肺癌發(fā)病分子機理研究新進展：從基礎到臨床

中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心，上海 200031

肺癌是最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，嚴重威脅著人類健康。據(jù)統(tǒng)計，25%～30%癌癥導致的死亡病例都來自于肺癌，肺癌患者的5年存活率僅為20%左右［1-2］。絕大多數(shù)肺癌來源于肺上皮細胞，是由上皮細胞病變導致細胞增殖失去控制的一種疾病。肺癌嚴重時會發(fā)生轉移，侵入胸腔、肺門淋巴結及遠隔器官，如大腦、肝臟、腎等。現(xiàn)有研究表明，吸煙是肺癌的主要致病因素。近年來，由于吸煙人群的持續(xù)增長以及環(huán)境的嚴重污染，肺癌已經(jīng)成為中國發(fā)病率最高的癌癥，嚴重威脅著國民的生命健康［1］。

根據(jù)組織學差異，肺癌可分為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）兩大類。其中，NSCLC占肺癌的85%左右，可進一步分為腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌。其中最常見的類型是腺癌，通常起始于外周肺組織；其次為鱗狀細胞癌，多起始于氣管部位，在腫瘤中常見空腔和細胞凋亡［3］；大細胞癌的發(fā)生率相對較低，是一種未分化癌，細胞較大，故又稱大細胞未分化癌［3］。

SCLC，又稱為“燕麥細胞癌”，約占肺癌的15%。在組織病理學上，SCLC呈現(xiàn)細胞體積小，細胞質少，核染色質成微顆粒狀，核仁不顯著或缺失，核分裂及核異型多見等特點。由于其生長迅速、惡性程度高、侵襲能力強且極易產(chǎn)生放化療耐受等特點，SCLC是所有肺癌中致死率最高的亞型。在不給予治療的情況下，SCLC患者的平均生存期只有2～4個月［4］?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，SCLC主要起源于肺部的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞群。因此，根據(jù)其細胞起源，SCLC又被稱為肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（lung neuroendocrine carcinoma，LNEC）。

除了臨床獲取的腫瘤樣本外，動物模型也是癌癥研究必需的重要體系。對于晚期的NSCLC患者或廣泛期的SCLC患者而言，由于腫瘤轉移廣泛，手術切除通常不是首選的治療方案。因此，這類患者的樣本很難獲取，也就很難利用臨床腫瘤樣本進行科研工作。所以，建立可真實反映這些晚期肺癌發(fā)生、發(fā)展過程的動物模型顯得尤為重要。近幾十年來，一系列基因工程改造的小鼠肺癌模型已經(jīng)建立，包括NSCLC模型KrasG12D（KRAS）、KrasG12D/Trp53lox/lox（KP）和KrasG12D/Lkb1lox/lox（KL），以及SCLC模型Rb1lox/lox/Trp53lox/lox（RP）、Rb1lox/lox/Rb2lox/lox/Trp53lox/lox（RRP）和Rb1lox/lox/Trp53lox/lox/Ptenlox/lox（RPT）等。這些小鼠模型能夠比較真實地模擬臨床肺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉移等過程，大大推動了肺癌的基礎研究［5-7］。本文將從基因組學、蛋白質組學、腫瘤可塑性及腫瘤微環(huán)境等不同角度對目前肺癌研究領域的相關進展進行回顧性總結，并提出潛在的靶向治療新策略。

1 肺癌基因組學研究進展

肺癌與吸煙密切相關，是突變負荷較高的少數(shù)幾類腫瘤之一。對肺癌中相關基因變異的正確解讀，有助于人們更加深入了解這一致命疾病。全外顯子組測序結果顯示，以百萬堿基對計算，吸煙的肺癌患者有8.0～10.0個突變，而不吸煙患者僅有0.8～1.0個突變［8］。肺癌基因組的復雜性還體現(xiàn)在大量的染色體拷貝數(shù)變異與基因重排?，F(xiàn)代高通量測序技術可以準確地鑒定出基因組中單個堿基對的變異。

NSCLC 患者的基因突變包括致癌基因的激活突變和抑癌基因的失活突變［9-11］。其中，常見的致癌基因突變往往發(fā)生在大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）基因、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因、小鼠肉瘤病毒癌基因同源物B（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B，BRAF）基因、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase,catalytic subunit alpha，PIK3CA）基因、MET基因等［9-11］。抑癌基因失活突變往往發(fā)生在腫瘤蛋白53（tumor protein 53，TP53）基因、肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）基因、Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白（kelch-like ECH-associated protein，KEAP）基因、1型神經(jīng)纖維瘤抗體（neurofibromin 1，NF1）基因、視網(wǎng)膜母細胞瘤1型（retinoblastoma 1，RB1）基因、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A（cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）基因等［9-11］。此外，一些具有染色質修飾功能的基因包括SET結構域蛋白2（SET domain containing 2，SETD2）基因、AT豐富結構域1A（AT rich interactive domain 1A，ARID1A）基因、SWI/SNF相關基質關聯(lián)肌動蛋白依賴染色質調(diào)控因子亞家族4（SWI/SNF related，matrix associated，actin dependent regulator of chromatin,subfamily a，member 4，SMARCA4）基因以及RNA剪切基因RNA結合基序蛋白10（RNA binding motif protein 10，RBM10）基因和U2小核RNA輔助因子1（U2 small nuclear RNA auxiliary factor 1，U2AF1）基因等也經(jīng)常會發(fā)生突變［9-11］。致癌基因突變往往對于腫瘤細胞的存活至關重要，因此可以作為分子靶標應用于臨床靶向治療，其中最著名的例子為EGFR突變。第一代EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）通過內(nèi)源性配體競爭性結合EGFR，抑制酪氨酸激酶的活化，進而阻斷EGFR信號轉導通路，包括吉非替尼（gefitinib）、厄洛替尼（erlotinib）及?？颂婺幔╥cotinib）。阿法替尼（afatinib）和達克替尼（dacomitinib）是第二代的EGFR-TKI，比一代藥物具有更加持續(xù)且廣譜的活性。然而，絕大部分肺癌患者在一代、二代EGFR-TKI治療后會產(chǎn)生耐藥，并產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥突變T790M［12］。隨后，具有高選擇性、有效對抗T790M耐藥突變的第三代EGFR-TKI應運而生，包括AZD9291（osimertinib）和CO-1686（rociletinib），為克服EGFR-TKI獲得性耐藥開啟了全新的篇章［13］。

SCLC患者較常見的突變?yōu)镽B1和TP53。超過90%的SCLC臨床樣本中存在這兩個基因共同失活［14］。通過模擬Rb1和Trp53基因的共失活，Anton Berns實驗室在2003年成功構建了SCLC小鼠模型（Rb1lox/lox/Trp53lox/lox，RP），比較真實地重現(xiàn)了臨床SCLC發(fā)生、發(fā)展及轉移的過程［7］。這些小鼠腫瘤往往會繼發(fā)產(chǎn)生與人SCLC相似的基因變異，包括10號染色體上缺失的磷酸酶-張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）基因缺失、NOTCH基因失活突變或MYCL原癌基因（MYCL proto-oncogene，L-MYC）擴增［14-15］。與此對應的，在RP小鼠中敲除抑癌因子PTEN或P130（RB2）會明顯加速腫瘤的惡性進展［15-16］。此外，Hedgehog通路的異常激活或核因子ⅠB（nuclear factor ⅠB，NFⅠB）過表達也會促進SCLC的生長或轉移［17-18］。研究還發(fā)現(xiàn)，RNA調(diào)控基因5’-3’核糖核酸外切酶（5’-3’exoribonuclease 1，XRN1）基因，編碼G蛋白偶聯(lián)受體通路分子的基因G蛋白信號轉導調(diào)節(jié)因子7（regulator of G protein signaling 7，RGS7）和甲酰肽受體1（formyl peptide receptor 1，F(xiàn)PR1），以及中心體調(diào)控基因紡錘體微管組裝因子（assembly factor for spindle microtubules，ASPM）基因和ALMS1中心體和基底相關蛋白（ALMS1 centrosome and basal body associated protein，ALMS1）基因也經(jīng)常在SCLC中發(fā)生失活突變［19］，提示這些基因也可能在SCLC的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮作用。

人類基因組計劃的完成，為癌癥基因組學研究奠定了堅實基礎。

2 蛋白質組學研究進展

在1994年，Marc Wikins首先提出了蛋白質組學（proteomics）的概念。蛋白質組學是以蛋白質為研究對象，系統(tǒng)地研究細胞、組織或生物體中所有蛋白質的組成及其變化規(guī)律的科學。近年來，蛋白質組技術在臨床腫瘤領域的應用取得飛速發(fā)展。蛋白質組學分析為我們揭示了許多基因無法識別的信息，包括蛋白質組成成分、表達水平與修飾狀態(tài)以及蛋白質之間的相互作用等。隨著蛋白質組學技術的發(fā)展，許多蛋白質分子已被建議為肺癌的分子標志物，其中一些蛋白及其相關的信號通路是已知的肺癌惡性進展的關鍵驅動因素。

肺癌的分子標志物在早期診斷中具有非常重要的作用，其準確率和靈敏度決定臨床診斷的可靠性。因此，尋找靈敏度高、特異度好的生物標志物已成為現(xiàn)階段肺癌研究的首要任務。其中，NSCLC診斷的潛在分子標志物包括：親環(huán)素A、巨噬細胞移動抑制因子、聚免疫球蛋白受體、14-3-3η、胸腺素β4、泛素、?；o酶A結合蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制劑A、細胞色素C［20-22］。SCLC診斷的潛在分子標志物包括：Coactosin樣蛋白-1、肌動蛋白γ1（actin gamma 1，ACTG1）、α-微管蛋白、層黏連蛋白B、泛素綴合酶E2、碳酸酐酶1、β-微管蛋白、熱激蛋白73（heat shock protein 73，HSP73）、熱激蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）、核纖層蛋白B、增殖細胞核抗原、鈣結合蛋白（S100A6）［23-25］。

目前，蛋白質組學技術已經(jīng)可以在微小癌組織和癌旁組織中找到大部分蛋白，并實現(xiàn)對磷酸化蛋白及乙?；鞍椎臋z測。通過臨床腫瘤樣本的高通量蛋白質組學和轉錄組的整合性分析，鑒定出肺癌相關的標志物，并發(fā)現(xiàn)潛在精準治療靶標，可為未來癌癥的臨床診斷和治療奠定了基礎。最近有3項研究對肺腺癌樣本進行了大規(guī)模的蛋白質組學分析。通過對103例中國人群肺腺癌樣本的整合性分析發(fā)現(xiàn)，肺腺癌可基于蛋白質組層面的分子特征分為3個亞型，并且這些亞型與臨床預后密切相關［26］，該研究還提出血液中HSP90β可以作為肺腺癌的潛在預后標志物。另外一項研究主要圍繞女性非吸煙的東亞肺癌臨床樣本展開分析，揭示了肺癌早期的臨床特征和進展中的分子標志物［27］。該研究基于蛋白質組學的分型可以區(qū)分出攜帶EGFR突變的早期患者的特征，對早期非吸煙患者的診治具有重要的臨床意義［27］。還有一項研究對110例不同人種和吸煙狀態(tài)的肺癌患者的臨床樣本和配對的癌旁組織開展了多組學整合分析［28］，揭示了拷貝數(shù)、體細胞突變等基因層面改變的下游生物學功能，并鑒定出與KRAS、EGFR及ALK相關的潛在治療靶標［28］。該研究還通過免疫分型分析揭示了LKB1及中性粒細胞脫顆粒的免疫抑制作用［28］。由此可見，包括蛋白質組學與基因組學在內(nèi)的多組學整合分析是未來疾病研究的趨勢，能幫助我們更全面地認識腫瘤，為未來肺癌的臨床精準治療提供新的思路和方向。

3 肺癌可塑性

肺癌具有高度異質性和可塑性。肺癌異質性既包括不同病理學類型肺癌之間的差異，也包括同一病灶內(nèi)部不同腫瘤細胞之間的異質性。近年的基礎和臨床研究還證實，肺癌細胞具有很強的可塑性，可在一定條件下發(fā)生表型甚至病理學類型的轉變，比如NSCLC或SCLC內(nèi)不同亞型之間的轉變，以及NSCLC與SCLC之間的相互轉變。

3.1 NSCLC可塑性

腺鱗癌是臨床上常見混合型腫瘤，占所有混合型肺癌的60%～75%［29-30］。多項研究表明，腺鱗癌混合腫瘤內(nèi)的腺癌和鱗癌部分往往具有同樣的遺傳變異［31-32］，提示表型轉變的可能性。并且，臨床上肺腺癌到肺鱗癌的表型轉變往往與患者的腫瘤耐藥相關［33-34］。小鼠肺癌模型的研究發(fā)現(xiàn)，在KRAS小鼠中敲除LKB1基因不僅顯著地加速肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展，還導致了不同類型腫瘤的產(chǎn)生，包括肺腺癌、肺鱗癌和肺腺鱗癌混合型腫瘤［35-36］。相比較而言，KRAS和KP小鼠模型則只會產(chǎn)生肺腺癌［5］。將人支氣管上皮細胞過表達激活KRAS并下調(diào)LKB1后，接種至裸小鼠皮下也會形成腺鱗癌混合型腫瘤［37］，提示LKB1在腺鱗癌轉分化（adenocarcinoma to squamous cell carcinoma transdifferentiation，AST）過程中發(fā)揮著重要作用［35-36］。機制研究進一步發(fā)現(xiàn)，LKB1的失活會抑制腺苷酸激活的蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK）-乙酰輔酶A羧化酶α（acetyl-CoA carboxylase alpha，ACC）信號軸及下游脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，F(xiàn)AO）通路的激活。這樣，腫瘤細胞就無法有效地清除因戊糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway，PPP）失調(diào)引起的ROS累積，從而導致氧化還原失衡，最終使得肺腺癌向肺腺鱗癌轉分化［38］。一些靶向細胞代謝的臨床前藥物如piperlongumine和phenformin等通過刺激ROS的異常積累來促進細胞凋亡和腫瘤的消退，而ROS的積累可能促使部分KL肺腺癌轉分化為肺鱗癌并產(chǎn)生藥物耐受。由此推測，臨床上LKB1失活的肺腺癌有可能通過轉分化為肺鱗癌來逃脫某些靶向腫瘤代謝的藥物治療。

人肺鱗癌中常見Y 染色體性別決定區(qū)（sex determining region Y-box 2，SOX2）的擴增［10］。研究發(fā)現(xiàn)，在LKB缺失的小鼠肺上皮細胞中過表達SOX2會產(chǎn)生肺腺癌，這些腺癌會表達鱗癌的標志物轉化相關蛋白63（transformation-related protein 63，Trp63）、細胞角蛋白5（cytokeratin-5，K5）和細胞角蛋白14（cytokeratin-14，K14）［39］，提示SOX2也有可能在腺鱗癌轉分化中發(fā)揮作用。另一項研究發(fā)現(xiàn)在Pten-/-/Cdhkn2ab-/-的小鼠多種肺部細胞（包括基質細胞和Ⅱ型肺泡上皮細胞等）中過表達SOX2，也可產(chǎn)生肺鱗癌，進一步證實了SOX2在腺鱗癌轉分化中的重要作用［40］。腺鱗癌轉分化在臨床樣本中也被進一步證實，約3%的鱗癌樣本同時表達肺腺癌分子標志物甲狀腺轉錄因子1（thyroid transcription factor 1，TTF1）和肺鱗癌的分子標志物TP63［41］。其他的臨床研究也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，部分肺腺癌和肺鱗癌樣本中同時表達這兩種肺癌亞型的分子標志物［42］。

EGFR突變是肺腺癌中常見的突變，接近50%的亞裔患者樣本中檢測到了EGFR突變［43］。因此，針對EGFR突變的TKI被廣泛應用于臨床。雖然第三代EGFR-TKI已被開發(fā)出來，并成功地應用于第一代和第二代藥物耐受的肺腺癌患者的臨床治療，部分患者仍然不可避免地出現(xiàn)繼發(fā)性突變和藥物耐受。這些肺腺癌患者在接受EGFRTKI治療后復發(fā)，再次活檢時發(fā)現(xiàn)肺鱗癌，并且這些肺鱗癌與最初診斷出的肺腺癌具有相同的EGFR突變，說明肺腺鱗癌轉分化是EGFR-TKI耐藥的潛在機制［45-47］。

小鼠模型和臨床試驗結果都證實了肺腺鱗癌轉分化的存在，并且這種轉分化往往與腺癌臨床治療后出現(xiàn)的繼發(fā)性藥物耐受相關。在未來的臨床治療中，需要充分考慮這些因素，設計更合理的治療策略，提高臨床治療效果。

3.2 NSCLC與SCLC之間的轉分化

近年來，臨床上出現(xiàn)了NSCLC患者的腫瘤轉變?yōu)镾CLC的案例［48-50］。部分EGFR突變的肺腺癌患者接受EGFR-TKI治療后復發(fā)并耐藥，再次活檢發(fā)現(xiàn)部分腫瘤表達SCLC的分子標志物，提示病理學類型的轉變。與肺腺鱗癌轉分化一樣，這種轉變也與肺腺癌的EGFR-TKI治療失敗密切相關，進一步充實了人們對于EGFR-TKI的耐藥機制的認識［51-52］。此外，臨床上還觀察到鱗癌向SCLC轉變的病例［53］。EGFR-TKI耐藥后轉變?yōu)镾CLC的臨床樣本及建立的細胞系的分析發(fā)現(xiàn)，轉變后的樣本中都出現(xiàn)了RB1基因的缺失［54］，在一定程度上闡釋了NSCLC向SCLC轉變的機制。

臨床樣本分析發(fā)現(xiàn)大約有1/3的原先認為“純”的SCLC中含有NSCLC形態(tài)特征的細胞，有些腫瘤病灶甚至完全被NSCLC樣的細胞代替［55-56］。這些轉變常見于接受放化療后的SCLC患者，提示放化療導致了肺癌細胞的表型變化。體外細胞培養(yǎng)實驗也證實了放化療對SCLC到NSCLC轉變的影響［57-58］。這些結果提示臨床上NSCLC和SCLC之間的表型轉變與藥物響應及耐藥有關，為未來更加精準的臨床治療提出新的挑戰(zhàn)。

3.3 SCLC可塑性

早期的研究將SCLC分為經(jīng)典型（classic SCLC）和變異型（variant SCLC），后者又分為化學變異和形態(tài)變異兩類［59-60］。其中，化學變異型的SCLC細胞丟失或降低了多巴脫羧酶（dopa decarboxylase，DDC）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、神經(jīng)細胞黏附分子1（neural cell adhesion molecule 1，NCAM）等神經(jīng)內(nèi)分泌標志物的表達［59-61］。形態(tài)變異型的SCLC往往會發(fā)生MYC基因的拷貝數(shù)或表達水平的增加，并且在體外細胞培養(yǎng)中貼壁生長［59］。相比而言，經(jīng)典型SCLC和化學變異型SCLC在體外細胞培養(yǎng)中都呈懸浮生長。在經(jīng)典型的SCLC細胞系H209中過表達MYC，可以使原本呈懸浮生長的緊密球體變?yōu)榫€性開放的貼壁生長模式，促進經(jīng)典型SCLC向變異型SCLC的轉變［62］。

隨著SCLC小鼠模型的深入研究，多種SCLC亞型被陸續(xù)鑒定出來。2011年的報道稱SCLC中存在神經(jīng)內(nèi)分泌型（neuroendocrine，NE）和非神經(jīng)內(nèi)分泌型（non-neuroendocrine，non-NE）兩種不同的細胞亞群［63］。NE細胞亞群通常高表達神經(jīng)內(nèi)分泌相關的分子標志，包括NCAM、突觸素（synaptophysin，SYP）和無剛毛鱗甲復合體同源物樣1（achaete-scute complex homolog-like 1，ASCL1）。Non-NE細胞亞群則表達基質細胞相關分子標志物，包括波形蛋白（vimentin）和CD44。并且，non-NE亞群可以輔助NE亞群進行遠處轉移［63］。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，NOTCH信號通路的激活可以促進NE亞群向non-NE亞群的轉變，并產(chǎn)生化療抵抗［64］。這種轉變可能是由ASCL1的降解或表達抑制［65-66］，或神經(jīng)內(nèi)分泌抑制性轉錄因子（RE1 silencing transcription factor，REST）的表達上調(diào)導致的［64］。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)轉錄因子NFIB在RP小鼠SCLC中差異表達，高表達NFIB的SCLC亞群具有更強的轉移能力［17，67］。機制研究發(fā)現(xiàn)，NFIB通過增加染色質開放性上調(diào)了具有促轉移作用的神經(jīng)相關基因的表達，進而促進SCLC的轉移［68］。研究還發(fā)現(xiàn)，SCLC中CD24hiCD44loEpCAMhi的細胞亞群具有長期增殖的能力［69］。這些結果提示不同SCLC亞群具有不同的增殖及轉移能力，可能在SCLC發(fā)展的不同階段發(fā)揮特異性的功能。最近SCLC腫瘤和細胞系的大規(guī)模分析將SCLC依據(jù)關鍵轉錄因子的表達情況分為4個亞群，即ASCL1、神經(jīng)元樣細胞分化1（neuronal differentiation 1，NEUROD1）、yes相關轉錄調(diào)節(jié)因子1（yes1 associated transcriptional regulator，YAP1）、POU2F3（POU class 2 homeobox 3）亞群［70］。這4個不同的亞群可能代表著SCLC進展的不同階段，而MYC可以促進上述這4個亞群間的時序性進化［71］。

綜上所述，肺癌細胞具有高度的異質性和表型可塑性。整合生物學功能驗證、單細胞分析技術及譜系示蹤等多種手段來精確地鑒別肺癌的亞群，可以深化對肺癌發(fā)生、發(fā)展及轉移機制的理解，并為臨床治療提供更可靠的指導依據(jù)。

4 肺癌微環(huán)境

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）主要由腫瘤細胞、腫瘤周圍血管、細胞外基質、成纖維細胞、免疫細胞以及各種細胞因子和趨化因子組成。腫瘤微環(huán)境可以分成以免疫細胞為主的免疫微環(huán)境和成纖維細胞為主的非免疫微環(huán)境。腫瘤與微環(huán)境之間的關系類似于種子與土壤的關系。肺癌細胞的成功增殖并最終發(fā)生轉移，不僅僅由細胞的內(nèi)部因素決定，腫瘤微環(huán)境也發(fā)揮非常重要的作用［72］。

4.1 肺癌免疫微環(huán)境

腫瘤免疫微環(huán)境主要由浸潤到腫瘤內(nèi)的免疫細胞及其分泌的因子組成，包括T細胞、B細胞、自然殺傷（natural killer，NK）細胞、發(fā)揮抗原呈遞作用的樹突狀細胞（dendritic cell，DC）、中性粒細胞（neutrophil）、巨噬細胞（macrophage）以及骨髓來源的抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）等。流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者腫瘤組織中免疫細胞的組成復雜多樣，其中T細胞約占到一半（CD4+T細胞占26.0%，CD8+T細胞占22.0%），B細胞占16.0%，巨噬細胞占4.7%，NK細胞約占4.5%，DC約占2.1%，中性粒細胞約占8.6%［73］。單細胞測序技術的應用證實NSCLC中還存在巨噬細胞和骨髓來源的抑制性細胞［73］。在正常的生理情況下，免疫系統(tǒng)在機體中發(fā)揮重要的防御功能，但在腫瘤微環(huán)境中部分免疫細胞及其分泌因子有可能反過來促進腫瘤的惡性進展［74-75］。

肺癌的遺傳突變比例非常高，導致大量腫瘤新抗原的產(chǎn)生，這樣就會被腫瘤浸潤T細胞識別。腫瘤浸潤CD8+T淋巴細胞可以通過直接殺傷作用來抑制腫瘤的惡性發(fā)展［76］，而調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）則通過抑制機體的免疫反應來促進腫瘤的惡性進展［77］。在腫瘤微環(huán)境中，Treg通過接觸依賴或非接觸依賴的機制實現(xiàn)免疫抑制的功能：其接觸依賴性免疫抑制主要通過上調(diào)細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA-4）、程序性死亡［蛋白］-1（programmed death-1，PD-1）/程序性死亡［蛋白］配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）、LAG-3（lymphocyteactivation gene 3）、外切核酸酶CD39/73和神經(jīng)菌毛素1（neuropilin 1，NRP1）的表達來實現(xiàn)；而非接觸依賴性免疫抑制則主要是通過促進白細胞介素-2（interleukin 2，IL-2）或者免疫抑制分子白細胞介素-10（interleukin 10，IL-10）、轉化生長因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）等的分泌來實現(xiàn)［77-78］。大量研究證實，包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤微環(huán)境中Treg的累積會顯著抑制免疫反應，從而促進腫瘤的惡性進展［79-80］。

多項研究表明，肺癌樣本中的腫瘤浸潤B細胞，在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中也發(fā)揮著重要的作用。成熟B細胞的存在往往與肺腺癌患者的良好預后相關［81］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤B細胞在NSCLC中可以發(fā)揮抗原呈遞的功能，將腫瘤特異性抗原呈遞給CD4+T細胞［82］。肺癌浸潤的激活型B細胞（CD19+CD20+CD69+CD27+CD21+）可以促進效應T細胞的功能，而耗竭型B細胞（CD19+CD20+CD69+CD27-CD21-）則抑制T細胞的功能［82］。另外，調(diào)節(jié)型B細胞（regulatory B cell，Breg）會分泌調(diào)節(jié)性細胞因子IL-10、TGF-β等來抑制T細胞或自身反應性B細胞的功能［83］。臨床分析還發(fā)現(xiàn)，相對于正常對照，Breg在肺癌患者臨床樣本中的數(shù)量顯著增加［84］，提示Breg也可能發(fā)揮著重要作用。

NK細胞是人體抵抗癌細胞和病毒感染的第一道防線，可非特異性地直接殺傷腫瘤細胞。多種實體腫瘤良好的預后與這些免疫細胞的大量存在有關［85］。因此，解除NK細胞的免疫抑制或激活NK細胞成為針對NK細胞的主要治療策略。迄今為止，已經(jīng)有多種基于NK細胞功能激活的免疫治療策略正在進行臨床試驗，并顯示出較好的療效，可不同程度地延長肺癌患者的生存期［86］。此外，NK細胞治療還可顯著提高PD-1抗體（帕博麗珠單抗）的臨床療效，提高NSCLC患者的生存率［87］。值得注意的是，NK細胞治療在SCLC中也取得了較好的療效。小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，通過上調(diào)IL-15或TGF-β信號通路來激活NK細胞可以顯著抑制SCLC轉移，而且，聯(lián)合抗PD1治療可增強NK細胞治療的效果［88］，這為未來在SCLC臨床治療中進一步探索NK細胞治療的效果提供了理論依據(jù)。

DC在機體的免疫反應中發(fā)揮抗原呈遞的作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)了一群新的DC，會共表達免疫調(diào)節(jié)相關基因和DC成熟相關基因，被命名為富含免疫調(diào)節(jié)分子的成熟樹突狀細胞（mature DC enriched in immunoregulatory molecules，mregDC）［89］。這群特殊的DC可以通過上調(diào)免疫調(diào)節(jié)相關基因來抑制經(jīng)典的抗原呈遞DC細胞的功能［89］。此外，阻斷IL-4可以促進mregDC分泌IL-12，增加腫瘤浸潤的效應T細胞數(shù)量，從而實現(xiàn)對肺癌惡性進展的遏制［89］。

中性粒細胞壞死或凋亡后可以形成胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NET），由包裹著顆粒蛋白的染色質DNA細絲結構所組成，被中性粒細胞釋放來誘捕微生物并執(zhí)行其殺菌功能。有研究發(fā)現(xiàn)，癌細胞可以通過與NET-DNA結合來實現(xiàn)其遠處轉移［90］。中性粒細胞在腫瘤惡性進展及轉移中的功能與腫瘤微環(huán)境密切相關［91］。巨噬細胞可分為M1型和M2型，M1型巨噬細胞分泌促炎因子，參與抗原呈遞，具有抗腫瘤的功能［92］。然而，腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM）多為M2型，可分泌多種細胞因子支持腫瘤血管生成和侵襲，促進腫瘤的惡性進展［93-94］。

MDSC是DC、巨噬細胞和粒細胞的免疫抑制前體，主要通過干擾DC的抗原呈遞、T細胞活化和NK細胞的細胞毒性來促進腫瘤進展。一方面，MDSC通過誘導Treg的產(chǎn)生，實現(xiàn)其對T細胞活性的抑制［95-96］。另一方面，MDSC通過抑制B細胞的功能實現(xiàn)其促進腫瘤惡性進程的作用。白細胞介素7（interleukin 7，IL-7）-信號轉導和轉錄激活因子5（signal transducer and activator of transcription 5，STAT5）信號軸對于B淋巴細胞的成熟至關重要。該信號軸的破壞會導致B細胞滯留在pro-B細胞階段，不能分化成熟［96］。MDSC正是通過干擾IL7-STAT5信號軸，阻止B淋巴細胞的成熟，促進NSCLC的惡性進展［97］。

總之，肺癌微環(huán)境中的免疫細胞既可以通過清除或殺傷腫瘤細胞來抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展，也可以通過抑制機體的免疫功能來促進腫瘤惡性進展。部分腫瘤浸潤淋巴細胞組成了抑制性的免疫微環(huán)境，幫助腫瘤細胞實現(xiàn)免疫逃逸，從而促進肺癌的發(fā)生、發(fā)展。深入解析免疫細胞在肺癌發(fā)生、發(fā)展不同階段中的功能將有助于設計出更加有效的臨床免疫治療方案。

4.2 腫瘤非免疫微環(huán)境

腫瘤細胞外基質、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞等構成了腫瘤的非免疫微環(huán)境。單細胞測序技術的運用成功繪制了NSCLC腫瘤微環(huán)境的基質細胞圖譜，并進一步證實了腫瘤微環(huán)境中細胞的多樣性［98］。細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是非免疫微環(huán)境中的重要組成部分，由膠原、非膠原糖蛋白、氨基聚糖與蛋白聚糖、彈性蛋白等構成。既往的研究一直認為ECM只是一類支撐細胞的簡單物理結構，隨著研究的不斷深入，ECM被證明調(diào)控著諸多的細胞活動，包括細胞黏附、遷移、增殖和分化［99］。而且，ECM也可以被腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞、成纖維細胞等重塑，使其更有利于腫瘤轉移［100］。另外，ECM的異常纖維化會形成更加致密的物理屏障，阻止藥物進入腫瘤內(nèi)部從而導致治療失敗。

腫瘤相關的成纖維細胞（cancer-associated fibroblast，CAF）可以通過重塑微環(huán)境，形成適合腫瘤細胞的生態(tài)來促進其惡性進展。肺腺癌細胞在與表達podoplanin的CAF共培養(yǎng)后會產(chǎn)生EGFR-TKI的耐藥性［101］。肺癌微環(huán)境中CAF多種多樣，其中CD10+GPR77+的CAF通過分泌IL-6、IL-8維持肺癌腫瘤干細胞干性，從而導致腫瘤化療耐藥［102］。研究還表明，CAF可以通過干預ECM的沉積重塑腫瘤微環(huán)境來影響腫瘤侵襲及轉移［103］。此外，CAF還具有免疫調(diào)節(jié)功能，并通過調(diào)控血管生成、藥物攝取和治療反應來發(fā)揮作用［104］。這些研究結果表明，CAF在肺癌存活、轉移、耐藥及免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)等方面都發(fā)揮著重要的作用，可作為未來肺癌治療的潛在靶細胞。

腫瘤的惡性進展離不開血管提供的養(yǎng)分補給。因此，抑制腫瘤血管新生一度成為癌癥治療的熱點。大量抗腫瘤血管新生藥物陸續(xù)問世，VEGF及其下游信號通路都成為NSCLC治療的靶標，臨床試驗結果也證實了靶向腫瘤血管新生的療效［105］。然而，研究也發(fā)現(xiàn)低劑量的整聯(lián)蛋白抑制劑cilengtitde和鈣通道阻斷劑verapimil可以刺激血管新生，從而增強NSCLC化療藥物吉西他濱的遞送，最終提高該化療藥物的療效［106］。腫瘤新生血管也有可能促進化療藥物進入腫瘤內(nèi)部的效率從而提高治療效果。因此，臨床治療中是否采取促進還是抑制血管新生策略還需要更多的基礎轉化研究來提供指導。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境在肺癌免疫抑制、侵襲、轉移及耐藥等進程中發(fā)揮著重要的作用，并證實靶向腫瘤微環(huán)境能有效地抑制癌癥的惡性進展。值得注意的是，目前一些臨床治療有可能引起腫瘤微環(huán)境的重塑，例如放射治療有可能引起強烈的炎性反應，進而增加腫瘤細胞中免疫細胞的浸潤。綜合考慮腫瘤及其微環(huán)境的因素將有助于完善肺癌患者的臨床治療方案。

5 結語

迄今為止，人們在肺癌研究領域投入了大量的人力物力，也取得了前所未有的科研進展。盡管如此，目前對于肺癌發(fā)生、發(fā)展、轉移及耐藥分子機制的認知仍然十分有限。晚期肺癌患者的主要治療方法仍然局限于經(jīng)典的放化療，這些治療手段不良反應大，費用昂貴且療效不佳。因此，加強對肺癌發(fā)病分子機理的研究不僅能深化人們對該疾病的認識，而且有助于尋找在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用的關鍵分子，為肺癌治療提供新的靶標。

多組學整合分析證實肺癌在基因組和蛋白質組水平存在高度的異質性，并表現(xiàn)出高度的表型可塑性。肺癌細胞可以通過表型轉變，獲得更強的轉移能力并產(chǎn)生藥物耐受，加速腫瘤惡性進展。同時，肺癌及其微環(huán)境之間存在密切的相互作用。一方面，肺癌細胞可以直接招募非腫瘤細胞形成其特有的微環(huán)境；另一方面，腫瘤細胞還可根據(jù)自身發(fā)展需要重塑腫瘤微環(huán)境。大量研究證實，腫瘤微環(huán)境參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移及耐藥等各個階段。腫瘤微環(huán)境對于包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥臨床治療效果具有顯著的影響。同時靶向腫瘤和腫瘤微環(huán)境的聯(lián)合治療策略，有可能提高肺癌患者的臨床療效。因此，不斷加強對肺癌自身及其微環(huán)境的研究，深化對其相關分子機制的理解，將有助于為臨床治療提供可靠的理論依據(jù)，為肺癌患者帶來新的希望。