熒光染色法檢測(cè)γ-環(huán)糊精DNA殘留量方法驗(yàn)證研究

陳凌，王永智，雷高新，邱文娜，喬正，鮑麗，董達(dá)文

作者單位：225300 江蘇，泰州醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)疫苗工程中心（陳凌、王永智、雷高新、邱文娜、喬正、鮑麗）；225300 泰州，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司（董達(dá)文）

γ-環(huán)糊精（γ-cyclodextrin，γ-CD）是環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶作用于淀粉、糖原、麥芽、寡聚糖等葡萄糖聚合物后形成的，由 8 個(gè) D-吡喃葡萄糖基以 α-1,4-糖苷鍵首尾連接成的環(huán)形低聚糖[1]。由于極性羥基基團(tuán)存在，環(huán)糊精具有內(nèi)疏水外親水的特性，可通過(guò)氫鍵、疏水作用等分子間作用力與多種有機(jī)化合物形成包合物，以此增加包合物的穩(wěn)定性，改變包合物的溶解度、釋放速度、氣味等理化性質(zhì)，因此 γ-環(huán)糊精廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域[2-4]。但是 γ-環(huán)糊精生產(chǎn)過(guò)程中環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶主要從軟腐芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌等微生物中獲得，其生物安全性備受關(guān)注，特別是外源 DNA 殘留量的檢測(cè)尤為重要[5]。

《中國(guó)藥典》三部（2015 版）《外源性 DNA 殘留量測(cè)定法》收錄的 DNA 殘留量測(cè)定方法有 DNA 探針雜交法和熒光染色法[6]。熒光染色法是應(yīng)用雙鏈 DNA 熒光染料與雙鏈 DNA 特異性結(jié)合形成復(fù)合物，在波長(zhǎng) 480 nm 激發(fā)下產(chǎn)生熒光信號(hào)，可用熒光酶標(biāo)儀在波長(zhǎng) 520 nm 左右進(jìn)行檢測(cè)，在一定的 DNA 濃度范圍內(nèi)以及在該熒光染料過(guò)量的情況下，熒光強(qiáng)度與 DNA 濃度成正比，根據(jù)檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度，對(duì) DNA 進(jìn)行定量測(cè)定。該方法比起 DNA 探針雜交法，操作簡(jiǎn)單、干擾因素少、周期短，并且能定 量分析[7-8]。所以本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用熒光染料 PicoGreen 試劑，對(duì) γ-環(huán)糊精 DNA 殘留量進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行方法驗(yàn)證的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

γ-環(huán)糊精由江蘇某制藥公司提供，批號(hào)：20171005；Quant-iT? PicoGreen?dsDNA Assay Kit、含 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品（100 μg/ml）、雙鏈 DNA 熒光染料、20 × TE buffer 均購(gòu)自美國(guó) Life Technologies 公司；多功能酶標(biāo)儀 Thermo Varioskan Lux 由美國(guó) Thermo 公司生產(chǎn)；96 孔黑色酶標(biāo)板由美國(guó) Corning 公司生產(chǎn)；Denver Instrument TP-202 型電子天平由美國(guó)丹佛儀器公司生產(chǎn)；移液器由德國(guó) Eppendorf 公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 樣品配制 無(wú)菌注射用水稀釋 20 × TE buffer（1:20），γ-環(huán)糊精適量，用稀釋后的 1 × TE buffer 溶解配成 200 mg/ml 的樣品溶液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品用 1 × TE 緩沖液配成 125、25、5、1、0.2、0.04、0 μg/ml 系列濃度 DNA 標(biāo) 準(zhǔn)溶液。取 100 μl DNA 標(biāo)準(zhǔn)溶液加入 96 孔酶標(biāo)板，加入等體積 PicoGreen 染料試劑混勻，室溫靜置 5 min，用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng) 480 nm、發(fā)射波長(zhǎng) 520 nm 處測(cè)得熒光強(qiáng)度。以 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度（ng/ml）對(duì)其相應(yīng)的熒光強(qiáng)度（A）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。

1.2.3 專屬性 本實(shí)驗(yàn)所用 DNA 熒光染料對(duì) dsDNA 具有較強(qiáng)的特異性，故本實(shí)驗(yàn)中對(duì) γ-環(huán)糊精溶液的溶劑 1 × TE 緩沖液進(jìn)行了考察，按照 1.2.2 方法檢測(cè) DNA 濃度。

1.2.4 準(zhǔn)確度 γ-環(huán)糊精樣品加入 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品，制成含 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品終濃度分別為 100、50、10 ng/ml 的γ-環(huán)糊精溶液。其中，γ-環(huán)糊精溶液的終濃度為 200 mg/ml。精密吸取上述溶液各 100 μl 加入 96 孔酶標(biāo)板（n = 3），各孔加入熒光染料溶液 100 μl，按 1.2.2 方法測(cè)得的溶液 DNA 濃度（ng/ml），計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

回收率（%）=（實(shí)測(cè)加標(biāo)樣品濃度-樣品濃度）/加入對(duì)照品濃度 × 100%

1.2.5 重復(fù)性 精密吸取濃度為 50 ng/ml 的 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 100 μl 至 96 孔黑色酶標(biāo)板（n = 6），分別加入 dsDNA 熒光染料溶液 100 μl，混勻制得終濃度為 25 ng/ml的重復(fù)性測(cè)定用溶液，按照 1.2.2 方法測(cè)得的溶液 DNA 濃度，計(jì)算 RSD，考察方法的重復(fù)性。

1.2.6 耐用性 考察溶解時(shí)間對(duì)樣品 DNA 殘留量的影響，稱取 γ-環(huán)糊精樣品 200 mg，以 1 × TE 緩沖液進(jìn)行溶解配成 200 mg/ml 的樣品溶液，37 ℃ 分別放置 0、1、2、3、4、5 h 后按照 1.2.2 方法測(cè)得的溶液 DNA 濃度，計(jì)算測(cè)定結(jié)果 RSD，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 線性和靈敏度

圖1 DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線

復(fù)孔檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng) DNA 濃度為 0.04 ng/ml 時(shí)，其熒光強(qiáng)度與空白溶劑基本相當(dāng)；而當(dāng) DNA 濃度為 0.2 ng/ml 時(shí)，熒光強(qiáng)度較高，能明顯檢出，因此該法的最 低檢出限定為 0.2 ng/ml，根據(jù)繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方 程 y = 0.1792x + 0.1252，R2= 0.9999，表明該法在 0.2 ～ 125 ng/ml 范圍內(nèi)線性較好（圖 1）。

2.2 專屬性

DNA 熒光染料 PicoGreen 對(duì) dsDNA 具有較強(qiáng)的特異性，所以本實(shí)驗(yàn)中對(duì) γ-環(huán)糊精溶液的溶劑 1 × TE 緩沖液進(jìn)行了考察，按照 1.2.2 方法對(duì)其檢測(cè) DNA 濃度，計(jì)算得到 TE 溶劑平均濃度為 0.005 ng/ml（n = 6），SD 為 2.38%，表明溶劑對(duì)該法測(cè)定無(wú)干擾。

2.3 準(zhǔn)確度

γ-環(huán)糊精高、中、低 3 種不同 DNA 加標(biāo)濃度樣品 回收率在 90% ～ 110% 范圍內(nèi)（表 1），表明該法準(zhǔn)確性 良好。

2.4 重復(fù)性

6 個(gè)重復(fù)樣品檢測(cè)值之間的 RSD 為 2.32%，小于 10%（表 2），表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 耐用性

不同處理時(shí)間，樣品 DNA 殘留濃度分別為 3.05、2.98、3.25、2.75、2.84、3.05 ng/ml，RSD 為 5.95%，樣品具有良好的穩(wěn)定性（表 3）。

3 討論

關(guān)于外源性 DNA 殘留量檢測(cè)，各國(guó)藥典收錄的附錄方法不盡相同，《中國(guó)藥典》收錄了雜交法和熒光染色法，《美國(guó)藥典》收錄了定量 PCR 法，而《歐洲藥典》僅收錄了 DNA 雜交法[9]。雜交法利用固定在膜上的變性宿主細(xì)胞 DNA 與標(biāo)記酶、生物素、放射性同位素或地高辛等標(biāo)記的 DNA 序列進(jìn)行雜交[10]，其靈敏度很高，可達(dá)到 10 pg 左右，但雜交法操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，無(wú)法進(jìn)行定量分析[11]。熒光定量 PCR 法（簡(jiǎn)稱 qPCR）是近年來(lái)最受關(guān)注的 DNA 檢測(cè)方法，其原理是在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè) PCR 進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法[9]。qPCR 所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料，其中熒光探針?lè)z測(cè)下限可達(dá)到 10 fg[12]。作為 DNA 檢測(cè)的最新技術(shù)，qPCR 法操作相對(duì)簡(jiǎn)單、特異性高、靈敏度很高，相信在不久的將來(lái)會(huì)得到更廣泛的應(yīng)用。

本研究采用的熒光染色法，應(yīng)用熒光染料與雙鏈 DNA 特異性結(jié)合形成復(fù)合物，根據(jù)檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度，對(duì) DNA 進(jìn)行定量測(cè)定。此方法與 qPCR 相比，存在特異性差，靈敏度低的不足，但是本實(shí)驗(yàn)通過(guò)驗(yàn)證，該方法線性、特異性、準(zhǔn)確度、耐用性和重復(fù)性都很好，可以快速、精準(zhǔn)地定量 γ-環(huán)糊精中殘留 DNA 含量。

表1 γ-環(huán)糊精樣品加標(biāo)回收率

表2 方法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表3 樣品溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果

另外值得注意的是，雖然熒光染色法操作更簡(jiǎn)單、周期短、成本低、效益更高，但在實(shí)際的使用過(guò)程中熒光染色法容易受鹽類物質(zhì)如氯化鈉、醋酸鈉以及蛋白類物質(zhì)如白蛋白、IgG 的影響，所以不適用大劑量蛋白樣品的檢測(cè)，一般適宜用于含小劑量蛋白（如疫苗）或幾乎不含蛋白（如 γ-環(huán)糊精）制品 DNA 含量的快速檢測(cè)。