環(huán)狀RNA最新研究進(jìn)展

李鐵軍，于勇，張孝衛(wèi)，杜雪，史世娟，黃華

作者單位：250013 山東，濟南市衛(wèi)生科技交流服務(wù)中心

環(huán)狀 RNA（circRNA）是一大類共價閉合環(huán)狀 RNA，作為競爭性內(nèi)源 RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）中的一員，參與 circRNA-miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，在生命活動和有關(guān)疾病的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。circRNA 通過外顯子、內(nèi)含子或兩者的反剪接而產(chǎn)生，形成外顯子或內(nèi)含子 circRNA。研究表明circRNA 是普遍存在的分子，超過了人類細(xì)胞中分布的相關(guān)線性 mRNA；circRNA 由于具有共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)，對 RNase R 具有抗性，比線性 mRNA 具有更穩(wěn)定的特性；circRNA 在不同物種中高度保守；circRNA 常表現(xiàn)為組織/發(fā)育階段特異性表達(dá)[1]。有關(guān) circRNA 的生物發(fā)生模式、機制、分類、生物學(xué)特點等已有眾多綜述予以總結(jié)歸納，在此不再詳述。

近兩年，circRNA 的生物學(xué)作用方面的研究增長迅速，其中關(guān)于 miRNA 海綿作用、翻譯作用的研究占了大多數(shù)。海綿作用是 circRNA 的主要作用之一，此外，最近新發(fā)現(xiàn)融合環(huán)狀 RNA（f-circRNA）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用，引發(fā)人們關(guān)注。本文對此進(jìn)行了歸納整理。

1 circRNA 的 miRNA 海綿作用

一般認(rèn)為，circRNA 的重要功能之一是通過其結(jié)合位點負(fù)調(diào)控相應(yīng)的 miRNA，從而影響其下游靶點分子，即所謂海綿作用。其中最具代表性的是人類 circRNA 小腦退化相關(guān)蛋白 1 轉(zhuǎn)錄本 (CDR1as)/ciRS-7，作為 miR-7 海綿，包含 70 多個 miR-7 結(jié)合位點，與 miR-7 結(jié)合并調(diào)控其功能，該研究首次證明 circRNA 具有 miRNA 海綿的功能。但直到 2017年，也僅有數(shù)種 circRNA 的海綿作用得到驗證。隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-seq）的發(fā)展，大量 circRNA 被發(fā)現(xiàn)，circbank 已收錄超過 14 萬種 circRNA，為 circRNA 的研究提供了有力支持。circRNA 海綿作用的研究方法成熟易行，近兩年來，有關(guān) circRNA 海綿作用的研究急劇增長，主要集中在癌癥方面，為癌癥治療提供了一種新的治療思路，并使得 circRNA 成為有希望的潛在生物標(biāo)志物。從目前的研究看，circRNA 在癌癥中的海綿作用大致可分為抑癌和促癌兩大類。近期 circRNA 海綿作用的研究如表 1 所示（circRNA 名稱從原文）。

表1 circRNA 海綿作用一覽表

續(xù)表 1

表中統(tǒng)計了 62 種 circRNA 海綿，起促癌作用的 41 種，抑癌作用的 14 種，抑制 HCV 增殖 1 種，其他作用 6 種。涉及白血病、肝癌、胃癌、骨肉瘤、膠質(zhì)瘤、卵巢癌、乳腺癌、食管癌、膀胱癌、肺腺癌、口腔癌、喉鱗癌、宮頸癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、非小細(xì)胞肺癌等 15 種癌癥。同種腫瘤可以與數(shù)種 circRNA 相關(guān)。

其中抑癌作用的 14 種 circRNA，除 3 種人工合成的外，其余 11 種均在相應(yīng)細(xì)胞系或組織中表達(dá)下調(diào)。通過上調(diào)這些 circRNA，可以有效抑制癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲。而 41 種促癌 circRNA，與非癌組織相比表達(dá)上調(diào)，其過表達(dá)與臨床嚴(yán)重程度密切相關(guān)，促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和 侵襲。

一般認(rèn)為 circRNA 海綿與對應(yīng)的 miRNA 呈負(fù)相關(guān)，并由此上調(diào)下游靶點來發(fā)揮作用。但也有研究認(rèn)為 circRNA 海綿可以與對應(yīng)的 miRNA 呈正相關(guān)。Li 等[30]在骨肉瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，Circ_ORC2 具有miR-19a 的結(jié)合位點，其表達(dá)與 miR-19a 表達(dá)呈正相關(guān)。circ_ORC2 與 miR-19a 結(jié)合，增強了 miR-19a 的表達(dá)，從而抑制下游 PTEN 的表達(dá)，激活 Akt 通路，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長和侵襲。這些發(fā)現(xiàn)豐富了circRNA 的分子調(diào)控機制。Du 等[16]的研究也認(rèn)為 Circ_ANKIB1 促進(jìn) miR-19b 的表達(dá)，抑制下游靶基因SOCS3 的表達(dá)，進(jìn)而激活 STAT3 通路，circRNAs 穩(wěn)定了 miRNA 的功能，對這一新功能的進(jìn)一步研究將為腫瘤等疾病的診斷和治療提供有意義的參考。

具有海綿作用的 circRNA 一般來自生物體自身，但也不排除來自外界的感染入侵。Qiao 等[15]首次報道 EB 病毒（EBV）編碼的環(huán)狀 RNA 可以通過海綿化 miRNAs 促進(jìn)其靶基因的上調(diào)表達(dá)，涉及與 EBV 相關(guān)的惡性腫瘤。EBV 環(huán)狀 RNA 共海綿化了 56 個 miRNA。其中 5 個 miRNA 與其靶標(biāo)之間的網(wǎng)絡(luò)包括 1414 個基因、1419 個節(jié)點和 2423 條邊。這些靶點在多種類型中富集，大多數(shù)在 EBV 感染細(xì)胞中被上調(diào)。

值得注意的是，含有 miRNA 結(jié)合位點的 circRNA，是否一定是通過抑制對應(yīng)的 miRNA 而發(fā)揮作用呢？Garikipati 等[62]研究認(rèn)為，circFndc3b 在心肌梗死后心臟中的過度表達(dá)，增加了血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)，通過 FUS/VEGF-A 軸調(diào)節(jié)心肌梗死后的心臟修復(fù)，增強新生血管，改善左心室功能，是促進(jìn)心肌梗死后心功能和重構(gòu)的潛在策略機制。該研究認(rèn)為盡管通過熒光素酶報告基因?qū)嶒?，circFndc3b 可能確實與 miR-298-5p、miR-412-3p 和 miR-93-3pm 結(jié)合，但 circFndc3b 在內(nèi)皮細(xì)胞和成心肌細(xì)胞中都不作為 miRNA 海綿來發(fā)揮作用。而且這些 miRNA 的水平在心肌梗死后的心臟中經(jīng)常升高而不是降低。

我們可以看出，同一癌癥可以由不同 circRNA 通過不同的途徑影響其發(fā)生發(fā)展，海綿作用是各種癌癥發(fā)生發(fā)展的重要機制之一。circRNA 發(fā)揮其海綿作用的機制，一方面是通過抑制或減少 miRNA 發(fā)揮作用，另一方面與 miRNA 結(jié)合后，可能通過某種反饋機制刺激，反而增加了相應(yīng) miRNA 的表達(dá)。海綿作用可能是部分 circRNA 的主要功能，但即使含有 miRNA 結(jié)合位點，也不一定通過其發(fā)揮作用。

此外，人工合成 circRNA 海綿治療癌癥或其他疾病的研究也開始了有益探索。Liu 等[4]使用 T4 RNA 連接酶 1，對線性 RNA 進(jìn)行 5'-3' 端連接實現(xiàn)環(huán)化，人工合成含有 miR-21 結(jié)合位點的 circRNA。這些人工合成的 circRNA 抑制 miR-21 對下游蛋白靶點的活性，包括腫瘤蛋白 DAXX，抑制癌細(xì)胞的增殖。Wang 等[57]設(shè)計并構(gòu)建了一個包含 miR-21 和 miR-93 結(jié)合位點的 circRNA，抑制了內(nèi)源性 miR-21 和miR-93，促進(jìn)了食管癌細(xì)胞凋亡，顯著抑 制細(xì)胞的增殖和遷移。Jost 等[5]設(shè)計的人工體外轉(zhuǎn)錄和連接的 circRNA 海綿，可以從 HCV 中分離 miRNA-122，還可以作為蛋白海綿，與隔離丙型肝炎病毒繁殖所需宿主因子的序列，甚至病毒蛋白本身結(jié)合，從而抑制 HCV 增殖。盡管如此，無論是在體外合成的 circRNA，還是潛在的基于質(zhì)粒的表達(dá)構(gòu)建物，在體內(nèi)生成人工 circRNA，都需要通過適當(dāng)?shù)膫鬟f平臺進(jìn)入細(xì)胞。如脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）和合成納米顆粒目前仍是克服 RNA 治療細(xì)胞屏障的最佳 選擇。

除了與癌癥相關(guān)疾病外，Hall 等[3]研究認(rèn)為 circ_Lrp6 是細(xì)胞內(nèi)的調(diào)節(jié)劑和 miR-145 的天然海綿，阻礙了 miR-145 介導(dǎo)的 VSMC 遷移、增殖和分化的調(diào)控，可能在血管發(fā)病機制中發(fā)揮作用。

2 circRNA 的翻譯作用

有報道稱，一些含有內(nèi)核糖體進(jìn)入位點元件（IRES）或原核核糖體結(jié)合位點的環(huán)狀 RNA 可以編碼不同于其典型對應(yīng)物的蛋白質(zhì)[1]。Yang 等[63]首次報道了 RNA 最豐富的堿基修飾 n6-甲基腺苷（m6A）促進(jìn)了circRNA 在人類細(xì)胞中蛋白翻譯的高效起始。此外，m6A 驅(qū)動的 circRNA 翻譯被發(fā)現(xiàn)是廣泛的，數(shù)百種內(nèi)源性 circRNA 具有翻譯潛力，提示 circRNA 衍生蛋白在細(xì)胞對環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用。

Xia 等[64]發(fā)現(xiàn)了一種新 AKT 轉(zhuǎn)錄本變體 Circ-AKT3。Circ-AKT3 利用重疊的啟止密碼子編碼了一種 174 個氨基酸（aa）的新蛋白 AKT3-174aa。與配對的鄰近正常腦組織相比，Circ-AKT3 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）組織中表達(dá)水平較低。AKT3-174aa 過表達(dá)降低了 GBM 細(xì)胞的增殖、耐輻射能力和體內(nèi)致瘤性，而 circ-AKT3 的下調(diào)則增強了星形細(xì)胞瘤細(xì)胞的惡性表型。AKT3-174aa 競爭性地與磷酸化的 PDK1 相互作用，減少 AKT-thr308 磷酸化，并在調(diào)節(jié) PI3K/Akt 信號強度中起負(fù)調(diào)控作用。

3 融合環(huán)狀 RNA

2016年，Guarnerio 等[65]發(fā)現(xiàn)了融合環(huán)狀 RNA（fusion circRNAs，f-circRNA）的存在。我們知道，在一些疾病中，非同源染色體可發(fā)生部分重排，從而將兩個原本分離的基因連接在一起，形成“融合基因”，并表達(dá)融合蛋白。在研究了 PML/RARα、MLL/AF9 等多個白血病染色體易位的情況后發(fā)現(xiàn)，融合基因在轉(zhuǎn)錄后剪接生成線性融合 mRNA 時，在易位的斷點區(qū)域上、下游內(nèi)含子中含有互補序列（如 alu 序列）時，可以通過反剪接形成一個或多個不同的跨越斷點區(qū)域的新環(huán)狀 RNA，即所謂 f-circRNA。而且這些 f-circRNA 是促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的原癌性 RNA，可觸發(fā)細(xì)胞增殖速度的增加并形成病灶，在體內(nèi)對白血病進(jìn)展起促進(jìn)作用，并增加了白血病的耐藥性。但 f-circM9 本身可能不足 以引發(fā)腫瘤發(fā)生，可能需要額外的致癌因素。此外，在 SK-NEP-1 肉瘤細(xì)胞株和 H3122 肺癌細(xì)胞株中也發(fā)現(xiàn)有 f-circRNA。此后，f-circRNA 開始引起人們的關(guān)注。

2018年，Babin 等[66]使用 CRISPR/Cas9 技術(shù)來誘導(dǎo)特定的染色體易位，證明新形成的易位可以直接表達(dá)轉(zhuǎn)錄自 NPM1-ALK 斷點的特定 f-circRNA。在 ALCL 患者的腫瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的 f-circRNA 也在不同的易位模型中被發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果表明使用 CRISPR/Cas9 誘導(dǎo)原位易位，可以獲得相關(guān)的癌癥模型，包括新生 f-circRNA 的表達(dá)。

最近，Tan 等[67-68]在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）融合基因 EML4-ALK 變體 3b(v3b) 中發(fā)現(xiàn)了兩種融合環(huán)狀 RNA：F-circEA-4a 和 F-circEA-2a。F-circEA-4a 可在 eml4-alk 陽性的 NSCLC 患者血漿中檢測到，可作為潛在的液體活檢生物標(biāo)志物。而 F-circEA-2a 雖然對細(xì)胞增殖影響不大，但促進(jìn)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，表明環(huán)狀 RNA 在 eml4-alk 陽性非小細(xì)胞肺癌中的重要作用。Wu 等[69]也證實 NSCLC 融合基因 SLC34A2-ROS1 產(chǎn)生的融合環(huán)狀 RNA F-circSRs 能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移。

從有限的研究中可以看到，f-circRNA 協(xié)同融合蛋白，在一些腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中起促進(jìn)作用。f-circRNA 是否具有普通 circRNA 的海綿吸附、翻譯等作用，或者具備普通 circRNA 不具備的特殊作用還有待進(jìn)一步探究。

4 總結(jié)

眾多研究表明，circRNA 具有 miRNA 海綿作用，與腫瘤等疾病的發(fā)展密切相關(guān)。circRNA 海綿作用的研究中，相當(dāng)一部分是基于微陣列芯片篩查的結(jié)果，找出表達(dá)升高或降低的 circRNA，然后探究這些 circRNA 對腫瘤細(xì)胞的作用。遺憾的是對同種腫瘤，不同團(tuán)隊使用不同芯片得出的結(jié)果可能完全不同，盡管這并不意味著結(jié)果的不準(zhǔn)確。且上述研究中，促癌作用全部是表達(dá)升高的 circRNA，抑癌作用全部是表達(dá)降低的 circRNA。雖然現(xiàn)有研究還未支持這種情況，但是否應(yīng)該存在這種可能：雖然表達(dá)升高，但起抑癌作用。而且一種腫瘤可以對應(yīng)數(shù)種 circRNA，它們之間是什么關(guān)系，如果同時使用幾種 circRNA 處理腫瘤，是否可以收到更好的效果？circRNA 因為閉合環(huán)狀這一結(jié)構(gòu)特點而被分為一大類，但其來源、產(chǎn)生方式、功能、體內(nèi)分布等可能完全不同，是不是應(yīng)該有更科學(xué)細(xì)致的分類，是否具有不同作用的 circRNA 應(yīng)該自成一類？這些都是 circRNA 研究中需要思考和解決的問題。