常用哮喘動(dòng)物模型的建立

李泳興，鐘 鳴，王 勇，馬武華

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，廣州 510405)

哮喘是一種以氣道炎癥、氣道高反應(yīng)和氣道重塑為主要特征的慢性呼吸系統(tǒng)疾病。已有大量研究證明了各種動(dòng)物模型可以反映人類哮喘反應(yīng)的各個(gè)具體方面。一個(gè)理想的動(dòng)物模型應(yīng)該盡量能體現(xiàn)人類哮喘病理生理的主要方面，包括IgE介導(dǎo)的抗原敏感性、急性支氣管收縮、氣道阻力增加、氣道慢性炎癥、輔助型T細(xì)胞2(T helper 2 cell，Th2)細(xì)胞因子產(chǎn)生、嗜酸性粒細(xì)胞增多、晚期氣道阻塞、粘液分泌增強(qiáng)、粘液纖毛清除率降低、氣道壁重塑與平滑肌增生[1-2]。哮喘動(dòng)物模型的建立是研究哮喘發(fā)病機(jī)制和發(fā)展的基礎(chǔ)。不同動(dòng)物哮喘模型種類繁多，研究方法也多種多樣。哮喘動(dòng)物模型是了解疾病病理生理學(xué)和測試潛在藥物治療的實(shí)用工具。當(dāng)選擇了合適的動(dòng)物種類和疾病的誘導(dǎo)方法時(shí)，這些模型的結(jié)果可以應(yīng)用于哮喘患者。本文綜述了建立哮喘動(dòng)物模型時(shí)不同動(dòng)物的特點(diǎn)、使用的試劑及造模時(shí)間的研究進(jìn)展，以期幫助研究者根據(jù)研究設(shè)計(jì)選用合適的動(dòng)物、試劑和合適的實(shí)驗(yàn)周期。

1 常用哮喘動(dòng)物模型的特點(diǎn)

哮喘主要是一種人類疾病，動(dòng)物中只有貓和馬才能自發(fā)地產(chǎn)生類似的疾病[3]。大約只有1%的貓和特定喂養(yǎng)下的馬能產(chǎn)生類似于過敏性哮喘的過敏性氣道反應(yīng)，但在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中很難復(fù)制出理想動(dòng)物哮喘模型，而且這兩種動(dòng)物模型不容易用于探索疾病機(jī)制或測試新療法。鑒于自發(fā)性哮喘動(dòng)物模型的限制，因此實(shí)驗(yàn)室常用造模方法主要采取特定試劑誘導(dǎo)產(chǎn)生人類哮喘模型，常用動(dòng)物哮喘模型主要包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔等，狗、羊和靈長類動(dòng)物由于價(jià)格昂貴等原因較為少用。

1.1 小鼠

小鼠由于其遺傳背景明確、品系多、價(jià)格便宜以及容易誘發(fā)出氣道高反應(yīng)性，產(chǎn)生氣道炎癥以及黏液增多等癥狀。因此是最常使用的哮喘模型。常用品系包括BALB/c、C57BL/6和KM小鼠[4-5]等。其中由于BALB/c小鼠比其他小鼠造模成功率高而最常使用[6-8]，但近年來由于基因敲除技術(shù)的發(fā)展，C57BL/6敲基因小鼠也越來越多地用于哮喘相關(guān)研究[9-10]。目前普遍采用的標(biāo)準(zhǔn)模型是由卵清蛋白(ovalbumin, OVA)誘發(fā)。OVA誘發(fā)的小鼠模型完全由Th2型嗜酸性粒細(xì)胞驅(qū)動(dòng)，并主要為Th2高表達(dá)[3]。小鼠的氣道和肺與人類有許多解剖和生理上的差異。小鼠的遠(yuǎn)端氣道是非肺泡化支氣管，而在人類中它是呼吸性支氣管。此外，細(xì)胞的類型和位置可能有所不同。例如，基底細(xì)胞存在于人的氣管支氣管內(nèi)，但僅存在于小鼠的氣管中。另外小鼠氣道平滑肌明顯較少，對影響支氣管張力的藥物不易作出反應(yīng)。小鼠模型的一個(gè)主要缺點(diǎn)是在致敏后缺乏對過敏原的慢性反應(yīng)，在建立慢性哮喘模型時(shí)成功率較低。

1.2 大鼠

大鼠也是實(shí)驗(yàn)室常用的哮喘模型[11]。它們相對便宜，與小鼠相似，具有來源廣，價(jià)格低廉，易繁殖和飼養(yǎng)等特點(diǎn)，因此大鼠也是一種常用的哮喘動(dòng)物模型。麻醉后的大鼠由于其體積大和穩(wěn)定性高，有利于在吸入過敏原發(fā)生急性哮喘后各種生理指標(biāo)的測量[12]。另外，因其體積大，麻醉后操作或取材等相對容易，而且實(shí)驗(yàn)中各項(xiàng)指標(biāo)的檢測相對誤差小。因此，大鼠模型在支氣管哮喘和其他肺部疾病的研究中仍具有重要作用。在新藥的藥物研究中，大鼠模型仍然是必不可少的。與其他物種相比，大鼠具有特有的支氣管循環(huán)的解剖學(xué)特征，以及在遺傳學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、肺功能及價(jià)格等方面它具有更多優(yōu)勢[13]。目前常用品系大多選擇SD、 Wistar或Brown-Norway大鼠作為實(shí)驗(yàn)對象[14-15]。

1.3 豚鼠

豚鼠是最古老的過敏性氣道高反應(yīng)動(dòng)物模型之一。豚鼠容易被致敏，發(fā)生哮喘的生理、氣道解剖和對炎癥介質(zhì)的反應(yīng)等與人類更相似，可產(chǎn)生IgE依賴性的哮喘模型[16]，因此是最早選用的哮喘動(dòng)物模型。與嚙齒動(dòng)物哮喘模型相比，豚鼠對OVA較敏感，并且很容易產(chǎn)生類似哮喘癥狀和氣道阻力增加反應(yīng)。豚鼠非常適合用作研究化學(xué)刺激因子過敏反應(yīng)的模型。豚鼠也經(jīng)常用作藥物治療的篩選模型，可用于開發(fā)β受體激動(dòng)劑和皮質(zhì)類固醇等藥物[12]。

1.4 家兔

家兔是研究哮喘肺生理和病理生理的有效模型。與老鼠等較小的物種相比，其獨(dú)特的優(yōu)勢在于家兔可用于自身對照來研究慢性哮喘。此外，家兔從出生到成年都表現(xiàn)出對過敏原的敏感性，為研究過敏性疾病的危險(xiǎn)因素提供了條件。由于兔模型與人類哮喘的相似性，因此為研究新型哮喘治療藥物的療效提供了理想的依據(jù)[1]。

2 常用哮喘動(dòng)物的造模時(shí)間

2.1 BALB/c小鼠

BALB/c小鼠哮喘造模時(shí)間多種多樣，最常使用的是23 d OVA造模法[17]，5～6周齡大的小鼠，以混合1% 氫氧化鋁(Al(OH)3)的OVA第1天和第14天腹腔注射誘發(fā)致敏。在第21、22和23天，以1 mg/mL濃度的OVA的滴鼻激發(fā)。高琴琴等[18]采用第1、8、15天腹腔注射致敏，第22～28天霧化激發(fā)的方法對BALB/c小鼠造模，總用時(shí)28 d，也可成功造模。Debeuf等[19]采用OVA+AL(OH)316 d造模法，第1天和第7天腹腔注射OVA致敏，第14～16天吸入1%的OVA激發(fā)，總用時(shí)短，肺組織切片和氣道阻力等檢測顯示也可成功造模。

同時(shí)，Debeuf等[19]也采用屋塵螨(house dust mite，HDM)14 d造模法，第1天在BALB/c小鼠氣管內(nèi)吸入1 μg的HDM致敏,第6～10天鼻腔滴注10 μg HDM溶液激發(fā)，第14天處死小鼠取材，此方法用時(shí)最短。或者小鼠在第1、3和5天每天接受30 μL的HDM致敏，在第12、13和14天接受激發(fā)，也可成功造模。

Bao等[20]使用HDM總共41 d制作哮喘復(fù)發(fā)模型，在第0、7和14天，雄性BALB/c小鼠腹腔注射50 mg HDM(0.5 mg/mL)致敏，第21～23天經(jīng)鼻腔滴入25 mg HDM(2.5 mg/mL)激發(fā)，并在在第38～40天滴入25 mg HDM(2.5 mg/mL)進(jìn)行再次激發(fā)，即哮喘復(fù)發(fā)模型。

2.2 C57BL/6小鼠

C57BL/6小鼠哮喘模型制作時(shí)間與BALB/c小鼠差別不大，但造模試劑稍有不同，除了OVA以外[9]，直徑小于2.5 μm的細(xì)顆粒物(particulate matter ≤2.5 μm，PM2.5)和蟑螂過敏原等也常用于哮喘的造模。Zheng等[21]在第0天和第14天腹腔注射0.2 mL 0.4% OVA致敏，然后在第17天和第20天吸入PM2.5(3 mg/mL)再次致敏，在第21天～28天進(jìn)行霧化吸入2%的OVA溶液激發(fā)。Li等[5]聯(lián)合使用蟑螂過敏原和PM2.5，可以把造模時(shí)間縮短到14 d。

2.3 大鼠

Dong等[22]使用Wistar大鼠21 d造模方法，在第0、7和14天用1 mg OVA+20 mg Al(OH)3腹腔注射致敏。第21天氣管內(nèi)滴注1.1% OVA于200 μL生理鹽水激發(fā)，即可成功造模。

2.4 豚鼠

豚鼠可建立急性和慢性哮喘模型，急性哮喘模型建立總天數(shù)為15 d，慢性模型建立總天數(shù)為29 d。豚鼠先在第1天和第5天腹腔注射OVA+Al(OH)3致敏，然后急性哮喘模型在第15天吸入1 h 0.01% OVA激發(fā)，慢性哮喘模型在第17～29天每隔48 h先腹腔注射mepyramine 30 mg/kg 然后吸入0.1% OVA，均可成功建立哮喘模型[23]。

2.5 家兔

家兔常用于造慢性哮喘模型，在新生兔出生后24 h內(nèi)，將可溶性牛血清白蛋白(BSA)與小棒狀桿菌佐劑一起注射給新生兔。接下來的兩周每周注射一次，接下來的兩個(gè)月每兩周注射一次，總共造模時(shí)間為兩個(gè)月[1]。

3 造模試劑

3.1 卵清蛋白(ovalbumin，OVA)

最常使用的過敏原為卵清蛋白，來源于蛋清，價(jià)格便宜，有很強(qiáng)的免疫原性，是一種良好的過敏原[24-25]。國內(nèi)外研究的致敏劑量多選用20、50、100 μg濃度的 OVA 進(jìn)行致敏[7,26]。楊素明、高琴琴等[4,18]研究認(rèn)為劑量為50 μg/mL 時(shí)效果最佳。三種劑量 OVA 誘發(fā)的哮喘模型均獲成功,但綜合而言 50 μg OVA 所誘發(fā)的BALB/c 小鼠哮喘模型血清IgE、IL-4、IFN-γ含量以及肺組織病理改變更為明顯。OVA不僅對造模小鼠產(chǎn)生影響，還可對致敏后的小鼠下一代產(chǎn)生持續(xù)影響[27]。

OVA常與AL(OH)3聯(lián)合用于小鼠哮喘造模[28]，AL(OH)3作為佐劑能夠提高免疫系統(tǒng)抗原特異性Th2的免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此急性哮喘致敏時(shí)通常需要多次給予加入佐劑的過敏原。AL(OH)3是動(dòng)物接觸抗原后產(chǎn)生Th2免疫反應(yīng)的最佳選擇之一[12]。

3.2 屋塵螨(house dust mite，HDM)

HDM是一種與人類相關(guān)的無處不在的過敏原，是人類和動(dòng)物過敏性哮喘的最常見誘因之一[29-30]。HDM代謝產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，如粉塵螨蛋白酶(Derf)1起到過敏原的作用。此外，HDM含有內(nèi)毒素的革蘭氏陰性細(xì)菌，在自然腸道菌群中內(nèi)毒素會(huì)引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，被認(rèn)為是一種佐劑[31]。黃超文等[32]研究發(fā)現(xiàn)HDM和OVA 所誘導(dǎo)的哮喘小鼠產(chǎn)生的氣道炎癥以及肺泡灌洗液中以嗜酸性粒細(xì)胞為主，氣道平滑肌增生明顯，Th2炎癥因子表達(dá)增高。

3.3 血小板活性因子(platelet activating factor，PAF)

血小板活性因子(PAF)是一種脂質(zhì)介體，參與多種過敏反應(yīng)。它從多種免疫細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞)釋放，并且在特異性結(jié)合其受體后也對大多數(shù)細(xì)胞產(chǎn)生作用，成為多效介體。在炎癥介質(zhì)中只有PAF可引起氣道高反應(yīng)。PAF由于其獨(dú)有的特性，在激發(fā)豚鼠哮喘發(fā)作時(shí)可直接激發(fā)出氣道高反應(yīng)而不需要致敏過程，它可引發(fā)支氣管收縮、嗜酸性粒細(xì)胞和分泌物增加以及氣道微血管滲漏等變化[33]。

3.4 交鏈孢霉

交鏈孢霉是真菌來源的過敏原，它在真菌類的過敏原中比例最高，它由于破壞氣道上皮屏障功能而使哮喘患者的病情加重。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，交鏈孢霉可引起小鼠氣道阻力增加、順應(yīng)性降低、血清總IGE水平明顯升高、BALF中IL-4水平明顯升高以及IFN-γ水平明顯下降[34]。

3.5 臭氧O3

臭氧(O3)可用于哮喘小鼠激發(fā)過程中，雌性BALB/c小鼠在第23、25和27天OVA激發(fā)30 min后再暴露于1.0 ppm O33 h。OVA激發(fā)過程中的O3暴露促進(jìn)了哮喘的惡化。p38 MAPK和氧化應(yīng)激在臭氧加劇哮喘過程中起著關(guān)鍵作用，同時(shí)抑制這兩條途徑可顯著降低O3對哮喘發(fā)作的不利影響[35]。

3.6 呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)

呼吸道病毒感染與哮喘惡化密切相關(guān)。但是大多數(shù)人類呼吸道病毒不是小鼠的天然病原體，因此需要大劑量地接種，但RSV導(dǎo)致的小鼠模型在病理學(xué)、免疫學(xué)和疫苗生物學(xué)等機(jī)制研究中有其獨(dú)特的優(yōu)勢[36]。

在過敏性哮喘中，RSV作為引發(fā)感染的誘因，暴露于高水平的致敏過敏原可能會(huì)導(dǎo)致病情惡化。慢性哮喘模型中，接種大劑量的呼吸道合胞病毒確實(shí)會(huì)引起過度的炎癥反應(yīng)，并增強(qiáng)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的聚集[37]。李海霞等[38]研究發(fā)現(xiàn)RSA聯(lián)合OVA可誘發(fā)幼年大鼠哮喘發(fā)生，肺泡灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高，以嗜酸性粒細(xì)胞為主，肺組織病理顯示支氣管結(jié)構(gòu)紊亂，支氣管壁增厚，炎性細(xì)胞浸潤。袁麗粉等[39]通過OVA致敏并予以RSV激發(fā)建立哮喘小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)：與單獨(dú)OVA激發(fā)相比，加入RSV后在動(dòng)物模型中的病理過程與患者更相似、氣道炎癥及氣道高反應(yīng)更為明顯、病理切片中肺組織損傷加重，而且造模成功率高，方法簡單容易操作。

3.7 脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)

在哮喘模型中，小鼠經(jīng)LPS致敏后，肺組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物的表達(dá)水平顯著增加[40]。Liu等[11]通過腹腔注射LPS和吸入OVA激發(fā)建立哮喘大鼠模型。LPS常與OVA聯(lián)用作為哮喘造模的致敏或激發(fā)，可提高造模成功率。

3.8 直徑小于2.5 μm的細(xì)顆粒物(particulate matter ≤2.5 μm，PM2.5)

近年來，越來越多文獻(xiàn)常用PM2.5對C57BL/6小鼠進(jìn)行造模，PM2.5可通過抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells,Treg)的分化和促進(jìn)輔助型T細(xì)胞17(T helper 17 cell，Th17)的分化從而干擾Th17/Treg的平衡加重小鼠的哮喘[5]。另外，PM2.5還可導(dǎo)致小鼠肺嗜酸性粒細(xì)胞增多，加重過敏性哮喘和炎癥性肺病[21]。

4 結(jié)語

哮喘動(dòng)物模型可以為哮喘的發(fā)病機(jī)制和治療提供有價(jià)值的信息，建立合適哮喘動(dòng)物模型是了解哮喘病理生理學(xué)和試驗(yàn)新療法的必要前提。在設(shè)計(jì)哮喘動(dòng)物模型時(shí)，重要的是要了解各種哮喘動(dòng)物模型的特點(diǎn)、造模方法和獨(dú)特表現(xiàn)，以及了解所選動(dòng)物模型哪些方面的肺組織結(jié)構(gòu)或功能與人類哮喘相似。開發(fā)一個(gè)具有代表性的模型必須考慮到動(dòng)物生物學(xué)知識(shí)、哮喘的誘導(dǎo)方法、模型評(píng)估的結(jié)果是否與人類哮喘特征相對應(yīng)等。然而，到目前為止還沒有一個(gè)理想的模型能夠代表人類哮喘這種復(fù)雜疾病的所有特征。因此，本綜述提供了目前用來制作哮喘模型的常用動(dòng)物的特點(diǎn)、不同的造模方法及所選試劑以及造模所需的時(shí)間，有助于研究者根據(jù)研究設(shè)計(jì)選擇合適的動(dòng)物、方法和試劑，更有助于實(shí)驗(yàn)的順利開展。