組蛋白H3甲基化修飾與精子發(fā)生的研究進展

王龍達 羅啟睿 趙樹華

（1 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖遺傳科，云南 昆明 650031；2 云南大學(xué)附屬中學(xué)呈貢校區(qū)，云南 昆明 650500）

1 前言

哺乳精子發(fā)生是一個復(fù)雜獨特的過程。以小鼠為例，精原干細胞（spermatogonial stem cells，SSC）分化為精原細胞前體（progenitor spermatogonia），隨后經(jīng)A型精原細胞（spermatogonia）、B型精原細胞進入減數(shù)分裂，減數(shù)分裂Ⅰ期包括四個階段初級精母細胞（spermatocyte）：細線期（leptotene）、偶線期（zygotene）、粗線期（pachytene）和雙線期（diplotene），然后第二次減數(shù)分裂分裂為4個圓形精子細胞（round spermatid），經(jīng)形態(tài)和染色體巨變特化為精子[1]。在這一復(fù)雜的過程中，每個階段都涉及大量的特異基因表達和關(guān)閉，這些基因的調(diào)控廣泛依賴于表觀遺傳。越來越多的證據(jù)表明，組蛋白修飾與男性不育相關(guān)，組蛋白修飾異常影響正常精子發(fā)生[2]。

組蛋白修飾是重要的表觀遺傳修飾機制，包括組蛋白甲基化（methylation，me）、乙?；╝cetylation，ac）、磷酸化（phosphorylation）、泛素化（ubiquitination）等，參與了基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等眾多調(diào)控過程[2]。蛋白甲基化存在于賴氨酸（Lysine，K）和精氨酸（Arginine，R）殘基，分別通過賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶（protein lysine methyltransferases，PKMTs）或精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶（protein arginine methyltransferases，PRMTs）將甲基從供體Ado-Met轉(zhuǎn)移到蛋白殘疾上[2]。組蛋白甲基化是研究最多的翻譯后修飾，不同位點的甲基化代表了不同的染色質(zhì)狀態(tài)，在精子發(fā)生的多個階段發(fā)揮重要作用[2]。H3是甲基化修飾最普遍、研究最多的組蛋白。為更好的理解精子發(fā)生過程，本文擬綜述H3組蛋白各甲基化位點在睪丸中的分布及功能。

2 結(jié)果

2.1 精子H3組蛋白修飾與不育：精子發(fā)生過程中，單倍體的精子細胞染色質(zhì)經(jīng)歷劇烈變化，90%～95%核小體組蛋白先被轉(zhuǎn)換蛋白替換（transition protein，Tnp），然后被魚精蛋白替換（protamine，Prm）[2]。魚精蛋白使染色質(zhì)形成緊密的結(jié)構(gòu)，防止DNA損傷和突變[2]。殘留組蛋白也具有重要功能，殘留比例與男性不育相關(guān)。有研究表明，精子H3組蛋白27位賴氨酸殘基三甲基化（H3K27me3）與公牛生育力相關(guān)[3]。此外，通過染色質(zhì)免疫共沉淀-基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)高生育力水牛和低生育力水牛精子中有很多基因的H3K4me2和H3K27me3存在顯著性差異[4]。另外，在精子中殘留的組蛋白有一重要作用是通過H3K4me3（激活標記）和H3K27me3（抑制標記）使在胚胎早期發(fā)育中起重要作用的基因維持“二價”狀態(tài)，以在受精后順利激活表達，促進胚胎發(fā)育[2]。

2.2 H3K27甲基化修飾在精子發(fā) 生中的作用：H3K27甲基化是抑制性組蛋白修飾，在各級生精細胞中均有分布，主要通過Polycomb抑制復(fù)合體2（Polycomb repessive complex 2，PRC2）催化完成[5]。PRC2包括4個主要組分：EZH1/2、EED、SUZ12、和RBBP4/7[6]。在生精細胞中特異敲除PRC2核心基因Eed和Suz12都導(dǎo)致小鼠不育，表型相似，表現(xiàn)為睪丸體積顯著減小，組織切片顯示精母細胞數(shù)量大幅下降，且多數(shù)細胞核不規(guī)則，粗線后精母細胞和圓精子完全缺失[7]。PRC2另一個核心組分EZH1和EZH2的同時敲除，也導(dǎo)致H3K27me3下降和減數(shù)分裂阻滯[8]。精子發(fā)生的早期，從精原干細胞分化到減數(shù)分裂起始，需要開啟一組基因轉(zhuǎn)錄。如Stra8在這一有絲分裂到減數(shù)分裂轉(zhuǎn)換過程中起著至關(guān)重要的作用[9]。組蛋白修飾參與Stra8的表達調(diào)控，Stra8啟動子的H3K27me3修飾在精原干細胞分化和減數(shù)分裂起始階段降低，隨著減數(shù)分裂的進行，在精母細胞中H3K27me3又上升，Stra8表達下降[7]。在小鼠中的研究結(jié)果表明，H3K27甲基化參與了精原干細胞維持，減數(shù)分裂前期轉(zhuǎn)換，減數(shù)分裂染色體配對、聯(lián)會和交叉等過程[7-8]。

2.3 H3K4甲基化修飾在精子發(fā)生中的作用：H3K4的二甲基化（H3K4me2）和三甲基化（H3K4me3）是基因激活的標記，由不同的甲基化酶和去甲基化酶調(diào)控[10]。H3K4me3主要分布在減數(shù)分裂起始階段的B型精原細胞、細線期和偶線期精母細胞，以及精子形態(tài)發(fā)生階段的圓形和長形精子細胞中[10]。KMT2在生精細胞中表達，催化H3K4me2。敲除Kmt2的小鼠不育，生精細胞漸進性缺失[10]。H3K4me2在精原干細胞維持中具有重要功能。PRDM9催化H3K4me2三甲基化，敲除Prdm9導(dǎo)致H3K4me3降低，減數(shù)分裂阻滯，雄鼠不育[11]。進一步研究發(fā)現(xiàn)H3K4me3參與調(diào)控染色體同源配對和性小體（sex body）生成[11]。此外，H3K4me3還參與組蛋白-魚精蛋白替換，PYGO2蛋白識別H3K4me3并特異定位于長形精細胞核中[12]。小鼠中，Pygo2敲除影響轉(zhuǎn)換蛋白（Tnp）和魚精蛋白（Prm）表達，導(dǎo)致細胞核凝集異常，進而導(dǎo)致不育。PYGO2通過識別H3K4me3促進H3乙?；M而促進組蛋白-魚精蛋白替換[12]。此外蛋白PHF7蛋白也可以識別H3K4me2/3，催化H2A泛素化促進組蛋白-魚精蛋白替換[13]。以上結(jié)果說明，H3K4甲基化主要參與了精原干細胞維持/分化，減少分裂，組蛋白-魚精蛋白替換等重要的精子發(fā)生過程。

2.4 H3K9甲基化修飾在精子發(fā)生中的作用：H3K9三甲基化（H3K9me3）是抑制性組蛋白修飾，多發(fā)生于異染色質(zhì)區(qū)域。H3K9me3主要分布在所有生精細胞中具有分布[14]。SUV39H1和SUV39H2在中心粒外周異染色質(zhì)區(qū)域催化H3K9三甲基。Suv39h1廣泛表達，而Suv39h2在睪丸特異表達。同時敲除這兩個基因，導(dǎo)致異染色質(zhì)松散，進而同源染色體無法配對，減少分裂異常，雄鼠不育[11]。SETDB1是另一個催化H3K9三甲基化的酶，該酶缺失導(dǎo)致精原干細胞凋亡。SETDB1通過調(diào)控PTEN/AKT/FOXO1通路抑制維持精原干細胞。SETDB1可以與AKT結(jié)合，并調(diào)控 Bim 和Pten基因H3K9me3抑制它們的表達，進而抑制細胞凋亡[14]。JHDM2A是一個H3K9me2/1特異的去甲基化酶，小鼠中Jhdm2a基因的缺失，導(dǎo)致精細胞染色質(zhì)凝集異常，從而導(dǎo)致不育。JHDM2A直接與轉(zhuǎn)換蛋白（Tnp1）和魚精蛋白（Prm1）啟動子的H3K9甲基化結(jié)合并調(diào)控基因表達，從而調(diào)節(jié)組蛋白-魚精蛋白替換[12]。此外，H3K9甲基化在精子發(fā)生過程中的逆轉(zhuǎn)座子抑制中具有重要功能，以維持精子DNA完整性[15]。綜上所述，H3K9甲基化主要參與經(jīng)原干細胞維持、減數(shù)分裂及組蛋白-魚精蛋白替換。

2.5 H3K36在精子發(fā)生中的作用：H3K36三甲基化（H3K36me3）主要在基因上富集，是激活性修飾，主要分布在精母細胞和圓形精子細胞中[16]。SETD2也稱為HYPB和KMT3A是H3K36me3的主要甲基化酶，主要在小鼠睪丸的粗線期精母細胞和圓形精子細胞中表達[16]。SETD2介導(dǎo)的H3K36me3是一個與轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)的組蛋白修飾標志，在轉(zhuǎn)錄激活的基因上富集。敲除Setd2導(dǎo)致粗線期精母細胞和圓形精細胞中H3K36me3完全消失，精子發(fā)生停滯在圓形精子階段，頂體發(fā)生異常[16]。SETD2缺失影響精子形態(tài)發(fā)生相關(guān)蛋白的表達包括頂體結(jié)合蛋白1（ACRBP1）、轉(zhuǎn)換蛋白、魚精蛋白等，進而影響組蛋白-魚精蛋白替換[14]。因此，H3k36me3主要在減數(shù)分裂后精細胞中起作用，參與精子形態(tài)發(fā)生和組蛋白-魚精蛋白替換。

2.6 H3K79甲基化修飾在精子發(fā)生中的作用：H3K79的甲基化較為特異，只存在于長形精子細胞中，主要由甲基化酶DOT1L介導(dǎo)[12,17]。在果蠅中，Dot1l同源基因Grappa通過H3K79me直接參與組蛋白-魚精蛋白替換。與果蠅中相似，小鼠Dot1l基因主要在減數(shù)分裂后在精細胞中表達，在染色質(zhì)重組過程中，H3K79me3伴隨著組蛋白H4的高乙?；?，H4的高乙酰化使染色質(zhì)呈現(xiàn)松散狀態(tài)，有利于組蛋白被替換蛋白替換，從而促進組蛋白-魚精蛋白替換[12,17]。小鼠和人精子細胞H3K79me2/3主要發(fā)生在組蛋白替換期，在大鼠中，H3K79直接介導(dǎo)替換蛋白定位與染色質(zhì)[12,17]。因此，H3K79甲基化是組蛋白-魚精蛋白替換所必需的。

3 展 望

本文簡要介紹了H3組蛋白賴氨酸位點的甲基化修飾在生精細胞中的分布和主要功能。不同的甲基化修飾呈現(xiàn)不同的生精細胞分布模式，行使不同的生物學(xué)功能，參與了生精過程的各個階段。然而，現(xiàn)有組蛋白修飾功能證據(jù)主要來自于對甲基化酶的功能研究。甲基化酶的功能可以反映對應(yīng)組蛋白修飾的作用，但是由于甲基化酶和組蛋白修飾不是一一對應(yīng)的，因此，要明確組蛋白甲基化的具體功能，還需更直接的證據(jù)。未來隨著技術(shù)的發(fā)展，利用高通量單細胞組蛋白修飾檢測技術(shù)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組及其他單細胞表觀遺傳組學(xué)分析，將可能為破解精子發(fā)生過程中的組蛋白修飾“密碼”提供更充分的證據(jù)。另外，環(huán)境是影響生精功能的重要因素，比如吸煙、酗酒等。組蛋白修飾是這些因素的潛在作用靶點，但是具體作用機制也有待于深入研究?？傊沂窘M蛋白修飾在精子發(fā)生中的作用和機制，有助于理解男性不育治病機制，提供潛在治療靶點及理論支撐。