黃芪多糖抗腫瘤作用的研究進(jìn)展※

●毛倩倩 林久茂，2▲

腫瘤是威脅人類(lèi)生命健康的重大疾病之一。雖然免疫和靶向治療使當(dāng)下腫瘤治療取得了重大進(jìn)展，但仍然存在患者響應(yīng)率低、易產(chǎn)生耐藥性、副作用大等多種問(wèn)題[1，2]。而中醫(yī)藥因具有整體調(diào)節(jié)和毒副作用小等特點(diǎn)，臨床治療各類(lèi)惡性腫瘤療效顯著，備受廣大癌癥患者的青睞。傳統(tǒng)中藥黃芪具有扶正抑瘤作用，其重要活性成分黃芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）因能夠直接、間接殺傷腫瘤或協(xié)同化療發(fā)揮多重抗腫瘤活性，并且具有安全性，因而在腫瘤領(lǐng)域備受關(guān)注。黃芪多糖作為黃芪主要有效成分之一，除抗腫瘤作用外，還有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、降血糖等多種作用[3]，具有良好的應(yīng)用前景。由于黃芪多糖的抗腫瘤作用與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，而其提取、結(jié)構(gòu)表征具有復(fù)雜性，所以本文對(duì)黃芪多糖結(jié)構(gòu)表征簡(jiǎn)要概述，主要針對(duì)黃芪多糖近年來(lái)抗腫瘤方面的研究進(jìn)行綜述。

1 黃芪多糖結(jié)構(gòu)表征

黃芪多糖的提取方法種類(lèi)多，有溶劑法、酶輔助法、微生物發(fā)酵法、物理強(qiáng)化法等；純化的常用方法有Savege法、酶法、分級(jí)沉淀、層析柱法、膜分離等[4]。由于黃芪多糖提取純化手段多樣，其性質(zhì)與生物活性也有差別。結(jié)構(gòu)表征測(cè)定主要包括多糖含量測(cè)定、分子量測(cè)定、單糖組成及比例、糖鏈的連接順序、糖苷鍵的類(lèi)型以及結(jié)構(gòu)等幾個(gè)方面[3]。

多糖含量的經(jīng)典檢測(cè)方法比色法（紫外分光光度法）有兩種，分別為苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法[5]。近些年測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量最常用的方法是高效凝膠色譜法（GPC）及GPC-MALLS（多角度激光光散射）聯(lián)用法[6]。據(jù)報(bào)道[7]，黃芪多糖的分子量多集中在10000～50000Da。分子量不同的多糖，其單糖組成、比例以及糖鏈連接順序及糖苷鍵類(lèi)型也會(huì)有差異[3]。解析單糖組成及比例的技術(shù)手段主要包括高效液相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[3]。已有的研究表明[5，7-9]，黃芪多糖是由葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸等多種單糖組成的。劉衛(wèi)寶等[9]通過(guò)FT-IR、1H-NMR 分析其提取的黃芪多糖同時(shí)包含α-型吡喃糖和β-型吡喃糖。

2 抗腫瘤作用及機(jī)制

2.1 調(diào)節(jié)腫瘤免疫

2.1.1 促進(jìn)固有免疫 巨噬細(xì)胞是單核-吞噬系統(tǒng)的重要組成部分，也是固有免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵細(xì)胞。激活的巨噬細(xì)胞可以直接吞噬異物、病原體、殺死腫瘤細(xì)胞，還可以釋放細(xì)胞因子間接殺死腫瘤細(xì)胞[10]。周麗菁等[11]構(gòu)建人源型巨噬細(xì)胞THP-1-乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231 共培養(yǎng)體系，經(jīng)黃芪多糖干預(yù)后，MDA-MB-231 的增殖、遷移侵襲受到抑制，凋亡增加；并且發(fā)現(xiàn)黃芪多糖干預(yù)單獨(dú)培養(yǎng)THP-1 細(xì)胞NO、IL-1β、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子分泌水平增加。Li 等[12]研究表明黃芪多糖干預(yù)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞后的培養(yǎng)上清液對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1 具有明顯的抑制作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可以通過(guò)激活RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞的TLR4/MyD88信號(hào)通路，進(jìn)而活化其下游分子TRAF-6、NF-κB p65 和AP-1，促使巨噬細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子發(fā)揮抗腫瘤作用[13]。

此外，有研究顯示[14-15]黃芪多糖也可以增強(qiáng)白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞對(duì)NK 細(xì)胞的殺傷敏感性，其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)HL-60 細(xì)胞表面的MICA（NK細(xì)胞表面關(guān)鍵活化受體NKG2D 的配體）活化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

2.1.2 促進(jìn)適應(yīng)性免疫 樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cell，DC）是一種專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞，能攝取抗原并啟動(dòng)抗原特異性T 細(xì)胞的不同亞群，如細(xì)胞毒性T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞，這兩種T 細(xì)胞起到直接或間接殺傷腫瘤細(xì)胞作用[16]。因此，樹(shù)突狀細(xì)胞在啟動(dòng)特異性腫瘤免疫反應(yīng)時(shí)起到了關(guān)鍵作用。廖雙葉[17]研究發(fā)現(xiàn)蜜炙黃芪多糖干預(yù)過(guò)后的人肺癌細(xì)胞A549 表面的MHC 分子、Hsp-70、鈣網(wǎng)蛋白等與免疫原性死亡相關(guān)的蛋白和信號(hào)分子的表達(dá)水平升高；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到蜜炙黃芪多糖可以促進(jìn)小鼠骨髓來(lái)源DC 的成熟，提高其活化和抗原提呈能力。Pang 等[18]制備的黃芪多糖納米粒子能通過(guò)TLR活化DC，使DC表面的共刺激分子表達(dá)增加、提呈腫瘤抗原能力增強(qiáng)、促使DC高效遷移至淋巴結(jié)，以激活淋巴結(jié)處的初始T 細(xì)胞，抑制繼發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)。

Th1和Th2 是輔助性T細(xì)胞的兩種亞群，正常情況下，Th1和Th2處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，并相互制約，以維持機(jī)體正常的免疫功能。腫瘤患者體內(nèi)發(fā)生Th1 細(xì)胞受到抑制而Th2 細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的現(xiàn)象稱(chēng)為T(mén)h1/Th2 平衡漂移。荊雪寧等[19]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖誘導(dǎo)的DC疫苗能糾正S180 荷瘤小鼠的Th1/Th2 失衡，改善免疫狀態(tài)，增強(qiáng)抗腫瘤的免疫功能。

2.1.3 逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制 腫瘤及其微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞等細(xì)胞成分以及非細(xì)胞成分組成的復(fù)雜集合體[20]。正常情況下，免疫系統(tǒng)可以識(shí)別和清除突變的細(xì)胞。然而，腫瘤微環(huán)境中存在的一些免疫抑制細(xì)胞（如調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、骨髓來(lái)源抑制細(xì)胞等）以及其產(chǎn)生的能夠促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)或抑制腫瘤免疫的細(xì)胞因子限制了這種免疫監(jiān)視作用。

調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(Regulatory T cells，Tregs)是一把雙刃劍，具有調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)的作用，也能在不同病理環(huán)境下抑制免疫反應(yīng)[21]。CD 4+CD25+Foxp3+是Tregs 的經(jīng)典表面標(biāo)記組合。在腫瘤微環(huán)境中，它們能夠通過(guò)分泌IL-35、IL-10 和TGF-β 等免疫抑制分子、促進(jìn)CD8+T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞溶解、抑制T 細(xì)胞代謝、抑制DC 成熟和功能等途徑促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展[22]。左博靖[23]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可以誘導(dǎo)Tregs 細(xì)胞向免疫無(wú)能性分化，明顯下調(diào)CD4、CD25 的表達(dá)，減少細(xì)胞因子IL-10 和TGF-β 的分泌。

巨噬細(xì)胞是腫瘤基質(zhì)中最豐富的細(xì)胞，具有顯著的可塑性，可在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮多種功能。腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞通常分為經(jīng)典M1和M2（也稱(chēng)為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞）。M2 能直接影響腫瘤發(fā)展的多個(gè)步驟，包括癌細(xì)胞存活、增殖、侵襲性以及血管生成和免疫抑制；還能間接通過(guò)與腫瘤進(jìn)展相關(guān)細(xì)胞的相互作用，或者與負(fù)調(diào)節(jié)腫瘤抑制細(xì)胞來(lái)發(fā)揮這些功能[24]。研究表明黃芪多糖顯著增加了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H441和H1299的M1/M2巨噬細(xì)胞極化率，并且在非小細(xì)胞肺癌小鼠模型中異種移植瘤的生長(zhǎng)受到抑制，以及M2 數(shù)目顯著減少，呈時(shí)間依賴(lài)性[25]。

骨髓來(lái)源抑制細(xì)胞（Myeloidderived suppressor cells，MDSC）是免疫抑制腫瘤微環(huán)境的主要驅(qū)動(dòng)因素之一，其可以誘導(dǎo)Tregs 的增殖，促使巨噬細(xì)胞向M2 型巨噬細(xì)胞發(fā)展，可直接殺傷免疫效應(yīng)細(xì)胞，抑制機(jī)體免疫，使腫瘤產(chǎn)生免疫耐受現(xiàn)象[26]。柴旺[27]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖抑制了皮下黑色素瘤荷瘤小鼠脾內(nèi)的Grl+CD11b+MDSC 生成。劉素霞[28]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可以降低HLA-DR-CDl4-CD33+MDSC在外周血單個(gè)核細(xì)胞中的數(shù)量，并指出可能通過(guò)促進(jìn)MDSC 分化成熟而降低MDSC的比例。

免疫檢查點(diǎn)分子是癌細(xì)胞阻斷抗腫瘤免疫反應(yīng)的重要免疫抑制機(jī)制之一。程序性死亡受體1（programmed death 1，PD-1），可選擇性地與程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）或程序性死亡配體2（programmed death-ligand 2，PD-L2）結(jié)合，使T細(xì)胞功能失活，在誘導(dǎo)癌細(xì)胞免疫逃逸方面發(fā)揮重要作用。PD-1是M2、Tregs 中發(fā)揮作用的關(guān)鍵受體之一[29]。王潔茹等[30]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能通過(guò)下調(diào)癌細(xì)胞表面的PD-L1/PD-L2 分子、脾組織PD-1 的表達(dá)及相互作用，增強(qiáng)T 細(xì)胞抗腫瘤免疫作用抑制荷瘤小鼠皮下黑色素瘤的生長(zhǎng)。

2.2 抑制腫瘤細(xì)胞增殖宋鑫等[31]通過(guò)噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)到黃芪多糖在體外抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29 的半數(shù)致死量（IC50）為94.49μg/mL，且當(dāng)濃度小于200μg/mL 時(shí)，黃芪多糖對(duì)HT-29 細(xì)胞的抑制作用呈劑量依賴(lài)性；利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可使HT-29 細(xì)胞的周期阻滯于G1 期。卜威振等[32]通過(guò)MTT 法檢測(cè)到黃芪多糖在體外對(duì)前列腺癌細(xì)胞PC3 的增殖亦有抑制作用，并且具有時(shí)間和濃度的依賴(lài)性；臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定PC3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，黃芪多糖組的PC3的生長(zhǎng)速度存在著不同程度的減慢，并呈時(shí)間依賴(lài)性。此外，黃芪多糖對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2[33]、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y[34]等的細(xì)胞增殖均有抑制作用。由此可見(jiàn)，黃芪多糖對(duì)多種癌細(xì)胞的增殖均有抑制作用。

2.3 抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移細(xì)胞遷移在腫瘤病理發(fā)展中發(fā)揮重要作用，在此過(guò)程，蛋白酶不可或缺?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是與腫瘤轉(zhuǎn)移最密切相關(guān)的蛋白酶，MMPs能降解除多糖外幾乎全部的胞外基質(zhì)。其中MMP-2、MMP-9 是在腫瘤轉(zhuǎn)移中最直接、最重要的一類(lèi)蛋白酶，兩種酶均可降解Ⅳ型膠原。MMP-2 又可激活MMP-9、MMP-13 呈瀑布效應(yīng)，共同介導(dǎo)癌細(xì)胞侵襲[35]。王旗等[36]通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃芪多糖抑制了人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116的遷移和侵襲，并且Western blot 結(jié)果顯示MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)水平顯著降低。李超等[37]發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞RB44在黃芪多糖干預(yù)后，其遷移和侵襲能力顯著下降；相關(guān)基因蛋白MMP-2、MMP-9表達(dá)下降，但E-cadherin的表達(dá)并無(wú)明顯改變。

2.4 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡是最常見(jiàn)和研究最深入的程序性細(xì)胞死亡類(lèi)型。質(zhì)膜和膜細(xì)胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等在細(xì)胞凋亡中的作用關(guān)鍵，各種凋亡誘導(dǎo)機(jī)制之間的密切聯(lián)系，并且可以從一種途徑轉(zhuǎn)換到另一種途徑，在大多數(shù)情況下，這些途徑的結(jié)果是線粒體膜滲透和/或Caspase 激活[38]。謝榮丹等[39]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能有效抑制MDA-MB-231 乳腺癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，通過(guò)HE 染色、TUNEL 法檢測(cè)到黃芪多糖誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 凋亡程度呈劑量依賴(lài)性，并且通過(guò)Western blot 法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白、Bcl-2、Bax、Caspase-7、Caspase-9的表達(dá)水平，結(jié)果顯示Bcl-2/Bax的比值升高，Caspase-9、Caspase-7蛋白表達(dá)水平顯著升高。閻力君等[40]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖干預(yù)人結(jié)直腸癌SW620后使其Bcl-2/Bax的比值增加，Cytochrome C 以及Caspase-9、Caspase-3 的表達(dá)上升。由此可得出黃芪多糖可通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

2.5 抗血管新生和淋巴管新生在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中，由于代謝需求的增加和組織缺氧刺激，腫瘤細(xì)胞需要分泌多種促血管生成因子促使血管生成才能繼續(xù)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。其分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）被認(rèn)為是腫瘤血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)，靶向VEGF/VEGFR 信號(hào)軸已成為抗血管生成藥物發(fā)展的核心[41]。Zhao等[42]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能有效抑制小鼠Lewis肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，抑制其腫瘤組織中血管生成、VEGF 和表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）的蛋白表達(dá)，并具有濃度-效應(yīng)關(guān)系，提示APS可能通過(guò)降低VEGF 和EGFR 的表達(dá)，發(fā)揮抑制腫瘤作用。此外，鐵寶霞[43]研究顯示黃芪多糖能下調(diào)人結(jié)腸癌細(xì)胞LOVO的VEGF-C蛋白和mRNA的表達(dá)水平，增強(qiáng)正常人淋巴管內(nèi)皮HLEC 細(xì)胞的活性，提示其抗癌作用可能與淋巴管生成有一定關(guān)系。但關(guān)于黃芪多糖抗血管新生和淋巴管新生的進(jìn)一步機(jī)制研究文獻(xiàn)報(bào)道尚不多，其作用機(jī)制待進(jìn)一步深入研究。

3 增效減毒作用

黃芪多糖增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性，張明明等[44]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖通過(guò)調(diào)控耐藥相關(guān)基因MDR1、xIAP 等的表達(dá)提高人胃癌細(xì)胞SGC7901對(duì)洛鉑的敏感性。翟秋麗等[45-46]研究表明黃芪多糖通過(guò)調(diào)控自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ、P62 增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞SKOV3 的自噬活性，從而增加SKVO3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性；又可聯(lián)合順鉑協(xié)同增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞siha通過(guò)線粒體途徑發(fā)生的凋亡。

骨髓抑制和胃腸道反應(yīng)是常見(jiàn)的化療的毒副反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的身體機(jī)能、生活質(zhì)量。石岳堅(jiān)等[45]觀察彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者使用RCHOP 化療方案聯(lián)合注射用黃芪多糖的療效，與單獨(dú)化療的對(duì)照組相比，治療組因化療所致的不良反應(yīng)、心臟毒性、免疫抑制、KPS評(píng)分等明顯改善。崔偉等[48]通過(guò)觀察僅接受新輔助化療TP方案和接受黃芪多糖聯(lián)合新輔助化療TP方案治療宮頸癌患者的近期療效、生活質(zhì)量、免疫功能和不良反應(yīng)等指標(biāo)，結(jié)果顯示黃芪多糖除可改善療效、生活質(zhì)量，減輕不良反應(yīng)，還能降低外周血中免疫抑制細(xì)胞Tregs和MDSC的比例，說(shuō)明黃芪多糖能緩解化療所致的不良反應(yīng)，增強(qiáng)患者免疫功能，改善生活質(zhì)量，使患者的化療耐受性提高，具有減毒增效的作用。此外，張明明等[49]觀察發(fā)現(xiàn)胃癌患者術(shù)后化療應(yīng)用黃芪多糖后，其IL-6、CRP、PCT、IL-10 水平及白細(xì)胞水平得到改善，炎癥反應(yīng)得到減輕，可有效緩解患者的易感狀態(tài)，對(duì)后期康復(fù)起到積極的作用。

4 小結(jié)與展望

黃芪多糖在調(diào)節(jié)腫瘤免疫方面能促進(jìn)固有免疫、適應(yīng)性免疫間接殺傷腫瘤，逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用；又可通過(guò)多種途徑直接抗腫瘤細(xì)胞；與其他化療藥物聯(lián)合使用，能增強(qiáng)療效又能減輕其毒副作用，促進(jìn)患者預(yù)后康復(fù)。黃芪多糖作為天然植物的提取物，具有生物安全性良好、靶點(diǎn)多、作用范圍廣泛的特點(diǎn)，在新技術(shù)聯(lián)合[18]、創(chuàng)新劑型[50]等方面的應(yīng)用中顯示出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和巨大的潛力。然而，其結(jié)構(gòu)分析方面的研究，相較于藥理作用方面，略顯不足。對(duì)化學(xué)結(jié)構(gòu)充分分析，明確構(gòu)效關(guān)系，將有利于其在抗腫瘤研究的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用。