內(nèi)皮型一氧化氮合酶與血栓性疾病的研究進(jìn)展

蔣慶娟應(yīng)燕萍

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,南寧 530021)

血栓性疾病是由血栓形成和血栓栓塞兩種病理過程引起的,其發(fā)病率高居各種疾病之首,且有漸增之勢,在全球人口死亡原因中位列第一[1],是當(dāng)代醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。一氧化氮(nitric oxide,NO)是由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生并釋放的內(nèi)皮依賴性舒血管因子,具有舒張血管、抑制血小板黏附聚集,防止血栓形成等作用,是保護(hù)血管壁的重要生物活性物質(zhì)[2]。NO由一氧化氮合酶(nitric oxide synthases,NOS)催化底物L(fēng)-精氨酸而生成。哺乳動物中,NOS具有3種同工酶,即神經(jīng)元型、誘導(dǎo)型和內(nèi)皮型,血液中的NO主要來源于內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthases,eNOS)[3]。有研究顯示,eNOS與血栓性疾病有密切關(guān)系,參與急性冠狀動脈綜合征、心房顫動、腦卒中、肺血栓栓塞癥和深靜脈血栓形成等血栓性疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后。近年來,有關(guān)eNOS的研究層出不窮并深入到基因和蛋白組學(xué)水平。本文主要就eNOS的結(jié)構(gòu)和生理功能,及其參與血栓性疾病的機(jī)制和研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 eNOS的結(jié)構(gòu)和特性

編碼人類eNOS的基因位于第7號染色體7q35-36上,對應(yīng)的mRNA全長為4345 bp,包括26個(gè)外顯子,25個(gè)內(nèi)含子,跨度21 kb,翻譯后可生成1203個(gè)氨基酸蛋白產(chǎn)物[4]。據(jù)報(bào)道eNOS存在基因多態(tài)性位點(diǎn),目前關(guān)于G894T(位于第7外顯子)、27 bpVNTR(位于第4內(nèi)含子)和T786C(位于啟動子區(qū)域)等位點(diǎn)的研究居多[5-6]。eNOS的確切細(xì)胞定位尚不清楚,可能存在于高爾基體,質(zhì)膜和質(zhì)膜小凹。eNOS作為一種鈣依賴性酶,它由分子量大小約為134×103的兩個(gè)相同單體組成的二聚體,eNOS只有以二聚體的形式起作用。eNOS單體具有兩個(gè)功能不同的結(jié)構(gòu)域,分別是包含催化位點(diǎn)的N端氧化酶結(jié)構(gòu)域和C端還原酶結(jié)構(gòu)域。BH4、L-精氨酸和血紅素的結(jié)合位點(diǎn)位于其N端,黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)、黃素單核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)和鈣調(diào)蛋白(calmodulin,CaM)的結(jié)合位點(diǎn)位于其C端[7]。eNOS的二聚化始于血紅素的結(jié)合,若無血紅素,eNOS酶則僅以單體形式存在,不具有活性。血紅素的結(jié)合和二聚體的形成使四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)與eNOS二聚體結(jié)合成為可能,從而形成穩(wěn)定的二聚體。

較多學(xué)者認(rèn)為,現(xiàn)有證據(jù)表明,eNOS活性受其兩個(gè)固有的屬性調(diào)控。一個(gè)生化特征是甘氨酸-2的豆蔻?；桶腚装彼?15/半胱氨酸-26的棕櫚?；?使eNOS定位于質(zhì)膜小窩,與質(zhì)膜表面標(biāo)記蛋白即小窩蛋白(CaveoliN-1,Cav-1)結(jié)合[8],通過干擾CaM結(jié)合和電子轉(zhuǎn)移至血紅素亞基而抑制eNOS活性。eNOS的另一個(gè)分子特征是在還原酶結(jié)構(gòu)域的C-末端存在大約50個(gè)氨基酸序列,這阻礙了CaM與CaM結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合[9]。eNOS的鈣依賴性表明它的活性受到Ca2+濃度的調(diào)控,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的升高時(shí),可誘導(dǎo)Ca2+/CaM復(fù)合物的形成,促進(jìn)鈣調(diào)蛋白與二聚體結(jié)合,并與Cav-1解離,激活eNOS,最終使NO生成增加。

2 eNOS的功能

2.1 舒張血管和抑制血小板聚集

eNOS是心血管功能的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)劑,能通過刺激可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylate cyclase,sGC)并增加平滑肌細(xì)胞中的環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosinc monophosphate,cGMP)來舒張所有類型的血管[10]。sGC在NO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起重要作用,是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵,也是 NO的唯一受體[11]。抑制eNOS會顯著增強(qiáng)血小板聚集的程度和持續(xù)時(shí)間,且血流剪切力可使eNOS磷酸化,促進(jìn)NO釋放,起到抑制血小板聚集的作用[7]。Moore等人[12]認(rèn)為這種功能是通過對血小板的直接作用來介導(dǎo)而非血管張力變化,但尚不清楚具體機(jī)制。血小板聚集減少除了能防止血栓形成外,還可以防止血小板衍生生長因子的釋放,對適應(yīng)慢性血流變化的血管重塑有重要意義[13]。

2.2 抑制白細(xì)胞粘附和血管炎癥

單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant proteiN-1,MCP-1)是一種炎性細(xì)胞因子,與炎癥反應(yīng)和組織損傷有關(guān),當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥或損傷時(shí)可使單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞聚集并活化[14]。研究表明,eNOS能降低MCP-1的表達(dá),并通過干擾白細(xì)胞粘附分子CD11/CD18與內(nèi)皮細(xì)胞表面結(jié)合的能力,抑制白細(xì)胞CD11/CD18的表達(dá),抑制白細(xì)胞粘附于血管壁[15]。血小板和白細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的粘附被認(rèn)為是動脈粥樣硬化發(fā)生的早期事件[16],因此推測eNOS可能有預(yù)防動脈粥樣硬化發(fā)生的作用。此外,eNOS還可預(yù)防由促炎癥細(xì)胞因子和促動脈粥樣硬化因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,從而有助于發(fā)揮抗炎癥和抗動脈粥樣硬化作用[17]。

2.3 控制血管平滑肌增殖

已顯示eNOS可抑制血管平滑肌細(xì)胞的DNA合成、有絲分裂和增殖,且這種抗增殖作用可能是由cGMP介導(dǎo)的[18]。如前所述,eNOS有抑制血小板聚集的作用,這種作用可保護(hù)平滑肌免受血小板衍生生長因子的影響,故這也阻止了動脈粥樣硬化的后續(xù)步驟,即纖維斑塊的形成。基于這些效應(yīng)的組合,eNOS衍生的NO可以被認(rèn)為是一種抗動脈粥樣硬化的原理。

2.4 激活內(nèi)皮祖細(xì)胞,刺激血管生成

eNOS在血管生成中扮演關(guān)鍵角色,介導(dǎo)血管生成因子下游信號,并受miR-92a和Sphk1/S1P信號傳導(dǎo)影響[19-20]。miR-92a上調(diào)可激活eNOS/NO信號通路受體,誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移,促進(jìn)血管生成[21]。eNOS基因敲除小鼠表現(xiàn)出血管生成受損,這與內(nèi)皮祖細(xì)胞動員的缺陷有關(guān),可見eNOS的表達(dá)影響著內(nèi)皮祖細(xì)胞的募集[22]。丹紅注射液、沙格列汀等藥物均是通過涉及eNOS信號的級聯(lián)反應(yīng),動員內(nèi)皮祖細(xì)胞以修復(fù)血管內(nèi)皮損傷[23-24]。朱艷含等[25]學(xué)者證實(shí),eNOS的磷酸化能促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的釋放,改善血管生成。

3 eNOS與血栓性疾病

3.1 急性冠狀動脈綜合征

急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)是以冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂或侵襲,繼發(fā)完全或不完全閉塞性血栓,阻塞冠狀動脈為病理基礎(chǔ)的一組臨床綜合征,包括急性ST段抬高性心肌梗死、急性非ST段抬高性心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛[26]。有研究發(fā)現(xiàn),eNOS G894T的T等位基因和T786C的C等位基因與ACS存在關(guān)聯(lián)[27],這些位點(diǎn)突變后會進(jìn)一步增加心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)[28]。eNOS敲除小鼠身上可以看到內(nèi)膜增厚,脂質(zhì)沉積增加,動脈粥樣硬化病變加速[29],在動脈粥樣硬化患者中也觀察到eNOS的 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均降低[30],斑塊破裂后會暴露在內(nèi)皮細(xì)胞下,從而激活血小板和凝血級聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致血栓形成[31]。血小板聚集、白細(xì)胞粘附、平滑肌細(xì)胞增殖均有利于動脈粥樣硬化的發(fā)展,而eNOS有抑制血小板和白細(xì)胞粘附的作用,可減少細(xì)胞凋亡,保護(hù)血管平滑肌免受血小板衍生生長因子的影響,被認(rèn)為是抗動脈粥樣硬化的原理。

3.2 腦卒中

腦卒中(stroke)具有“四高”特點(diǎn),即發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高,已成為我國首要致死、致殘病因,而在美國每4 min就有1人死于腦卒中[32-33]。2016年全球疾病負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示[34],我國缺血性腦卒中和出血性腦卒中發(fā)病率分別為276.75/10萬、126.34/10萬。目前已有多項(xiàng)報(bào)道證實(shí)eNOS基因多態(tài)性與腦卒中的發(fā)生有關(guān),G894T多態(tài)性可改變eNOS在小窩上的定位,破壞酶調(diào)節(jié)周期,使eNOS蛋白容易被分解,影響NO生成[35]。但進(jìn)一步的調(diào)查發(fā)現(xiàn),eNOS基因在不同種族間結(jié)果略有不同。一項(xiàng)臺灣的病例對照研究發(fā)現(xiàn)[36],eNOSGlu298Asp和 Cav-1的G14713A、T29107A基因多態(tài)性對腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)增加有協(xié)同作用。而eNOSG894T和T786C的位點(diǎn)突變會使韓國人易患缺血性腦卒中,但在高加索人群中T786C被認(rèn)為是保護(hù)因素[37]。另有薈萃分析表明,eNOS的4A4B基因多態(tài)性與亞洲人腦卒中有關(guān)[38]。因此,未來還需要更多不同種族的研究以驗(yàn)證eNOS基因多態(tài)性與腦卒中的關(guān)聯(lián)。

3.3 心房顫動

心房顫動(atrial fibrillation,AF,簡稱房顫)是臨床上一種常見的心律不齊,以心房快速不規(guī)則跳動為特征,血栓栓塞是其最嚴(yán)重的合并癥[39]。大量研究證實(shí),eNOS對調(diào)節(jié)心肌功能,維持心肌Ca2+穩(wěn)態(tài),松弛和可擴(kuò)張性以及防止心律不齊和異常應(yīng)激刺激非常重要。AF時(shí)可引發(fā)心房出現(xiàn)湍流,混亂的心房收縮會降低eNOS表達(dá),削弱其舒張功能,導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[40]。心房重構(gòu)是房顫的重要病理生理變化,房顫會使心肌組織eNOS mRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào),并認(rèn)為這可能是心房結(jié)構(gòu)重構(gòu),心房血栓形成的原因。在房顫豬模型中觀察到心內(nèi)膜eNOS的表達(dá)顯著減少,NO在心房組織中的生物利用度下降[41]。同樣地,在房顫患者中也發(fā)現(xiàn)與竇性心律患者相比,房顫患者的eNOS蛋白表達(dá)水平降低(P＜0.05)[42]。此外,eNOS表達(dá)上調(diào),血管 NO釋放增加還可以降血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的表達(dá)與活性,抑制血管收縮,減少房顫發(fā)生率[43]。

3.4 深靜脈血栓

深靜脈血栓(deep vein thrombosis,DVT)好發(fā)于腿部和骨盆的深靜脈,肺栓塞是其致死性并發(fā)癥之一,嚴(yán)重危害人類健康[44]。美國心臟協(xié)會的報(bào)告指出,在美國每年就有約200萬人患DVT,其中10%的患者死于肺栓塞[45]。據(jù)推測,eNOS多態(tài)性(RS1799983)與骨科手術(shù)后深靜脈血栓形成的易感性有關(guān),eNOS突變可能通過影響內(nèi)皮細(xì)胞中NO的產(chǎn)生和血管穩(wěn)態(tài)而參與 DVT的發(fā)展[46]。RS1799983位于編碼區(qū)的c.894,c.894G/T分別對應(yīng)eNOS蛋白298位的谷氨酸和天冬氨酸。與谷氨酸相比,天冬氨酸的eNOS蛋白不穩(wěn)定。因此,T等位基因會導(dǎo)致eNOS蛋白功能降低,進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞NO合成減少,最終增加DVT的風(fēng)險(xiǎn)。Zhao等人[47]對涉及8808例受試者的17項(xiàng)研究進(jìn)行Meta分析,其結(jié)果提示eNOSG894T多態(tài)性與亞洲人群發(fā)生DVT有密切聯(lián)系。DVT患者eNOS較正常組患者在血清中的表達(dá)下調(diào),被認(rèn)為是與DVT形成相關(guān)的候選蛋白[48]。另有動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[49],經(jīng)NO微泡靜脈注射治療后大鼠DVT的重量與長度明顯減少?？梢?體內(nèi)NO水平的升高有助于DVT溶解。

4 小結(jié)與展望

綜上,大量實(shí)驗(yàn)表明eNOS參與血栓性疾病的發(fā)生發(fā)展,其具有舒張血管、抑制血小板黏附聚集,防止血栓形成等作用,是研究血栓性疾病易感性的候選基因,防治血栓性疾病的關(guān)鍵。有關(guān)eNOS與血栓性疾病發(fā)病和治療機(jī)制的深入研究具有重大理論和實(shí)際意義,相關(guān)基因可能成為治療血栓性疾病的新靶點(diǎn)。但當(dāng)前,對于eNOS多態(tài)性與血栓性疾病的研究結(jié)果因不同人群存在爭議,未來還需要更多不同種族人群的大型研究加以驗(yàn)證。