jī)制提供有效的指導(dǎo)，比如，深入了解雄激素抵抗產(chǎn)生的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點(diǎn)。從藥物篩選和個體化治療的角度看，利用不同來源的PCa樣本建立不同的原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性PCa類器官，并通過結(jié)合高通量篩選技術(shù)可批量獲得抗PCa藥物和高效預(yù)測PCa病人對不同藥物的反應(yīng)，有助于加速推動開發(fā)針對PCa異質(zhì)性特征的治療方案。從研究耐藥機(jī)制的角度看，利用CRISPR/Cas9和shRNA技術(shù)對PCa類器官進(jìn)行表達(dá)干擾操作，可以分析耐藥性基因的功能，有針對性改進(jìn)一線治療藥物或研發(fā)新的個體化藥物。

雖然PCa類器官建模已取得較多進(jìn)展，上皮性和神經(jīng)內(nèi)分泌性PCa類器官模型已被建立，但目前為止，神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的類器官培養(yǎng)方法尚未成熟，還有許多問題需要進(jìn)一步探討。為了更好的體現(xiàn)PCa的臨床異質(zhì)性，未來還需要不斷改進(jìn)培養(yǎng)條件以更好地支持不同類型前列腺癌細(xì)胞的生長，進(jìn)一步研究腫瘤微環(huán)境和成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等的作用，使PCa類器官組織結(jié)構(gòu)更好地代表體內(nèi)PCa的組成。

同時，PCa類器官依舊存在一些缺點(diǎn)。(1)總體培養(yǎng)成功率較低，限制了臨床多樣性前列腺癌模型的廣泛開發(fā)。如Gao等[3]利用轉(zhuǎn)移性前列腺癌活檢標(biāo)本培養(yǎng)連續(xù)傳代的類器官，總體成功率僅有15%～20%。(2)缺乏從雄激素依賴性到CRPC的模型，mCRPC的模型就更少。目前PCa患者材料來源有限，特別是很難獲得mCRPC患者的臨床樣本，因此建立PCa類器官生物資源庫的困難較多，造成目前可用的CRPC類器官數(shù)量很少，不能完全代表臨床疾病的異質(zhì)性，這使得類器官在PCa研究中的應(yīng)用受到限制。(3)PCa類器官建模還受到一些培養(yǎng)條件的限制，如培養(yǎng)出的PCa類器官只含有上皮細(xì)胞和(或)基質(zhì)細(xì)胞，還缺乏某些腫瘤組分，如免疫細(xì)胞、血管成分等等。目前具有免疫兼容性微環(huán)境的PCa類器官模型尚未開發(fā)，無法進(jìn)行免疫治療方面的研究。另外PCa類器官的某些培養(yǎng)基成分會影響藥理反應(yīng)，如EGF可能會影響PCa類器官對藥物的敏感性?？傊€需要對PCa類器官的培養(yǎng)條件不斷優(yōu)化，構(gòu)建更加適應(yīng)PCa不同突變背景的腫瘤微環(huán)境，進(jìn)一步提高PCa類器官培養(yǎng)的成功率，以期獲得更多不同表型和基因型的PCa類器官，特別是構(gòu)建從HNPC到CRPC直至mCRPC發(fā)生的模型，充分展示PCa臨床異質(zhì)性，構(gòu)建相應(yīng)的類器官庫。

綜上所述，類器官在PCa異質(zhì)性研究方面雖然已取得一定的進(jìn)展，但仍存在許多挑戰(zhàn)，還需要不斷進(jìn)行探索。相信隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，PCa類器官的建模體系會不斷完善，逐步形成PCa生物資源庫，最大限度展示其臨床特征，成為PCa首選的臨床前疾病模型。