通過(guò)重構(gòu)來(lái)激活沉默的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇

關(guān)丹丹，赫衛(wèi)清

作者單位：100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所衛(wèi)健委抗生素生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

抗生素是臨床上應(yīng)用非常廣泛的一類藥物，許多感染性疾病因此得到有效控制。但是致病菌的耐藥性也越來(lái)越普遍，已經(jīng)給人類健康帶來(lái)極大挑戰(zhàn)，所以研發(fā)出新的抗感染藥物刻不容緩。現(xiàn)在已知的抗生素大部分來(lái)源于放線菌，這類菌可以產(chǎn)生大量具有抗感染、抗腫瘤和抗氧化等生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，約 40% 的臨床藥物都是來(lái)源于這些次級(jí)代謝產(chǎn)物或其衍生物。然而，在放線菌中大多數(shù)生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters，BGCs）在正常的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下無(wú)法表達(dá)，這就需要新的技術(shù)來(lái)開(kāi)發(fā)這些沉默 BGCs 的生物合成潛力。

微生物在實(shí)驗(yàn)室中的純培養(yǎng)是研究微生物的基礎(chǔ)，微生物培養(yǎng)條件的優(yōu)化是發(fā)掘微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物最基本的方法[1]。隨著生物信息學(xué)和合成生物學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)多 種激活沉默 BGCs 的方法，包括在培養(yǎng)基中添加化學(xué)誘導(dǎo)物[2]、共培養(yǎng)[3]、核糖體工程和轉(zhuǎn)錄因子激活[4-5]，還有正調(diào)控基因或者途徑特異性激活基因的過(guò)表達(dá)法[6-8]。對(duì)于難以利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的 BGCs 可以通過(guò)隨機(jī)構(gòu)建基因文庫(kù)的方法發(fā)掘次級(jí)代謝產(chǎn)物[9]。除此之外，天然產(chǎn)物生物合成途徑的異源表達(dá)在藥物發(fā)現(xiàn)中受到越來(lái)越多的關(guān)注[10-11]。雖然異源表達(dá)能繞過(guò)原有的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)激活沉默基因簇，但是由于多種原因，在異源宿主中的表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量通常較低。本文總結(jié)了利用重構(gòu)生物合成基因簇來(lái)激活沉默基因簇及提高其表達(dá)水平的方法，包括 DNA 組裝、啟動(dòng)子工程等方法。

1 DNA 組裝

DNA 組裝技術(shù)是完成人工組合生物元件和模塊化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，包括基于限制酶的組裝技術(shù)、體內(nèi)外同源重組和重疊延伸 PCR 等。在酵母和芽孢桿菌體內(nèi)的重組可以用于更復(fù)雜的 BGCs 組裝[12]。自 DNA 組裝技術(shù)發(fā)明以來(lái)，可以進(jìn)行 BGCs 中多個(gè)基因的突變、插入和缺失，從而提高次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量和獲得新的衍生物等[13]。下面從生物合成途徑的重構(gòu)和修飾兩個(gè)方面介紹在放線菌中激活沉默基因簇的最新進(jìn)展。

1.1 途徑重構(gòu)

1.1.1 “自上而下”的途徑重構(gòu) 許多微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物都是非核糖體肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase，NRPS）/聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）類型的化合物，其 BGCs 的大小可達(dá) 100 kb 以上。利用酶切連接方法往往無(wú)法直接對(duì)完整的 BGCs 進(jìn)行有效克隆，于是人們開(kāi)發(fā)了一種由 DNA 小片段組裝成大片段的重構(gòu)方法，并且稱之為“自上而下”的途徑重構(gòu)方法。埃博霉素（epothilone）是一種由 6 個(gè)基因構(gòu)成的 NRPS/PKS 類型化合物。2006年，Mutka 等[14]將前 5 個(gè)基因進(jìn)行途徑重構(gòu)，并且在大腸桿菌中產(chǎn)生了埃博霉素 C 和 D。2012年，通過(guò) DNA 組裝技術(shù)重構(gòu)了來(lái)自 Sorangium cellulosum 的全長(zhǎng)為 56 kb 的埃博霉素的 BGCs，重構(gòu)過(guò)程包括將第六個(gè)基因 epoF，引入獨(dú)特的限制性酶切位點(diǎn)、從序列中消除其他限制性酶切位點(diǎn)、進(jìn)行路徑組裝和模塊交換，最終通過(guò)異源表達(dá)產(chǎn)生埃博霉素 A 和 B[15]。Schimming 等[16]通過(guò)“重疊延伸PCR-酵母同源重組（ExRec）”方法重構(gòu)了 NRPS/PKS 類型化合物的 BGCs，在異源宿主中成功表達(dá)出兩種新型肽 ambactin 和 xenolindicin。這種由較小的 DNA 片段組裝成 BGCs 的技術(shù)已經(jīng)廣泛使用，但是對(duì)于復(fù)雜 BGCs 的組裝仍然存在很大限制。因此又開(kāi)發(fā)出一種基于 IIS 內(nèi)切核酸酶的新的 DNA 組裝策略，該策略可用于復(fù)雜的 BGCs 的組裝[17]。通過(guò)該策略，將 5 種天然的 myxochromide（A、B、C、D 和 S）的 BGCs 經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)后組裝成 30 多種不同 myxochromide 的人工 BGCs；并且通過(guò)交換來(lái)自不同 myxochromide BGC 的 NRPS 編碼基因產(chǎn)生了新的脂肽結(jié)構(gòu)。

1.1.2 其他途徑的重構(gòu)方法 克隆 BGCs 的首選方法是構(gòu)建插入大片段的基因文庫(kù)。在構(gòu)建基因文庫(kù)時(shí)，人工染色體（BAC）很難直接捕獲次級(jí)代謝產(chǎn)物完整的 BGCs，需要重組技術(shù)進(jìn)行無(wú)縫拼接和組裝才能獲得完整的 BGCs 進(jìn)行異源表達(dá)。Kallifidas 和 Brady[18]將基因文庫(kù)中較小的重疊片段進(jìn)行重組，進(jìn)而組裝成新的大型基因簇，產(chǎn)生了 3 種新的 fluostatins 類似物。為了直接克隆 BGCs，Jiang 和 Zhu[19]提出用 CRISPR/Cas9 技術(shù)精確地切割基因組 DNA，然后利用 Gibson 組裝技術(shù)將目的基因組插入載體中?；蚓庉嫾夹g(shù)雖然可以精確地切割 BGCs，但是步驟 繁瑣。為了進(jìn)一步簡(jiǎn)化 BGCs 的捕獲，Greunke 等[20]開(kāi)發(fā)了一種新的 BGCs 捕獲方法——直接克隆生物合成途徑（DiPaC），該方法主要包括長(zhǎng)片段 PCR 和 HiFi 組裝技 術(shù)。通過(guò)對(duì)其目的 BGCs 進(jìn)行設(shè)計(jì)，用最先進(jìn)的高保真 DNA 聚合酶進(jìn)行 BGCs 的長(zhǎng)片段擴(kuò)增；然后將擴(kuò)增后的DNA 長(zhǎng)片段進(jìn)行體外組裝來(lái)進(jìn)行 BGCs 的途徑重構(gòu)，進(jìn)而在異源宿主中成功激活了吩嗪類小分子化合物的生物合成。

1.2 途徑修飾

對(duì)于沉默的 BGCs 的重構(gòu)設(shè)計(jì)，需要在組裝的同時(shí)還要進(jìn)行途徑修飾，這樣才能使 BGCs 的重構(gòu)設(shè)計(jì)更加完善有效，因此在多數(shù)情況下途徑修飾也是激活沉默基因簇的重要策略。Ongley 等[21]把一種非核糖體肽的 BGC 通過(guò)同源重組技術(shù)，將誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和新的核糖體結(jié)合位點(diǎn)替代原生物合成途徑中的天然啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)區(qū)，從而在新宿主大腸桿菌中成功異源表達(dá)出 lyngbyatoxin。Coates 等[22]對(duì)不同吩嗪的 BGCs 進(jìn)行途徑重構(gòu)、組裝、合成以及路徑修飾，不僅在大腸桿菌中激活了吩嗪的 BGCs，而且產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的吩嗪化合物。

2 啟動(dòng)子工程

隨著啟動(dòng)子分析方法的日益成熟以及利用基因工程優(yōu)化啟動(dòng)子的研究進(jìn)展，可以利用人工合成的啟動(dòng)子代替基因簇中天然啟動(dòng)子從而激活沉默的 BGCs。目前可用的合成啟動(dòng)子包括組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子可將轉(zhuǎn)錄活性提高 1000 倍，從而可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄水平[23]。另外，雙向啟動(dòng)子也應(yīng)用到啟動(dòng)子工程中，它可以克服單向啟動(dòng)子在多基因共表達(dá)方面的限制，在 BGCs 中可以進(jìn)行有效基因共表達(dá)，更高效地激活沉默基因簇[24]。

2.1 利用同源重組技術(shù)替換天然啟動(dòng)子

2.1.1 Red/ET 重組 Red/ET 重組是在大腸桿菌中的一種基于 λ 噬菌體 Red 操縱子（Redα/Red-β/Redγ）和 Rac 噬菌體 RecE/RecT 系統(tǒng)介導(dǎo)的 DNA 同源重組技術(shù)。該重組技術(shù)可以進(jìn)行 DNA 大片段重組、突變以及異源表達(dá)[25]。同樣，通過(guò)替換天然啟動(dòng)子也可以激活沉默的 BGCs。Dangel 等[26]通過(guò) Red/ET 重組將四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 tcp830 替換新霉素生物合成中的天然啟動(dòng)子，同時(shí)刪除新霉素的兩個(gè)特異性正調(diào)控基因，重構(gòu)了新霉素的 BGC，為 BGC 提供了一個(gè)穩(wěn)定且易于轉(zhuǎn)錄的表達(dá)系統(tǒng)，使之在異源宿主中激活。Horbal 等[27]首先通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)來(lái)克隆目標(biāo)基因簇，然后通過(guò) Red/ET 重組用組成型啟動(dòng)子代替基因簇中的天然啟動(dòng)子，最后將重構(gòu)后的基因簇進(jìn)行異源表達(dá)。該方法明顯提高了大環(huán)肉毒霉素的產(chǎn)量。

2.1.2 轉(zhuǎn)化相關(guān)重組 轉(zhuǎn)化相關(guān)重組技術(shù)是一種基于釀酒酵母內(nèi)的重組系統(tǒng)。Shao 等[28]利用轉(zhuǎn)化相關(guān)重組技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種重構(gòu)沉默基因簇的方法。利用轉(zhuǎn)化相關(guān)重組技術(shù)將人工合成的啟動(dòng)子與生物合成途徑中的基因模塊以及輔助模塊進(jìn)行重組，然后將重構(gòu)的 BGCs 進(jìn)行異源表達(dá)，成功激活了來(lái)自 Streptomyces orinoci 的 pectinabilin 生物合成。Montiel 等[29]將合成啟動(dòng)子和 TAR 技術(shù)結(jié)合，進(jìn)行多個(gè)天然啟動(dòng)子的替換得到重構(gòu)基因簇，并且異源表達(dá)得到 lazarimides A 和 B。Luo 等[30]利用“即插即用”的合成生 物學(xué)策略激活來(lái)自 Streptomyces griseus 的沉默 BGCs。該策略通過(guò)轉(zhuǎn)化相關(guān)重組技術(shù)將 6 個(gè)組成型啟動(dòng)子插入到 BGCs 的上游，同時(shí)進(jìn)行途徑重構(gòu)組裝，最終在異源宿主中產(chǎn)生 3 個(gè)新的多環(huán)四甲酸酯大環(huán)內(nèi)酰胺（PTM）。2017年，Saha 等[31]也通過(guò)啟動(dòng)子工程和異源表達(dá)相結(jié)合激活了海洋來(lái)源鏈霉菌中的 PTM 的 BGCs，從而發(fā)現(xiàn)了 6 種新的 PTMs。

2.2 利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)插入合成型啟動(dòng)子

近期開(kāi)發(fā)出一種新的啟動(dòng)子工程策略，利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)在天然宿主中插入人工合成的啟動(dòng)子以達(dá)到重構(gòu)基因簇的目的。在鏈霉菌的不同 BGCs 中成功利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)插入了組成型啟動(dòng)子，完成天然啟動(dòng)子的替換，從而激活鏈霉菌中沉默的基因簇，并產(chǎn)生了一種五角型 II 型聚酮化合物[32]。糖多孢菌產(chǎn)生的紅霉素臨床應(yīng)用廣泛，利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)在紅霉素的 BGC 中插入雙向啟動(dòng)子來(lái)代替天然啟動(dòng)子，雙向啟動(dòng)子允許基因共表達(dá)，并且結(jié)合 CRISPRi 技術(shù)對(duì)基因簇進(jìn)行調(diào)控，提高了糖多孢菌中紅霉素的產(chǎn)量[33]。這種利用 CRISPR/Cas9 插入啟動(dòng)子的方法可以完成天然啟動(dòng)子高效準(zhǔn)確的替換，對(duì)現(xiàn)有的沉默基因簇激活方法進(jìn)行了升級(jí)，也是對(duì)同源重組法替換天然啟動(dòng)子策略的優(yōu)化，可以更好地發(fā)掘鏈霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的潛力。

2.3 mCRISTAR 和 miCRISTAR

2.3.1 mCRISTAR 目前，利用啟動(dòng)子工程重構(gòu) BGCs 最新的方法是 mCRISTAR（multiplexed-CRISPR-TAR），該技術(shù)分為兩步：首先，利用 CRISPR-Cas9 在酵母細(xì)胞中將 BGC 各啟動(dòng)子位點(diǎn)雙鏈斷裂形成線狀 DNA 片段；然后，含有 BGC 特異性同源臂的組成型啟動(dòng)子在酵母細(xì)胞中利用 TAR 與這些線性 DNA 片段進(jìn)行同源重組。這套多啟動(dòng)子插入體系為避免啟動(dòng)子間的同源重組需對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行正交設(shè)計(jì)。Kang 等[34]首次成功利用 mCRISTAR 技術(shù)替換了 Tam 基因簇中所預(yù)測(cè)的 8 個(gè)天然啟動(dòng)子，從而完成 BGCs 的重構(gòu)，激活了來(lái)自土壤宏基因組中的沉默的 Tam 基因簇。mCRISTAR 是一種簡(jiǎn)單通用的方法，可實(shí)現(xiàn) BGCs 中每個(gè)操縱子上游啟動(dòng)子的多重替換，不僅繞過(guò)操縱子天然的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，并且可以保持 BGCs 的完整轉(zhuǎn)錄，極大加快了微生物天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)的進(jìn)程。盡管如此，同時(shí)構(gòu)建具有多個(gè) sgRNA 的 CRISPR 質(zhì)粒是 mCRISTAR 過(guò)程中的主要瓶頸。Kim 等[35]采用多重質(zhì)粒的方法克服了這個(gè)障礙，命名為 mpCRISTAR（multiple plasmids-based CRISPR/Cas9 and TAR）。

2.3.2 miCRISTAR miCRISTAR（multiplex in vitro Cas9-TAR）是 Sean F. Brady 團(tuán)隊(duì)在 mCRISTAR 基礎(chǔ)上進(jìn)行的優(yōu)化新策略，與 mCRISTAR 不同的是第一步在體外進(jìn)行天然啟動(dòng)子位點(diǎn)的切割，省去了 CRISPR-Cas9 質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化，從而簡(jiǎn)化了 BGCs 重構(gòu)步驟。他們使用 miCRISTAR 同樣也激活了 Tam 基因簇。另外在放線菌的 ato 基因簇中含有 4 個(gè)預(yù)測(cè)的天然啟動(dòng)子，他們利用 miCRISTAR 在體外對(duì) 4 個(gè)天然啟動(dòng)子依次進(jìn)行切割，并且將不同組合的啟動(dòng)子位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行切割，再重構(gòu)，經(jīng)過(guò) 15 種重構(gòu)嘗試后，其中 8 種重構(gòu)基因簇產(chǎn)生了 atolypenes A 和 B[36]。從而證實(shí)了 miCRISTAR 是一種比 mCRISTAR 更簡(jiǎn)單靈活的基因簇重構(gòu)方法，也是啟動(dòng)子工程和 DNA 小片段組裝的完美結(jié)合。

3 其他重構(gòu)方法

3.1 刪除抑制子

BGCs 的沉默通常與負(fù)調(diào)控基因或者阻遏基因的表達(dá)有關(guān)，利用重組技術(shù)刪除 BGCs 中的抑制子可以將沉默基因簇激活。Yamanaka 等[37]利用轉(zhuǎn)化相關(guān)重組技術(shù)將人工構(gòu)建的 URA3 營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因替換 taromycin A 基因簇的負(fù)調(diào)控基因 tar20，然后成功實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)。Adpressa 等[38]通過(guò)突變 H3K27 甲基轉(zhuǎn)移酶基因 Kmt6，然后在突變菌株中分離出 fusaristatin A、gibepyrone A、fusarpyrones A 和 B。

3.2 轉(zhuǎn)座子突變技術(shù)

轉(zhuǎn)座子能產(chǎn)生單一位點(diǎn)的突變，且突變效率高。Mao 等[39]通過(guò)轉(zhuǎn)座子突變技術(shù)激活了來(lái)自 Burkholderia thailandensis 的沉默基因簇。

3.2 定點(diǎn)突變和隨機(jī)突變

Li 等[40]將來(lái)自 Streptomyces chatta noogensis L10 中沉默基因簇的 rpoB 基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，使基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，產(chǎn)生了一種類似古霉素的新抗生素——炭疽霉素。Guo 等[41]通過(guò)隨機(jī)突變來(lái)產(chǎn)生基因組的遺傳多樣性，激活了賈德霉素基因簇和至今無(wú)法激活的 pga 基因簇。

3.4 密碼子優(yōu)化

密碼子偏愛(ài)性的不匹配是外源基因在宿主系統(tǒng)中表達(dá)量低的主要原因之一。Chai 等[42]將微管霉素的 BGCs 進(jìn)行了重構(gòu)組裝，但是其 BGCs 中的 tubC 的起始密碼子是稀有的 TTG，為了避免重構(gòu) BGCs 在異源宿主中低效率表達(dá)，利用 Red/ET 重組技術(shù)將密碼子改為 ATG，從而在異源宿主中產(chǎn)生了微管霉素。

4 小結(jié)

通過(guò)各種合成生物學(xué)方法的不同組合對(duì)生物合成基因簇進(jìn)行重構(gòu)，從而激活沉默基因簇，這區(qū)別于其他沉默基因簇的激活方法。每一種 BGCs 的重構(gòu)方法往往不可獨(dú)立完成沉默基因簇的激活，例如途徑組裝會(huì)結(jié)合啟動(dòng)子工程，途徑重構(gòu)會(huì)伴隨著途徑修飾，需要相互配合才能更有效地激活沉 默 基 因 簇， 采 用 CRISPR/Cas9 、 mCRISTAR 和 miCRISTAR 等新技術(shù)可以極大提高 BGCs 的重構(gòu)工程的效率，可以更高效地激活沉默基因簇，獲得大量的具有活性的新次級(jí)代謝產(chǎn)物用于新抗生素的篩選，加速抗生素等新藥的研發(fā)速度。