基質(zhì)金屬蛋白酶-9對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳的影響

湯云飛，蘇晨，高學(xué)軍，崔英俊

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

0 引 言

基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein 9，MMP9）是一種鋅依賴性酶[1]，是MMP蛋白家族的成員。MMP家族在組織重塑，器官發(fā)育[2]，癌細(xì)胞增殖及遷移[3-4]，降解細(xì)胞外基質(zhì)[5]、控制細(xì)胞生長(zhǎng)[6]、炎癥或血管生成[7]等生理過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。正常乳腺發(fā)育的不同階段需要細(xì)胞外基質(zhì)精細(xì)控制的降解和重塑，MMP9被認(rèn)為是其中的關(guān)鍵酶[8]。MMP9在影響乳腺結(jié)構(gòu)的同時(shí)，對(duì)乳腺泌乳是否有影響還未見報(bào)道。

本研究利用MMP9過表達(dá)載體或干擾片段轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞，然后分別檢測(cè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的β-酪蛋白表達(dá)、乳脂含量，以及細(xì)胞增殖情況。旨在通過本實(shí)驗(yàn)確認(rèn)MMP9是否影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)室保存的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，MMP9過表達(dá)質(zhì)粒（p-31質(zhì)粒，博仕公司），MMP9干擾片段（蘇州吉瑪），甘油三酯試劑盒（普利萊e1013），MTT試劑盒（碧云天c0009），Lipofectamine 2000（Invitrogen），組織RNA微量提取試劑盒（美吉，R 4114-02），TB Green試劑盒（Takara，rr820a），Abi7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Applied Biosystems），DU 640紫外分光光度計(jì)（Beckman）。

1.2 研究方法

1.2.1 轉(zhuǎn)染

將奶牛乳腺上皮細(xì)胞傳至6孔板。過表達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、過表達(dá)陰性對(duì)照組（加pcDNA3.1空質(zhì)粒）、MMP9過表達(dá)組（加MMP9過表達(dá)載體）三組；抑制實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、抑制陰性對(duì)照組（加入干擾片段陰性對(duì)照）、MMP9抑制組（加MMP9干擾片段）三組。在細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右時(shí)按照以上分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后收集各組樣品。

1.2.2 熒光定量PCR

用RNA提取試劑盒提取mRNA后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。按照TB Green試劑盒說(shuō)明書在冰盒上配制20 uL體系反應(yīng)液，使用兩步法進(jìn)行熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qPCR）。MMP9引物（5’-3’GGTGCTGGCTTGCTGCTCTG，TTGGTGAGGTTGGTTCGTGGTTC）、β-酪蛋白引物（5’-3’ACCAGCCTCACCAGCCTCTTC，CCGGACAGGACCGAGTACAGG）引物、β-actin引物（5‘-3’TGTTAGCTGCGTTACACCCT，CTGTCACCTTC ACCGTTCC）（生工公司）。

1.2.3 甘油三酯檢測(cè)

按照甘油三酯試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將奶牛乳腺上皮細(xì)胞傳至96孔板，每孔加入1 000個(gè)細(xì)胞[9]。在各組分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，按照MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS21.0和GraphPad Prism7.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和作圖，結(jié)果以平均數(shù)（X）±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

2結(jié) 果

2.1 MMP9檢測(cè)及MMP9對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白表達(dá)的影響

MMP9過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞24 h后，qPCR結(jié)果表明，MMP9過表達(dá)組奶牛乳腺上皮細(xì)胞的MMP9 mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組和過表達(dá)陰性對(duì)照組（圖1）；MMP9抑制組奶牛乳腺上皮細(xì)胞的MMP9 mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組和抑制陰性對(duì)照組（圖2）。

圖1 MMP9過表達(dá)時(shí)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的MMP9 mRNA表達(dá)

qPCR結(jié)果還表明，MMP9過表達(dá)組奶牛乳腺上皮細(xì)胞的β-酪蛋白mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組和過表達(dá)陰性對(duì)照組（圖3）；MMP9抑制組奶牛乳腺上皮細(xì)胞的β-酪蛋白mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組和抑制陰性對(duì)照組（圖4）。

圖2 MMP9抑制時(shí)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的MMP9 mRNA表達(dá)

圖3 MMP9過表達(dá)時(shí)奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白的mRNA表達(dá)

圖4 MMP9抑制時(shí)奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白的mRNA表達(dá)

2.2 MMP9對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂含量的影響

甘油三酯檢測(cè)結(jié)果表明，MMP9過表達(dá)組奶牛乳腺上皮細(xì)胞的甘油三酯含量顯著高于對(duì)照組和過表達(dá)陰性對(duì)照組（圖5）；MMP9抑制組奶牛乳腺上皮細(xì)胞的甘油三酯含量顯著低于對(duì)照組和抑制陰性對(duì)照組（圖6）。

圖5 MMP9過表達(dá)時(shí)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的乳脂含量

圖6 MMP9抑制時(shí)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的乳脂含量

圖7 MMP9過表達(dá)時(shí)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞增殖

圖8 MMP9抑制時(shí)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞增殖

2.3 MMP9對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，在各檢測(cè)時(shí)點(diǎn)，MMP9過表達(dá)組奶牛乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞增殖均顯著高于對(duì)照組和過表達(dá)陰性對(duì)照組（圖7）；在各檢測(cè)時(shí)點(diǎn)，MMP9抑制組奶牛乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞增殖均顯著低于對(duì)照組和抑制陰性對(duì)照組（圖8）。

3討 論

MMP家族成員都是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白[10]。MMP9廣泛合成和分泌于不同細(xì)胞，是一種多功能蛋白，在乳腺中有較高表達(dá)[2]。以往對(duì)乳腺中MMP9的研究表明它與乳腺發(fā)育中的結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，但近年在奶山羊乳腺上皮細(xì)胞及MCF-7細(xì)胞中的研究表明，當(dāng)MMP9活性受到抑制時(shí)會(huì)影響B(tài)cl-2表達(dá)，從而促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞凋亡，抑制乳腺上皮細(xì)胞增殖[11-12]。本研究也發(fā)現(xiàn)MMP9與細(xì)胞存活有關(guān)，能促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖，但這一過程涉及到的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

哺乳動(dòng)物的泌乳速率取決于乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量和活性。在大鼠泌乳高峰中，75%泌乳的提升來(lái)自于新增殖的乳腺上皮細(xì)胞[13]。本研究對(duì)MMP9過表達(dá)或表達(dá)受抑制時(shí)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MMP9能提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白表達(dá)和甘油三酯含量，表明MMP9能促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳。推測(cè)這與MMP9能促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖，提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量和活性有關(guān)。